廖敏， 楊洛， 王珍， 郝亞榮

武漢大學(xué)人民醫(yī)院老年病科，武漢430060

1972 年，Rubler 等[1]發(fā)現(xiàn)在 4 例糖尿病腎小球硬化癥患者中出現(xiàn)充血性心力衰竭和心臟肥大的癥狀，但是患者均無冠狀動脈及心臟瓣膜病、高血壓、先天性心臟病等病史，因此，首次提出糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）的概念。DCM 是指沒有罹患冠心病、高血壓和嚴(yán)重瓣膜疾病的糖尿病患者出現(xiàn)了心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常，其特征是心臟肥大、心肌細(xì)胞丟失和間質(zhì)纖維化。DCM 的發(fā)病機制涉及多種因素，如心肌細(xì)胞能量代謝異常（包括高血糖、高胰島素血癥和脂代謝紊亂等）、心肌炎癥和心肌纖維化等[2-3]。糖尿病性心肌纖維化可出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)蓄積、膠原蛋白異常沉積和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，可能通過引起心力衰竭和增加心律失常事件的發(fā)生而成為導(dǎo)致患者發(fā)病和死亡的主要原因[4]。因此，改善心肌纖維化可能是干預(yù)DCM的一個重要策略。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1, TGF-β1）在多種臟器和組織纖維化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原是心肌組織中含量最高的膠原類型，占膠原蛋白總量的95%[5]。Liu 等[6]發(fā)現(xiàn) TGF-β1 可顯著增加Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)。Ⅰ型和Ⅲ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，當(dāng)心肌膠原比例失衡時，心室壁僵硬度下降，舒張充盈改變，最終導(dǎo)致心衰，構(gòu)成了心肌纖維化的主要病理基礎(chǔ)[7]。松果菊苷（echinacoside,ECH）是從中藥管花肉蓯蓉中提取的苯乙醇苷類化合物，具有抗糖尿病、抗炎、抗衰老和保護神經(jīng)等藥理和生物活性[8-9]。研究報道ECH 可以改善心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷[10]，且能減輕心肌細(xì)胞凋亡[11]。但是目前對于ECH 在改善DCM 病理進程方面的相關(guān)研究和報道較少。db/db 小鼠是Leptin 受體（db）基因突變引起Leptin 受體活性降低所致的一種自發(fā)性肥胖性2 型糖尿病小鼠，具有明顯肥胖、高血糖等特性[12-13]，是研究DCM 的常用動物模型。本研究采用ECH 對db/db 小鼠實施灌胃處理，旨在探究ECH 對糖尿病心肌纖維化的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 BX63 型全自動光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；VINNO6VET超聲心動儀（蘇州飛依諾科技有限公司）；基因擴增儀（美國ABI 公司）；實時熒光定量PCR 檢測儀（美國ABI公司）；DYY7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）。松果菊苷（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度97%，批號：190906）；兔多克隆抗體TGF-β1（美國 Abcam 公司）；phospho-Smad2（p-Smad2,美國 CST 公司）；phospho-Smad3（p-Smad3, Bioss公司）；蛋白Marker（美國Thermo 公司）；Trizol 試劑（加拿大Roche 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（谷歌生物科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物 db/m 小鼠和db/db 小鼠，雄性，9～10 周，均購于常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)合格證編號：SCXK（蘇）2016-0010。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物房SPF 屏障中，普通飼料喂養(yǎng)，進食、飲水不受限制，12 h 光照/12 h 黑暗交替照明，溫度為 22±2 ℃，相對濕度為50%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，db/m 小鼠為正常對照組（db/m 組，n=10），db/db 小鼠分為模型組（db/db組，n=9）和ECH 干預(yù)組（db/db+ECH組，n=11）。db/db+ECH 組小鼠給予松果菊苷（300 mg·kg-1·d-1）灌胃，db/m 組和 db/db 組小鼠均給予0.9% 氯化鈉溶液（0.05 mL·10 g-1·d-1）灌胃，持續(xù)14 周。干預(yù)14 周后，禁食不禁水12 h，麻醉后心臟灌流分離心臟。將部分心臟組織置于4%多聚甲醛固定后進行病理學(xué)分析，剩余新鮮組織于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 Masson 染色 石蠟切片脫蠟至水，鐵蘇木素染色3 min，1%鹽酸酒精分化，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，麗春紅浸染色7 min，蒸餾水沖洗，磷鉬酸分化3 min，苯胺藍(lán)浸染色5 min，冰醋酸分化后脫水封片，顯微鏡下觀察。膠原沉淀面積百分比=膠原面積/心肌組織面積×100%。

1.2.2 心臟超聲 采用VINNO6VET型超聲心動儀檢查小鼠心臟超聲。2%異氟烷吸入麻醉小鼠后，仰臥固定于泡沫平板上，使用脫毛膏暴露小鼠胸部并于胸部涂少量耦合劑。選用23 mHz探頭，探測深度10～15 mm。探頭置于小鼠胸骨前，獲取胸骨旁長軸、短軸視野。左室短軸切面，于乳頭肌水平應(yīng)用M 型超聲記錄左心室運動曲線，檢測左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-systolic，LVIDs）和射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction,EF）。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 按照Trizol 試劑盒的說明書提取總RNA。在檢測純度和濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green 擴增和定量靶基因。選取GAPDH 為對照，引物序列詳見表1。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；PCR 反應(yīng) 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個周期。使用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)引物序列Table 1 Primer sequences for reverse transcription-polymerase chain reaction

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù) 在心肌組織中加入RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟和磷酸化蛋白抑制劑，提取蛋白后上樣，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%胎牛血清蛋白室溫封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 過夜。次日在二抗中室溫孵育。使用Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光法獲得條帶，分析各條帶的灰度值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異采用單因素方差分析，選擇LSD 或Dunnett‘s T3方法進行組間比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ECH對db/db小鼠左心室心功能的影響

為了解小鼠左室心肌功能，本研究采用心臟超聲探測心功能指標(biāo)LVIDd、LVIDs 和EF。與db/m 組相比，db/db 組 LVIDd 和 LVIDs 升高，EF 降低（圖1，P＜0.05）；與db/db 組相比，db/db+ECH 組LVIDd 和 LVIDs 降低，EF 升高（圖 1，P＜0.05）。結(jié)果表明db/db 組小鼠出現(xiàn)左室肥大和心力衰竭，ECH 能夠顯著改善db/db 小鼠左室肥大和心力衰竭。

圖1 各組小鼠的心臟功能Fig.1 Cardiac function of mice in each group

2.2 ECH 對db/db 小鼠心肌組織中膠原沉積的影響

為了解小鼠心肌的纖維化程度，本研究利用Masson 染色觀察各組小鼠心肌組織的膠原纖維分布。db/m 小鼠心肌間質(zhì)存在少量膠原纖維。在db/db 小鼠中觀察到亮綠色纖維增多、排列紊亂，存在纖維化。與db/m 組相比，db/db 組膠原沉淀面積百分比升高；與db/db 組相比，db/db+ECH組膠原沉淀面積百分比降低（圖2，P＜0.01）。上述結(jié)果表明db/db 組小鼠心肌組織中膠原纖維增多，存在纖維化。ECH 能夠顯著減輕db/db 小鼠心肌纖維化。

圖2 各組小鼠心肌組織Masson染色Fig.2 Masson staining of myocardial tissue of mice in each group

2.3 ECH 對db/db 小鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響

為進一步證實小鼠心肌組織中膠原的表達(dá)，本研究利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組小鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA 的水平。與db/m 組相比，db/db 組Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)水平升高（圖3，P＜0.01）；與db/db 組相比，db/db+ECH 組Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)水平降低（圖3，P＜0.01）。結(jié)果表明，ECH 可以減輕db/db 小鼠心肌組織中的膠原含量。

圖3 各組小鼠心肌組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA水平Fig.3 mRNA levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ in myocardium of mice in each group

2.4 ECH 對 db/db 小鼠 TGF-β1、p-Smad2 和p-Smad3蛋白的影響

基于上述發(fā)現(xiàn)，為探究ECH 改善糖尿病心肌纖維化的可能機制，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測纖維化相關(guān)蛋白TGF-β1、p-Smad2 和p-Smad 的表達(dá)。與 db/m 組相比，db/db 組 TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 蛋白水平增加（圖 4，P＜0.05）；與 db/db 組相比，db/db+ECH 組 TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 蛋白表達(dá)降低（圖 4，P＜0.05）。表明ECH 改善糖尿病心肌纖維化可能與抑制TGF-β1/Smads通路相關(guān)。

圖4 各組小鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白水平Fig.4 Protein levels of TGF-β1,p-Smad2 and p-Smad3 in myocardial tissue of mice in each group

3 討論

糖尿病是影響人類生活和生命質(zhì)量的全球公共衛(wèi)生問題，糖尿病患病率在2019 年占全球人口9.3%，并將在2030 年上升至 10.2%，2045 年將上升至10.9%[14]。隨著糖尿病患病率的升高，DCM逐漸受到臨床醫(yī)師的重視。DCM 是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率和死亡率均較高，其發(fā)病率的增加與肥胖、高胰島素血癥、胰島素抵抗的高發(fā)病率密切相關(guān)[15]。DCM的早期征象為舒張功能障礙，隨著糖尿病病程的進展，發(fā)展為收縮功能障礙，最后導(dǎo)致心臟衰竭[16]。在糖尿病患者和動物模型中，心肌間質(zhì)和血管周圍纖維化是DCM 的顯著特征[4]。本研究結(jié)果表明，與db/m組相比，db/db組心臟超聲結(jié)果顯示LVIDd和LVIDs 升高，EF 降低，組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)db/db組小鼠心肌間質(zhì)中膠原纖維成分增加，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提示Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA水平增加。上述結(jié)果均表明db/db小鼠出現(xiàn)DCM表現(xiàn)。

Xiong等[17]發(fā)現(xiàn)管花肉蓯蓉可以改善2型糖尿病db/db 小鼠糖脂代謝和胰島素敏感性，具有預(yù)防2 型糖尿病發(fā)展并降低罹患動脈粥樣硬化、冠心病和糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險。ECH 通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3 通路、TGF-β1/Smads 通路等發(fā)揮藥理作用[18]。ECH 通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1/叉頭蛋白O3a/錳超氧化物歧化酶，可以逆轉(zhuǎn)心衰大鼠的心肌肥厚、心肌間質(zhì)纖維化，并改善了心臟功能[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)給予ECH 灌胃處理，可以降低LVIDd和LVIDs，升高EF。Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)，與db/db 組相比，db/db+ECH 組心肌間質(zhì)膠原減少。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)提示Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA 水平降低。以上結(jié)果表明ECH 可以改善db/db小鼠心肌纖維化。

TGF-β1是一種致纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過激活其下游Smads 蛋白家族參與心臟、腎臟和肝臟等多種器官和組織的纖維化[19]。心肌纖維化是DCM 和心力衰竭的重要原因。高糖環(huán)境激活TGF-β1，與細(xì)胞膜表面的 TGF-βⅠ/Ⅱ型受體結(jié)合，進而磷酸化TGF-βⅠ型受體下游蛋白Smad2/3并釋放到胞漿,p-Smad2/3 與Smad4 結(jié)合后進入胞核，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蓄積和膠原沉積，引起心肌纖維化[20-21]。一項臨床前研究表明，TGF-β 抑制劑 GW788388 可以逆轉(zhuǎn)心臟損傷，顯著減輕纖維化[22]。Fu等[7]證實通過負(fù)反饋調(diào)控TGF-β1/Smad2,3/p-p38 信號通路，可降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)，從而發(fā)揮抗心肌纖維化作用。Su 等[5]也發(fā)現(xiàn)抑制 TGF-β1/Smad 通路改善了心肌纖維化和心力衰竭。本研究中，與db/m 組 相 比 ，db/db 組 TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 蛋白水平升高；與db/db 組相比，db/db+ECH 組 TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 蛋白表達(dá)降低。表明ECH在db/db小鼠中可能通過抑制TGF-β1/Smads通路發(fā)揮改善纖維化的作用。

綜上所述，2 型糖尿病db/db 小鼠出現(xiàn)心功能障礙、膠原沉積和心肌纖維化等DCM 典型特征。ECH 干預(yù)后，可以改善db/db 小鼠上述病變，其潛在的作用機制可能與抑制TGF-β1/Smads 信號通路的活化有關(guān)，但是還需要進一步深入研究具體的作用機制。