雍嘉欣， 韋權峰， 劉尚輝

1.中國醫(yī)科大學第二臨床學院，沈陽110122；2.中國醫(yī)科大學第一臨床學院，沈陽110122；3.中國醫(yī)科大學智能醫(yī)學學院，沈陽110122

胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導致患者死亡的第四大病因[1]。GC的發(fā)病機制復雜，且缺乏特異性的預后生物標志物。因此，闡明GC 的分子機制并探尋新的治療靶點和可能的潛在預后標記物具有重要意義。

長鏈非編碼 RNA（long-nocoding RNA，lncRNA）是RNA聚合酶Ⅱ從獨立啟動子轉(zhuǎn)錄的長度大于200 個核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄本。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 可發(fā)揮對microRNA（miRNA）的海綿吸附作用，作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）競爭性結(jié)合miRNA，影響miRNA 與mRNA 的結(jié)合，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移[2]。LncRNA-miRNA-mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡在癌癥中廣泛存在，影響腫瘤相關基因的表達，發(fā)揮重要的生物學作用[3]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的LncRNA 被發(fā)現(xiàn)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關[4-7]。此外，lncRNA 具有分布范圍廣、保守性高、組織表達特異性高等特點。因此，篩選出胃癌中差異表達的lncRNA，對疾病診斷、預后等具有重要作用。

TCGA（the Cancer Genome Atlas）數(shù) 據(jù) 庫（https://cancergenome.nih.gov/）是由美國國家人類基因研究所組織建立的癌癥基因組數(shù)據(jù)庫，其包括病例臨床、基因突變、mRNA表達、miRNA表達、甲基化等數(shù)據(jù)，是癌癥研究重要的數(shù)據(jù)來源。GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一個國際公共數(shù)據(jù)庫，收錄了世界各國研究機構提交的高通量基因表達數(shù)據(jù)，包括測序以及其他形式的高通量功能基因組數(shù)據(jù)。本研究利用TGCA 和GEO 數(shù)據(jù)庫，篩選胃癌中差異表達的lncRNA，構建lncRNAs介導的ceRNA 網(wǎng)絡，預測其核心基因可能涉及的信號通路和生物學功能，旨在為發(fā)現(xiàn)胃癌新的潛在預后相關標志物和治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

在 GEO 數(shù) 據(jù) 庫 中 ，以“gastric cancer”和“l(fā)ncRNA”為檢索詞，檢索數(shù)據(jù)庫中與胃癌相關的lncRNA 芯片，選擇物種為“homo sapiens”，研究類型為“expression profiling by array”，通過篩選得到結(jié)果。篩選標準為樣本數(shù)≥5 且均有病例和對照組織的芯片數(shù)據(jù)集。最終，共下載4 套胃癌的lncRNA 芯片：GSE50710（10 對胃癌組織-正常組織）、GSE51308（5 對胃癌組織-正常組織）、GSE84787（10對胃癌組織-正常組織）、GSE109476（5 對胃癌組織-正常組織）。從TGCA 數(shù)據(jù)庫中獲取胃癌的RNA-seq 數(shù)據(jù)，共375 例胃癌組織與32例癌旁組織納入研究。

1.2 差異lncRNA 分析與預后lncRNA 篩選及預后生存曲線繪制

使用 R 軟件（Version 3.6.3）的 limma 包對TCGA、GEO 數(shù)據(jù)庫中下載的數(shù)據(jù)進行差異分析，篩選差異表達的lncRNA。lncRNA 篩選標準為：|log2FC|＞1，F(xiàn)DR＜0.05。同時，在 TCGA 數(shù)據(jù)庫中，下載胃癌患者的病例信息并提取生存數(shù)據(jù)。利用survival、survminer、Cairo 包對差異表達的 lncRNA進行Kaplan-Meier法、單因素COX 回歸分析，篩選出 coxP＜0.05，且 Kaplan-MeieP＜0.05 的 lncRNA并繪制生存曲線。

1.3 ceRNA網(wǎng)絡構建

為減少由于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中樣本差異對結(jié)果的影響，本研究在兩個數(shù)據(jù)庫中獲取至少出現(xiàn)3次以上的lncRNA，進行后續(xù)ceRNA網(wǎng)絡構建。在miRcode數(shù)據(jù)庫（http://www.mircode.org）對篩選后的lncRNA 進行l(wèi)ncRNA-miRNA 配對。再分別在miRDB、miRTarBase、TargetScan 3個miRNA基因預測數(shù)據(jù)庫中同時進行mRNA預測。最后，將上述已經(jīng)匹配完成的lncRNA-miRNA配對和miRNA-mRNA配對導入 Cytoscape（Version 3.7.2）軟件，構建基于ceRNA 機制的lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡。

1.4 STRING數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)互作分析

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）構建ceRNA 網(wǎng)絡中核心基因的蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，以進一步發(fā)現(xiàn)ceRNA網(wǎng)絡的功能。

1.5 GO/KEGG富集分析

為進一步預測ceRNA 網(wǎng)絡中mRNA 可能涉及的信號通路和生物學功能，本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫在線工具對ceRNA 中的mRNA 進行功能富集分析。同時使用KOBAS 數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，并根據(jù)P＜0.05 對分析結(jié)果進行匯總，最終以氣泡圖和圈圖的方式可視化富集分析結(jié)果，具體技術路線見圖1。

圖1 技術路線圖Fig.1 Technical route of this research

2 結(jié)果與分析

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌差異表達的lncRNA 篩選與預后分析

從375例癌組織以及32例癌旁組織的lncRNA表達數(shù)據(jù)中，按照篩選標準——FDR＜0.05且倍數(shù)變化絕對值＞2，共篩選出3 022個差異的lncRNA，其中上調(diào)2 362個，下調(diào)660個（表1）。從TCGA數(shù)據(jù)庫中，篩選coxP＜0.05，且Kaplan-MeierP＜0.05的lncRNA并繪制生存曲線。最終共篩選出4 個lncRNA（AC011352.1、AC087636.1、AC093627.1、GAS1RR）與預后相關性具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中上調(diào)與下調(diào)的lncRNA(Top10)Table 1 Up-regulated and down-regulated lncRNAs in TCGA database(Top10)

圖2 lncRNA生存曲線圖Fig.2 Survival curve of lncRNAs

2.2 GEO數(shù)據(jù)庫中胃癌差異表達的lncRNA

在GEO 數(shù)據(jù)庫中，共下載了4 套胃癌的lncRNA 表達芯片，分別為GSE50710（10對胃癌組織-正常組織）、GSE51308（5 對胃癌組織-正常組織）、GSE84787（10 對胃癌組織-正常組織）、GSE109476（5 對胃癌組織-正常組織）。對其lncRNA 表達數(shù)據(jù)進行差異分析，篩選標準為|log2FC|＞1，校正 后P＜0.05。得 到差 異表 達 的lncRNA 共 317 個 ，其 中 上 調(diào) 133 個 ，下 調(diào) 184個（圖3）。

圖3 GEO數(shù)據(jù)庫中差異表達lncRNA的火山圖Fig.3 The volcano map of the differentially expressed lncRNA in the GEO database

2.3 ceRNA網(wǎng)絡的構建

為降低GEO 數(shù)據(jù)庫中4 個數(shù)據(jù)集和TCGA 數(shù)據(jù)庫由于納入的樣本不同對結(jié)果的影響，本研究選擇在差異lncRNA 篩選結(jié)果中至少出現(xiàn)3 次的lncRNA 進行后續(xù)的ceRNA 網(wǎng)絡構建，分別為HAGLROS、TMEM92-AS1、LINC01745、HOXC-AS3、SEMA3B-AS1、FEZF1-AS1。之后，采用高保守miRcode 數(shù)據(jù)庫，預測與 6 個 lncRNA 結(jié)合的 miRNA，并建立lncRNA-miRNA 關系對。再分別使用miRDB、miRTarBase 和 TargetScan 3 個數(shù)據(jù)庫進行mRNA 預測，得到miRNA-mRNA 關系對。用上述 已 經(jīng) 匹 配 完 成 的 lncRNA-miRNA 和miRNA-mRNA 基因?qū)隒ytoscape軟件，得到構建的ceRNA 網(wǎng)絡圖（圖4）。最后，本研究對ceRNA 網(wǎng)絡中的mRNA 在STRING 數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)互作分析（圖5）。

圖4 胃癌lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡圖Fig.4 Network diagram of lncRNA-miRNA-mRNA in GC

圖5 ceRNA網(wǎng)絡中核心蛋白質(zhì)互作分析Fig.5 Protein interaction analysis of ceRNA network

2.4 GO/KEGG富集分析

為進一步研究ceRNA 網(wǎng)絡中mRNA 可能參與的信號通路，本研究進行了GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析結(jié)果顯示，ceRNA可能參與的生物學過程包括細胞角質(zhì)化、角質(zhì)形成細胞分化等（P＜0.005）。細胞成分富集結(jié)果中最顯著的是作為細胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、跨膜轉(zhuǎn)運符合物等成分。而分子功能富集結(jié)果提示其可能與受體活性調(diào)節(jié)、配體活性以及蛋白質(zhì)水解相關（圖6）。由圖7可知，KEGG富集結(jié)果提示ceRNA網(wǎng)絡還可能參與cAMP、IL-17信號通路等（P＜0.05）。

圖6 ceRNA網(wǎng)絡中mRNA的GO分析圖Fig.6 GO analysis diagram of mRNA in the ceRNA network

圖7 ceRNA網(wǎng)絡中mRNA的KEGG分析圖Fig.7 KEGG analysis diagram of mRNA in the ceRNA network

3 討論

胃癌每年有超過一百萬的新發(fā)病例，局限性早期胃癌患者5 年總生存率超過60%，而患有局部和遠處轉(zhuǎn)移的胃癌患者5 年生存率分別急劇下降至30%和5%[8]。由于胃癌早期臨床癥狀具有隱匿性和非典型性，在診斷時超過60%的患者發(fā)生了局部或遠處轉(zhuǎn)移[8]。因此，探尋特異性的胃癌預后標記物，對提高胃癌治療和預后評估具有重要意義。

lncRNA 具有分布范圍廣、保守性高、組織表達特異性高等特點，可作為腫瘤良好的診斷和預后生物標志物[9-11]。最近有研究表明，在胃癌組織中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1的表達顯著增加，并與胃癌患者的預后不良有關[12]。lncRNA SNHG11 已被證實為早期檢測結(jié)腸癌的潛在生物標志物和結(jié)直腸癌的新治療靶點[13]。本研究通過單基因批量篩選出4個lncRNAs（AC011352.1、AC087636.1、AC093627.1、GAS1RR）與預后相關性具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可為發(fā)現(xiàn)新的胃癌預后標記物提供生物信息學依據(jù)。

表2 單因素COX回歸和Kaplan-Meie法聯(lián)合分析得到的潛在預后分子標記物Table 2 Potential prognostic molecular markers obtained by single factor COX regression and Kaplan-Meie analysis

有研究表明，F(xiàn)EZF1-AS1 在胃癌診斷中的敏感性和特異性分別達到了93.9%和77.9%，說明FEZF1-AS1 可能是胃癌的潛在生物標記物[14]。FEZF1-AS1 高表達患者的預后明顯低于FEZF1-AS1 低表達患者[15]。本研究結(jié)果表明，hsa-miR-17-5p、hsa-miR-375 和 hsa-miR-125a-5p 與胃癌密切相關。Song 等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p 在胃癌組織中高表達，后證實其通過靶向RUNX3，促進胃癌細胞的增殖和侵襲；Huang 等[17]發(fā)現(xiàn)miR-375 的啟動子甲基化和組蛋白去乙?；约癿iR-375的異位表達通過靶向YAP1、TEAD4和CTGF 在體外和體內(nèi)抑制腫瘤生長，因而在胃癌組織中表達下調(diào)；miR-125a-5p在多種人類癌癥中表達下調(diào)。表明FEZF-AS1 及其所預測的miRNA在胃癌的診斷和治療方面可作為潛在的靶點，進而表明構建ceRNA網(wǎng)絡價值較高。

綜上所述，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫篩選出差異表達的lncRNA 和與預后密切相關的lncRNA，可為發(fā)現(xiàn)胃癌新的預后生物標記物提供理論依據(jù)。此外，聯(lián)合GEO 數(shù)據(jù)庫最終選擇6 條lncRNAs（HAGLROS、TMEM92-AS1、LINC01745、HOXC-AS3、SEMA3B-AS1、FEZF1-AS1） 構 建ceRNA 網(wǎng)絡，并對 ceRNA 網(wǎng)絡中的 mRNA 進行蛋白質(zhì)互作和KEGG/GO功能富集分析，為深入研究lncRNA 影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制奠定了理論基礎。