應(yīng)天昊, 余濤, 趙佳寧, 孫萌萌, 祝璇, 李曉麗, 唐一迪, 張雷明

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264005)

膿毒癥是由潛在或已知感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)失衡、神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)異常、免疫功能障礙和多器官衰竭等多個(gè)方面[1]。世界衛(wèi)生組織將膿毒癥確認(rèn)為全球衛(wèi)生優(yōu)先事項(xiàng)，病死率高達(dá)30%以上[2-3]。在2019年底爆發(fā)的新型冠狀病毒感染中，后期危重患者多并發(fā)膿毒癥，進(jìn)而危及生命[4]。研究表明，中醫(yī)藥治療膿毒癥具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能增加療效、降低不良反應(yīng)、改善預(yù)后等[5]。

雖然傳統(tǒng)中醫(yī)理論體系中無(wú)“膿毒癥”病名記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)和演變過(guò)程，可從《傷寒論》《溫?zé)嵴摗分邪l(fā)現(xiàn)相似癥狀的記載，故將其歸于“熱病” “溫毒” “厥證” “脫證”等范疇[6]。參附注射液來(lái)源于參附方，主要成分為人參和附子，具有回陽(yáng)救逆和益氣固脫的功效[7]，主治厥脫及陽(yáng)虛諸證[8]，同時(shí)也得到了診療方案《中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南》[9]的推薦，被廣泛用于膿毒癥的治療[10-12]。然而，尚不清楚參附注射液是通過(guò)哪種作用機(jī)制改善膿毒癥，且目前并沒(méi)有具體作用機(jī)制研究。因此本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，以參附注射液中的活性成分為研究對(duì)象，通過(guò)靶點(diǎn)、通路篩選以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探索參附注射液治療膿毒癥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 參附注射液活性成分和靶點(diǎn)獲取

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取參附注射液中人參和附子2種中藥的所有成分，按ADME參數(shù)[13]即類藥性(drug- likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%來(lái)篩選化合物，共得到34個(gè)活性成分。下載Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中活性成分的SDF結(jié)構(gòu)文件，在Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中檢索靶點(diǎn)，按Probability>0篩選后即得到活性成分作用靶點(diǎn)。通過(guò)Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換得到靶點(diǎn)的Gene Symbol。

1.2 潛在靶點(diǎn)獲取

在Genecards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)和OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵詞“sepsis”，整合后得到膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)并與參附注射液活性成分靶點(diǎn)取交集，獲得參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

在STRING(https://string-db.org/)平臺(tái)中上傳1.2項(xiàng)中獲得的參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)，物種選項(xiàng)為“智人”，下載結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用( protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)內(nèi)置分析功能分析參數(shù)。

1.4 GO分析與KEGG通路分析

提交潛在靶點(diǎn)到Metascape(http://metascape.org/gp/)數(shù)據(jù)庫(kù)，Input as species和Analysis as species都設(shè)置為homo sapiens，進(jìn)行基因本體( gene ontology， GO)分析和基于京都基因與基因組百科全書(shū) ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析(P<0.05)，探究參附注射液治療膿毒癥的可能作用機(jī)制。

1.5 構(gòu)建參附注射液活性成分-膿毒癥靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)

創(chuàng)建成分-靶點(diǎn)-通路的Network和Type文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并分析。

1.6 分子對(duì)接

通過(guò)Open Babel 2.3.2軟件將所選化合物的SDF結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得受體蛋白PDBID，采用AutoDockTools軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行修飾，用Grid程序下的Grid Option工具對(duì)受體蛋白進(jìn)行處理，并轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。利用AutoDock Vina 1.1.2對(duì)受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能打分，這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)，能值越低，二者的結(jié)合效果越好。

1.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 動(dòng)物

BALB/c小鼠(8～10周)，雄性，質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司，合格證號(hào)SCXK(魯)20190003。造模前在煙臺(tái)大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房正常飼養(yǎng)，室溫在(22±1)℃，相對(duì)濕度為40%～60%，自由飲水?dāng)z食。

1.7.2 藥物

參附注射液為華潤(rùn)三九(雅安)藥業(yè)有限公司藥品，10 mL/支，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664。

1.7.3 試劑與儀器

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：L2630-25MG)；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：SEKM-0034、SEKM-0007)。ERK1/2、p-ERK1/2抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：AF1051、AF1891)；GAPDH抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：60004-1-lg)。

高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：5424R)；電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：PowerPacTMHC)；超純水儀 Milli-Q (美國(guó)Millipore 公司，型號(hào)：IQ7000)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司，型號(hào)：SpectraMax iD3); ECL凝膠成像儀(美國(guó)GE公司，型號(hào)：ImageQuant 300/400/RT ECL)。

1.7.4 分組與模型制備

BALB/c小鼠24只，隨機(jī)分成3組：空白組、模型組、參附注射液組(20 mL/kg)，每組8只。除空白組外，其他各組于給藥30 min后尾靜脈注射LPS(10 mg/kg)，造成小鼠膿毒癥模型。

1.7.5 給藥方法

參附注射液組(20 mL/kg)腹腔注射給藥預(yù)保護(hù)30 min，空白組和模型組給予相同體積生理鹽水。

1.7.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.7.6.1 炎癥因子檢測(cè)

造模后12 h后，在小鼠眼內(nèi)呲取血，室溫靜置0.5 h，4 °C，3500 r/min離心15 min，離心半徑5 cm，分離血清，采用ELISA法測(cè)定血清中TNF-α和IL-6含量。

1.7.6.2 Western blot法驗(yàn)證靶點(diǎn)表達(dá)

1.7.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 參附注射液活性成分和靶點(diǎn)獲取

通過(guò)TCMSP和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)收集到參附注射液中的活性成分共34個(gè)，其中人參19個(gè)，附子15個(gè)，共得到682個(gè)活性成分靶點(diǎn)。

2.2 潛在靶點(diǎn)獲取

通過(guò)GeneCards、OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)得到膿毒癥靶點(diǎn)1422個(gè)。兩者取交集后獲得參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)137個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 參附注射液與膿毒癥靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of the targets of Shenfu Injection and sepsis

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有節(jié)點(diǎn)137個(gè)、邊1956條，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1，92)、白介素6(IL6，91)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，85)、腫瘤壞死因子(TNF，84)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA，84)度值(degree)較大，可能是關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of the potential targets

2.4 GO分析和KEGG通路分析

將參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)通過(guò)GO富集分析，根據(jù)P<0.05選擇生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能富集高的前10個(gè)進(jìn)行可視化并生成柱狀圖(圖3)。如圖3所示，生物過(guò)程主要涉及趨性、細(xì)胞遷移正調(diào)控和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)正調(diào)控；細(xì)胞組分主要涉及膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)等；分子功能主要涉及蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性和以羥基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等。

圖3 參附注射液治療膿毒癥靶點(diǎn)的GO富集分析(排名前10)Fig.3 GO enrichment analysis of Shenfu Injection in sepsis treatment (top 10)

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG 通路富集分析(P<0.05)，選取前20條通路，見(jiàn)圖4。如圖所示，這些潛在靶點(diǎn)主要富集在癌癥信號(hào)通路、前列腺癌、乙型肝炎、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、人類巨細(xì)胞病毒感染、MAPK信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗等信號(hào)通路。

圖4 參附注射液治療膿毒癥的KEGG通路分析(排名前20)Fig.4 KEGG enrichment analysis of Shenfu Injection in sepsis treatment (Top 20)

2.5 構(gòu)建參附注射液活性成分-膿毒癥靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)

由于潛在靶點(diǎn)較多，所以篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前30的靶點(diǎn)參與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。如圖5所示，度值較大的成分有人參皂苷-Rh4_qt、戈米辛 B、山奈酚、石防風(fēng)素、水黃皮次素、去氧穿心蓮內(nèi)酯、人參皂苷rh2、苯甲酰歐烏頭堿、吉九里香堿等，均與多個(gè)靶點(diǎn)連接。度值較大的靶點(diǎn)包括PIK3CA、AKT1、MAPK1、EGFR、MAPK3、MAPK8、PIK3R1、MAPK14、VEGFA等。度值較大的通路涉及了癌癥通路、PI3K-Akt、MAPK、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、Ras、Rap1和HIF-1等信號(hào)通路。

圖5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network of ingredients-targets-pathways

2.6 分子對(duì)接

將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前10位的靶點(diǎn)蛋白，分別與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中排名前5的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。由于膿毒癥的疾病特點(diǎn)，所以選取了IL-6、MAPK3、TNF、VEGFA、STAT3與影響炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)的靶蛋白，進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)合能越小，表明其結(jié)合性越好，其中MAPK3靶點(diǎn)與5種活性成分結(jié)合能力較好。結(jié)果表明，參附注射液中的活性成分能較好地與膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，潛在生物活性高。

圖6 活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)排名前5靶點(diǎn)的結(jié)合能熱圖Fig.6 Heat map of the compounds in Shenfu Injection radix with top five targets′ sequencing in a protein-protein interaction network

2.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1 參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組中 TNF-α和IL-6表達(dá)顯著升高(P<0.001)。與模型組相比，參附注射液(20 mL/kg)可顯著降低 TNF-α和IL-6表達(dá)(P<0.05、P<0.001)，見(jiàn)圖7。

注:與對(duì)照組相比，***P<0.001；與模型組相比，△P<0.05，△△△P<0.001。圖7 參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠血清中TNF-α和IL-6表達(dá)水平的影響Fig.7 Effects of Shenfu Injection on the expression levels of TNF-α and IL-6 in the serum of septic mice n=3)

2.7.2 參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠肝組織ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

MAPK3是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分，調(diào)控著ERK蛋白的表達(dá)，并且在構(gòu)建的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中度值較大且與活性成分結(jié)合能力較好。所以，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠中非磷酸化ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證(圖8)。結(jié)果顯示，與模型組相比，參附注射液治療能顯著提高非磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)(P<0.01)，降低p-ERK1/2蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

注:與對(duì)照組相比*P<0.05，***P<0.001;與模型組相比△△P<0.01。圖8 參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠肝組織中ERK1/2及 p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of Shenfu Injection on the LPS-induced protein expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 in the liver tissue of septic

3 討論

膿毒癥是臨床常見(jiàn)的一種危重癥疾病，死亡率較高。雖然抗炎藥物和免疫增強(qiáng)劑例如糖皮質(zhì)激素和胸腺肽α1等在臨床中應(yīng)用廣泛，但其不良反應(yīng)日漸突出[14]。近年來(lái)，隨著臨床研究的不斷開(kāi)展，中醫(yī)藥治療膿毒癥得到廣泛認(rèn)可。其中參附注射液因其回陽(yáng)救逆、扶正固脫的效果在膿毒癥的治療中被廣泛應(yīng)用[15]。但是，中藥因其復(fù)雜性使研究其作用機(jī)制存在一定的困難，所以本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)參附注射液抗膿毒癥的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，為后續(xù)治療和研究提供了新的思路。

本研究由多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到34個(gè)活性成分和682個(gè)藥物靶點(diǎn)，交集后得到137個(gè)抗膿毒癥的潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析參數(shù)篩選排名前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括IL6、MAPK3、TNF、VEGFA、STAT3等。IL-6和TNF-α都是主要的炎性細(xì)胞因子，影響膿毒癥炎癥反應(yīng)進(jìn)展，與膿毒癥的病死率有一定的相關(guān)性[16]。人參皂苷Rh4可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液中的IL-6和TNF-α的表達(dá)[17]。山奈酚可以通過(guò)抑制IL-6及TNF-α對(duì)D-Ga IN糖/LPS誘導(dǎo)的小鼠AHF發(fā)揮保護(hù)作用[18]。石防風(fēng)素通過(guò)抑制TNF-α在 CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝毒性實(shí)驗(yàn)中具有潛在的保肝作用[19]。MAPK3通過(guò)MAPK通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，還可以影響TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等炎癥因子的表達(dá)等[20]。山奈酚可以顯著減弱對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的血清TNF-α和IL-6產(chǎn)生，下調(diào)JNK 和 ERK磷酸化從而治療急性肝損傷[21]。VEGFA在血管內(nèi)皮的完整性中起著不可或缺的作用[22]，被證明可誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和ICAM-1的表達(dá)，并由于在膿毒癥過(guò)程中的表達(dá)增加而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和毛細(xì)血管滲漏[23]。在患有膿毒癥的成人中，過(guò)表達(dá)的VEGFA通過(guò)與酪氨酸蛋白激酶受體1(tyrosine-protein kinase receptor-1，F(xiàn)LT-1)結(jié)合，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的構(gòu)型而增加了血管通透性。因此，血管內(nèi)皮易受損，最終導(dǎo)致器官功能障礙[24]。山奈酚增強(qiáng)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，以及斑馬魚(yú)胚胎中腸下血管的發(fā)芽和大鼠主動(dòng)脈環(huán)中微血管的形成，從而保護(hù)血管內(nèi)皮[25]。STAT3是膿毒癥所致功能障礙的關(guān)鍵調(diào)控基因之一[26]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在膿毒癥中異常表達(dá)，不僅可以直接調(diào)控促炎和抑炎因子的表達(dá)，還可作用于炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路的其他關(guān)鍵分子來(lái)間接調(diào)控膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[27]。山奈酚通過(guò)靶向STAT3和NF-κB減輕角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠爪水腫模型[28]。

GO分析表明參附注射液中活性成分可能通過(guò)膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、胞膜窖、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物等細(xì)胞組分參與細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控、細(xì)胞成分遷移的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，發(fā)揮蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、以羥基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、生長(zhǎng)因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等分子功能。說(shuō)明參附注射液可能作用于多細(xì)胞組分產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能，進(jìn)而發(fā)揮抗膿毒癥的作用。

KEGG富集分析表明參附注射液抗膿毒癥的潛在靶點(diǎn)主要參與 PI3K-Akt[29]、MAPK[30]、Ras[31]、Rap1[32]和HIF-1[33]等信號(hào)通路，這些通路與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，說(shuō)明富集分析的通路具有較高的可信度。

通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明了參附注射液可以有效抑制膿毒癥小鼠中TNF-α和IL-6的釋放。同時(shí)，Western blot結(jié)果說(shuō)明參附注射液可以提高非磷酸化ERK蛋白的表達(dá)，降低p-ERK蛋白的表達(dá)，從而部分調(diào)控MAPK通路，發(fā)揮抗膿毒癥作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析參附注射液抗膿毒癥的活性成分、潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了參附注射液通過(guò)多種方式發(fā)揮作用。之后通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證了關(guān)鍵成分與相關(guān)靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，最后通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了參附注射液的藥效和調(diào)控機(jī)制，為參附注射液治療膿毒癥的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。