敲除集胞藻PCC 6803 中編碼乳酸脫氫酶的slr1556 基因?qū)ι锖铣梢掖嫉挠绊?/h1>
2022-02-11 03:45:52許慧露徐岷張煒
生物技術(shù)進(jìn)展 2022年1期
許慧露， 徐岷， 張煒*
1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212000
乙醇具有燃燒無(wú)污染、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，可作為再生生物燃料，乙醇再生已成為全世界研究的重點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)成本高且產(chǎn)量低，近年來(lái)利用藍(lán)藻等光合微生物合成乙醇被廣泛應(yīng)用[1-2]。然而多數(shù)基于藍(lán)藻的乙醇生物合成系統(tǒng)產(chǎn)量不高，在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。很多生產(chǎn)化學(xué)品的代謝合成途徑是以內(nèi)源代謝物作為起始合成前體，而這些內(nèi)源代謝物通常在細(xì)胞生長(zhǎng)和生理活動(dòng)等內(nèi)源性代謝途徑中被消耗[3]。
合理優(yōu)化內(nèi)源性代謝途徑可提高乙醇合成前體含量，已成為實(shí)現(xiàn)乙醇高效合成的有效策略?；趦?nèi)源性代謝物含量的比較，丙酮酸被廣泛選作集胞藻PCC 6803 中乙醇合成的前體[4-5]。本研究選取來(lái)自運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）和來(lái)自大腸桿菌的NADPH 依賴型醛還原酶基因（yqhD），通過(guò)密碼子優(yōu)化，在集胞藻PCC 6803 中組合表達(dá)，構(gòu)建了一條以丙酮酸為前體的乙醇生物合成途徑，其中丙酮酸被丙酮酸脫羧酶催化為乙醛，然后乙醛被NADPH 依賴型醛還原酶催化為乙醇，從而實(shí)現(xiàn)乙醇在培養(yǎng)基中的積聚（圖1）。
圖1 乙醇合成代謝流程圖Fig.1 Ethanol synthesis and metabolism flow chart
為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)集胞藻PCC 6803 中乙醇的高效合成，本研究通過(guò)代謝組學(xué)的分析，敲除集胞藻PCC 6803 基因組中編碼乳酸脫氫酶的slr1556基因，阻斷丙酮酸與乳酸的相互轉(zhuǎn)化途徑，減少前體丙酮酸的消耗，旨在探究丙酮酸轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑的阻斷對(duì)集胞藻PCC 6803 乙醇合成的影響，以期實(shí)現(xiàn)乙醇的高效合成。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
利用高保真Star酶與Taq酶［NEB（北京）有限公司］分別對(duì)基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用限制性內(nèi)切酶［NEB（北京）有限公司］酶切載體與片段構(gòu)建載體。構(gòu)建的中間載體轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α，獲得對(duì)應(yīng)大腸桿菌菌株。利用質(zhì)粒提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取大腸桿菌中的質(zhì)粒。其他試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 菌株和生長(zhǎng)條件
利用大腸桿菌DH5α 構(gòu)建質(zhì)粒。將不同抗性的大腸桿菌菌株分別在含有相應(yīng)抗生素的液體以及含有1.5%瓊脂的固體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30 ℃。野生型集胞藻PCC 6803 和工程菌株在BG11 含有相應(yīng)抗生素的液體以及含有1.5%瓊脂的固體BG11 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均采取光自養(yǎng)培養(yǎng)。光自養(yǎng)培養(yǎng)條件設(shè)置：溫度30 ℃，光強(qiáng)100 μmol photons·m-2·s-1，于光照培養(yǎng)箱中無(wú)人為干預(yù)培養(yǎng)[6]。野生型集胞藻PCC 6803 和工程菌株在優(yōu)化培養(yǎng)下設(shè)置培養(yǎng)溫度為30 ℃，利用曝氣裝置向培養(yǎng)體系中人為通入5%CO2和95%空氣進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，設(shè)置光強(qiáng)為100 μmol photons·m-2·s-1。
1.3 質(zhì)粒的構(gòu)造
利用從生工生物工程（上海）股份有限公司購(gòu)買的pMD18-T 載體作為基礎(chǔ)。在pMD18-T 上插入slr1556上下游600 bp 同源臂，構(gòu)建載體ETH1556。以提取的集胞藻PCC 6803 的基因組DNA 為模板，分別用引物slr1556Up-F、slr1556Up-R 和 slr1556Dw-F 和 slr1556Dw-R（引物序列見(jiàn)表1）擴(kuò)增slr1556上下游600 bp 同源基因并克隆到pMD18-T 的SphⅠ/MluⅠ和XbaⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)上。將壯觀霉素基因克隆到質(zhì)粒ETH1556 上，構(gòu)建質(zhì)粒ETH1556-Ω。以生工生物工程（上海）股份有限公司優(yōu)化后的壯觀霉素基因?yàn)槟０?，用SP-F和SP-R引物（表1）擴(kuò)增壯觀霉素基因并克隆到質(zhì)粒ETH1556 的XhoⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)上。以集胞藻PCC 6803 的基因組DNA 為模板，分別用引物Prbc-F、Prbc-R 和 TrbcL-F、TrbcL-R（表 1）擴(kuò)增啟動(dòng)子和終止子基因并克隆到ETH1556-Ω 的BamH Ⅰ/SalⅠ 和SalⅠ/Hind Ⅲ 位 點(diǎn) 上 獲 得ETH-1pt。根據(jù)集胞藻PCC 6803 的密碼子偏好性，對(duì)運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌pdc和大腸桿菌yqhD的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別以優(yōu)化的合成菌株為模板，用 Pdc-F、Pdc-R 和 YqhD-F、YqhD-R（表1）為引物擴(kuò)增基因，并插入到ETH-1pt 的NdeⅠ/BamHⅠ和XbaⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒ETH02。構(gòu)建整合點(diǎn)為slr0168的質(zhì)粒ETH01 作為對(duì)照，構(gòu)造方法與ETH02 類似，用引物slr0168 Up-F、slr0168Up-R 和 slr0168Dw-F、slr0168Dw-R（表1）擴(kuò)增slr0168上下游600 bp同源基因并克隆到pMD18-T的SphⅠ/MluⅠ和XbaⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)上構(gòu)建載體ETH0168。將SpR-PrbcL-pdc-yqhD-TrbcL基因簇轉(zhuǎn)入ETH0168 構(gòu)建載體ETH01，構(gòu)建質(zhì)粒的特點(diǎn)如表2所示。
表1 本研究所使用的引物Table 1 The primers used in this study
表2 構(gòu)建的質(zhì)粒及相關(guān)特點(diǎn)Table 2 Constructed plasmids and related characteristics
1.4 工程藻株的構(gòu)建
將質(zhì)粒ETH01、ETH02 分別轉(zhuǎn)入野生型集胞藻PCC 6803 中，根據(jù)同源替換原理[14]，質(zhì)粒ETH01 含有slr0168基因上下游 600 bp 的同源序列，同源序列間的PrbcL-SpR-pdc-yqhD-TrbcL基因簇經(jīng)同源替換整合到集胞藻PCC 6803 中slr0168基因位點(diǎn)上。將質(zhì)粒ETH02slr1556上下游600 bp 同源序列間的PrbcL-SpR-pdc-yqhD-TrbcL基因簇整合到集胞藻PCC 6803 中slr1556基因位點(diǎn)上。為測(cè)定編碼乳酸脫氫酶的slr1556基因的敲除對(duì)丙酮酸含量的變化，將質(zhì)粒ETH1556Ω 轉(zhuǎn)化集胞藻PCC 6803，ETH1556Ω 中的SpR基因整合到集胞藻PCC 6803 中slr1556基因位點(diǎn)上。通過(guò)轉(zhuǎn)入基因簇中SpR抗性基因篩選，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化菌株SETH01、SETH02 和SETHΩ。具體操作步驟如下。培養(yǎng)細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)階段（OD730在0.6～0.8），用新鮮的BG11 培養(yǎng)基收集細(xì)胞，將質(zhì)粒與新鮮的藻細(xì)胞混合。混合物在30 ℃恒定光照下孵育5 h，并定期搖動(dòng)。然后將混合物轉(zhuǎn)移至無(wú)抗的BG11 固體培養(yǎng)基的無(wú)菌核孔膜上，置于光照培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度為30 ℃，并在恒定光照下孵育過(guò)夜。培養(yǎng)過(guò)夜后，將無(wú)菌膜轉(zhuǎn)移到帶有相應(yīng)抗性的固體BG11培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周后出現(xiàn)相應(yīng)的單菌落[7]。
1.5 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析
根據(jù)相關(guān)研究[8]報(bào)道，合成的乙醇主要分泌于胞外，因此，本研究直接檢測(cè)BG11 液體培養(yǎng)基中的乙醇含量。在乙醇測(cè)定試驗(yàn)中，所有改造菌株保持初始OD730=0.1，在新鮮BG11 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法對(duì)藻液離心并保留濾液。過(guò)濾后的溶液用HPLC進(jìn)行乙醇分析。
1.6 酶活性測(cè)定
按Hoppner等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)。PDC 與YqhD 的酶活性通過(guò)利用NADP 與NADPH在340 nm時(shí)吸光度的增減來(lái)計(jì)算[8,11]。
1.7 丙酮酸含量的檢測(cè)
將藻細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)階段后，以6 000 g離心5 min，棄上清保留沉淀。沉淀在冰浴下，采用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。設(shè)置細(xì)胞破碎儀功率為20%，超聲3 s,間隔10 s，重復(fù)30 次。破碎后靜置30 min，于常溫下以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心30 min，保留上清。利用丙酮酸測(cè)試試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測(cè)上清液丙酮酸含量。
1.8 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法
利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)λ=730 nm 的透光度并以此確定藻細(xì)胞濃度OD730的數(shù)值。根據(jù) Choi 等[12]報(bào)道的方法，認(rèn)為 OD730/0.171 即為干細(xì)胞重量（dry cell weight，DCW）。
1.9 數(shù)據(jù)分析
利用Origin 9.0 進(jìn)行圖像繪制與數(shù)據(jù)分析[13]，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果與分析
2.1 工程藻株的成功構(gòu)建
轉(zhuǎn)化的菌株經(jīng)PCR 驗(yàn)證并鑒定基因序列，經(jīng)驗(yàn)證，整合基因位點(diǎn)大小正確，且被整合位點(diǎn)基因完全被消除，表明成功構(gòu)建工程藻株。
2.2 乙醇的合成與菌株的生長(zhǎng)
觀察對(duì)比菌株生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)定期采集SETH01 和SETH02 的樣品進(jìn)行乙醇的測(cè)定。在乙醇測(cè)定試驗(yàn)中，野生型集胞藻PCC 6803 與菌株SETHΩ 在7 d 的觀察期內(nèi)未合成任何乙醇。如圖 2 所示，菌株 SETH01 與 SETH02 均成功合成乙醇，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，累積的乙醇含量逐漸上升。培養(yǎng)7 d 后，菌株SETH01 乙醇產(chǎn)量達(dá)到445 mg·L-1，菌株 SETH02 產(chǎn)量達(dá)到 593 mg·L-1，其在相同時(shí)間內(nèi)，合成的乙醇產(chǎn)量約為菌株SETH01 的1.3 倍。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，在相同培養(yǎng)條件下，SETH02 的乙醇產(chǎn)量增長(zhǎng)明顯快于SETH01，兩菌株的產(chǎn)量差距由第1 天的26 mg·L-1增至第7天的148 mg·L-1。結(jié)果顯示，slr1556基因的敲除明顯促進(jìn)了菌株乙醇的合成。
圖2 菌株的乙醇生產(chǎn)曲線Fig.2 Ethanol production curve of the strains
如圖3 所示，多個(gè)菌株在7 d 的觀察期內(nèi)生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，方差分析表明結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證明slr1556基因的敲除對(duì)集胞藻細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響。
圖3 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.3 The growth condition of the strains
2.3 丙酮酸含量的檢測(cè)
如圖4 所示，野生型集胞藻中丙酮酸含量約為 0.85 μmol·g-1·DCW-1。在菌株 SETHΩ 中檢測(cè)到丙酮酸含量為 1.25 μmol·g-1·DCW-1，其含量約為野生型集胞藻中丙酮酸含量的1.5 倍。結(jié)果表明敲除slr1556基因阻斷了丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，造成了內(nèi)源性代謝物丙酮酸的積聚，增加了集胞藻中內(nèi)源性丙酮酸含量。
圖4 不同菌株的丙酮酸含量Fig.4 The content of pyruvate in different strains
2.4 酶活性檢測(cè)
如 圖 5 所 示 ，SETH02 中 的 PDC（300 μmol·min-1·mg-1）、YqhD（780 μmol·min-1·mg-1）酶活性均高于 SETH01（240、690 μmol·min-1·mg-1），表明阻斷丙酮酸可逆轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑，一定程度上促進(jìn)了合成乙醇相關(guān)酶活性的升高。
圖5 不同菌株的酶活性Fig.5 The enzyme activity in different strains
2.5 菌株優(yōu)化培養(yǎng)
為高產(chǎn)量的合成乙醇，對(duì)菌株SETH02 進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。優(yōu)化方式為向培養(yǎng)體系中通入5% CO2和95%空氣。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，持續(xù)觀察菌株SETH02 生長(zhǎng)30 d，并記錄30 d 內(nèi)乙醇合成情況。如圖6 所示，在優(yōu)化培養(yǎng)的前15天，集胞藻細(xì)胞迅速增殖，在15 d 后趨于平穩(wěn)，OD730達(dá)到14 左右。累積的乙醇產(chǎn)量在前25 天急速增加，并在 28 d（OD730≈14.6）達(dá)到最大值（1.8 g·L-1）。
圖6 SETH02的菌株生長(zhǎng)與乙醇生產(chǎn)情況Fig.6 The growth condition and ethanol production in strain SETH02
3 討論
以丙酮酸作為乙醇合成前體，丙酮酸脫羧酶與醛還原酶的組合表達(dá)被廣泛應(yīng)用于集胞藻乙醇合成研究中[1]。在乙醇合成關(guān)鍵酶的選擇上，考慮到集胞藻細(xì)胞內(nèi)NADPH 輔助因子含量遠(yuǎn)高于NADH，引入的醛還原酶與NADPH 相互作用，可有效促進(jìn)乙醇的合成[15]。YqhD 在SETH01中的活性達(dá)到 690 μmol·min-1·mg-1，約為相同條件下丙酮酸脫羧酶活性的3倍，結(jié)果表明，yqhD基因的選擇有效促進(jìn)了乙醇的合成。
在集胞藻生物合成的研究中，多個(gè)啟動(dòng)子被應(yīng)用于驅(qū)動(dòng)外源乙醇合成基因的表達(dá)，如NblA[16]、PpetE[17]、PrbcL[1]等。PrbcL 作為光強(qiáng)啟動(dòng)子，其被歸類為強(qiáng)啟動(dòng)子[17]。光強(qiáng)啟動(dòng)子PrbcL可以消除金屬離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子（PpetE 等）可能造成的關(guān)鍵酶活性降低與外源基因低表達(dá)等不利影響[18]。在選擇PrbcL作為啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，選用來(lái)源于集胞藻編碼核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶/加氧酶的rbcL基因設(shè)計(jì)終止子TrbcL。PrbcL 搭配TrbcL的設(shè)計(jì)在之前的研究中被廣泛應(yīng)用于集胞藻的合成實(shí)驗(yàn)中，并顯示出高表達(dá)效率[1]。
內(nèi)源性代謝與目標(biāo)生物合成途徑之間的代謝不平衡往往限制微生物系統(tǒng)的合成產(chǎn)量。為進(jìn)一步提高乙醇合成的產(chǎn)量，需平衡內(nèi)源性代謝與生物合成途徑之間相互沖突的關(guān)系而進(jìn)行基因敲除[17,19]。在集胞藻PCC 6803 中內(nèi)源性代謝生成的丙酮酸被大量的內(nèi)源性途徑消耗。中間代謝物丙酮酸的含量限制了合成乙醇的產(chǎn)量[20]。由藻細(xì)胞糖酵解生成的丙酮酸在內(nèi)源性代謝過(guò)程中由乳酸脫氫酶可逆地轉(zhuǎn)化為乳酸[21]，該乳酸脫氫酶由基因slr1556編碼，表明敲除slr1556基因可以有效地消除乳酸脫氫酶酶活性，從而促進(jìn)乙醇合成前體丙酮酸的積累，促進(jìn)乙醇的合成。本研究結(jié)果顯示，敲除slr1556基因，中間代謝物丙酮酸的含量提高為原來(lái)的1.5倍，同時(shí)合成的乙醇產(chǎn)量提高為原來(lái)的1.3倍，表明阻斷丙酮酸轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑可提高乙醇合成產(chǎn)量。
研究表明，100 μmol photons·m-2·s-1的光強(qiáng)能完全驅(qū)動(dòng)PrbcL 啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)并最有利于集胞藻的生長(zhǎng)[22]。本研究在優(yōu)化培養(yǎng)下，設(shè)置光強(qiáng)為100 μmol photons·m-2·s-1持 續(xù) 照 射 ，利 用 菌 株SETH02 最后合成了約1.8 g·L-1的乙醇，與前人相比產(chǎn)量仍存在一定的差距[1,23]。酶活性分析表明，SETH02 中 PDC 活性為 300 μmol·min-1·mg-1，而YqhD 活性約為PDC 活性的2.5 倍。另外通過(guò)SETH02 培養(yǎng)基中中間產(chǎn)物乙醛含量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SETH02 培養(yǎng)基中并無(wú)乙醛的存在，表明YqhD活性遠(yuǎn)高于PDC 活性，PDC 活性限制了乙醇的高產(chǎn)量合成，因此，提高PDC 酶活性，突破PDC 對(duì)乙醇合成的限制，可以有效促進(jìn)乙醇的合成。未來(lái)可將質(zhì)粒ETH01 轉(zhuǎn)入菌株SETH02 中，以提高乙醇生物合成量。
綜上所述，在集胞藻PCC6803 中敲除編碼乳酸脫氫酶的slr1556基因，有效地增加了乙醇合成前體丙酮酸含量并促進(jìn)PDC、YqhD酶活性從而提高了集胞藻乙醇合成的產(chǎn)量。另外，集胞藻PCC 6803 中競(jìng)爭(zhēng)性丙酮酸轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑的阻斷對(duì)集胞藻細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
許慧露， 徐岷， 張煒*
1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212000
乙醇具有燃燒無(wú)污染、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，可作為再生生物燃料，乙醇再生已成為全世界研究的重點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)成本高且產(chǎn)量低，近年來(lái)利用藍(lán)藻等光合微生物合成乙醇被廣泛應(yīng)用[1-2]。然而多數(shù)基于藍(lán)藻的乙醇生物合成系統(tǒng)產(chǎn)量不高，在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。很多生產(chǎn)化學(xué)品的代謝合成途徑是以內(nèi)源代謝物作為起始合成前體，而這些內(nèi)源代謝物通常在細(xì)胞生長(zhǎng)和生理活動(dòng)等內(nèi)源性代謝途徑中被消耗[3]。
合理優(yōu)化內(nèi)源性代謝途徑可提高乙醇合成前體含量，已成為實(shí)現(xiàn)乙醇高效合成的有效策略?；趦?nèi)源性代謝物含量的比較，丙酮酸被廣泛選作集胞藻PCC 6803 中乙醇合成的前體[4-5]。本研究選取來(lái)自運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）和來(lái)自大腸桿菌的NADPH 依賴型醛還原酶基因（yqhD），通過(guò)密碼子優(yōu)化，在集胞藻PCC 6803 中組合表達(dá)，構(gòu)建了一條以丙酮酸為前體的乙醇生物合成途徑，其中丙酮酸被丙酮酸脫羧酶催化為乙醛，然后乙醛被NADPH 依賴型醛還原酶催化為乙醇，從而實(shí)現(xiàn)乙醇在培養(yǎng)基中的積聚（圖1）。
圖1 乙醇合成代謝流程圖Fig.1 Ethanol synthesis and metabolism flow chart
為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)集胞藻PCC 6803 中乙醇的高效合成，本研究通過(guò)代謝組學(xué)的分析，敲除集胞藻PCC 6803 基因組中編碼乳酸脫氫酶的slr1556基因，阻斷丙酮酸與乳酸的相互轉(zhuǎn)化途徑，減少前體丙酮酸的消耗，旨在探究丙酮酸轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑的阻斷對(duì)集胞藻PCC 6803 乙醇合成的影響，以期實(shí)現(xiàn)乙醇的高效合成。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
利用高保真Star酶與Taq酶［NEB（北京）有限公司］分別對(duì)基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用限制性內(nèi)切酶［NEB（北京）有限公司］酶切載體與片段構(gòu)建載體。構(gòu)建的中間載體轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α，獲得對(duì)應(yīng)大腸桿菌菌株。利用質(zhì)粒提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取大腸桿菌中的質(zhì)粒。其他試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 菌株和生長(zhǎng)條件
利用大腸桿菌DH5α 構(gòu)建質(zhì)粒。將不同抗性的大腸桿菌菌株分別在含有相應(yīng)抗生素的液體以及含有1.5%瓊脂的固體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30 ℃。野生型集胞藻PCC 6803 和工程菌株在BG11 含有相應(yīng)抗生素的液體以及含有1.5%瓊脂的固體BG11 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均采取光自養(yǎng)培養(yǎng)。光自養(yǎng)培養(yǎng)條件設(shè)置：溫度30 ℃，光強(qiáng)100 μmol photons·m-2·s-1，于光照培養(yǎng)箱中無(wú)人為干預(yù)培養(yǎng)[6]。野生型集胞藻PCC 6803 和工程菌株在優(yōu)化培養(yǎng)下設(shè)置培養(yǎng)溫度為30 ℃，利用曝氣裝置向培養(yǎng)體系中人為通入5%CO2和95%空氣進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，設(shè)置光強(qiáng)為100 μmol photons·m-2·s-1。
1.3 質(zhì)粒的構(gòu)造
利用從生工生物工程（上海）股份有限公司購(gòu)買的pMD18-T 載體作為基礎(chǔ)。在pMD18-T 上插入slr1556上下游600 bp 同源臂，構(gòu)建載體ETH1556。以提取的集胞藻PCC 6803 的基因組DNA 為模板，分別用引物slr1556Up-F、slr1556Up-R 和 slr1556Dw-F 和 slr1556Dw-R（引物序列見(jiàn)表1）擴(kuò)增slr1556上下游600 bp 同源基因并克隆到pMD18-T 的SphⅠ/MluⅠ和XbaⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)上。將壯觀霉素基因克隆到質(zhì)粒ETH1556 上，構(gòu)建質(zhì)粒ETH1556-Ω。以生工生物工程（上海）股份有限公司優(yōu)化后的壯觀霉素基因?yàn)槟０?，用SP-F和SP-R引物（表1）擴(kuò)增壯觀霉素基因并克隆到質(zhì)粒ETH1556 的XhoⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)上。以集胞藻PCC 6803 的基因組DNA 為模板，分別用引物Prbc-F、Prbc-R 和 TrbcL-F、TrbcL-R（表 1）擴(kuò)增啟動(dòng)子和終止子基因并克隆到ETH1556-Ω 的BamH Ⅰ/SalⅠ 和SalⅠ/Hind Ⅲ 位 點(diǎn) 上 獲 得ETH-1pt。根據(jù)集胞藻PCC 6803 的密碼子偏好性，對(duì)運(yùn)動(dòng)型發(fā)酵單胞菌pdc和大腸桿菌yqhD的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別以優(yōu)化的合成菌株為模板，用 Pdc-F、Pdc-R 和 YqhD-F、YqhD-R（表1）為引物擴(kuò)增基因，并插入到ETH-1pt 的NdeⅠ/BamHⅠ和XbaⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒ETH02。構(gòu)建整合點(diǎn)為slr0168的質(zhì)粒ETH01 作為對(duì)照，構(gòu)造方法與ETH02 類似，用引物slr0168 Up-F、slr0168Up-R 和 slr0168Dw-F、slr0168Dw-R（表1）擴(kuò)增slr0168上下游600 bp同源基因并克隆到pMD18-T的SphⅠ/MluⅠ和XbaⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)上構(gòu)建載體ETH0168。將SpR-PrbcL-pdc-yqhD-TrbcL基因簇轉(zhuǎn)入ETH0168 構(gòu)建載體ETH01，構(gòu)建質(zhì)粒的特點(diǎn)如表2所示。
表1 本研究所使用的引物Table 1 The primers used in this study
表2 構(gòu)建的質(zhì)粒及相關(guān)特點(diǎn)Table 2 Constructed plasmids and related characteristics
1.4 工程藻株的構(gòu)建
將質(zhì)粒ETH01、ETH02 分別轉(zhuǎn)入野生型集胞藻PCC 6803 中，根據(jù)同源替換原理[14]，質(zhì)粒ETH01 含有slr0168基因上下游 600 bp 的同源序列，同源序列間的PrbcL-SpR-pdc-yqhD-TrbcL基因簇經(jīng)同源替換整合到集胞藻PCC 6803 中slr0168基因位點(diǎn)上。將質(zhì)粒ETH02slr1556上下游600 bp 同源序列間的PrbcL-SpR-pdc-yqhD-TrbcL基因簇整合到集胞藻PCC 6803 中slr1556基因位點(diǎn)上。為測(cè)定編碼乳酸脫氫酶的slr1556基因的敲除對(duì)丙酮酸含量的變化，將質(zhì)粒ETH1556Ω 轉(zhuǎn)化集胞藻PCC 6803，ETH1556Ω 中的SpR基因整合到集胞藻PCC 6803 中slr1556基因位點(diǎn)上。通過(guò)轉(zhuǎn)入基因簇中SpR抗性基因篩選，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化菌株SETH01、SETH02 和SETHΩ。具體操作步驟如下。培養(yǎng)細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)階段（OD730在0.6～0.8），用新鮮的BG11 培養(yǎng)基收集細(xì)胞，將質(zhì)粒與新鮮的藻細(xì)胞混合。混合物在30 ℃恒定光照下孵育5 h，并定期搖動(dòng)。然后將混合物轉(zhuǎn)移至無(wú)抗的BG11 固體培養(yǎng)基的無(wú)菌核孔膜上，置于光照培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度為30 ℃，并在恒定光照下孵育過(guò)夜。培養(yǎng)過(guò)夜后，將無(wú)菌膜轉(zhuǎn)移到帶有相應(yīng)抗性的固體BG11培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周后出現(xiàn)相應(yīng)的單菌落[7]。
1.5 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析
根據(jù)相關(guān)研究[8]報(bào)道，合成的乙醇主要分泌于胞外，因此，本研究直接檢測(cè)BG11 液體培養(yǎng)基中的乙醇含量。在乙醇測(cè)定試驗(yàn)中，所有改造菌株保持初始OD730=0.1，在新鮮BG11 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法對(duì)藻液離心并保留濾液。過(guò)濾后的溶液用HPLC進(jìn)行乙醇分析。
1.6 酶活性測(cè)定
按Hoppner等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)。PDC 與YqhD 的酶活性通過(guò)利用NADP 與NADPH在340 nm時(shí)吸光度的增減來(lái)計(jì)算[8,11]。
1.7 丙酮酸含量的檢測(cè)
將藻細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)階段后，以6 000 g離心5 min，棄上清保留沉淀。沉淀在冰浴下，采用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。設(shè)置細(xì)胞破碎儀功率為20%，超聲3 s,間隔10 s，重復(fù)30 次。破碎后靜置30 min，于常溫下以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心30 min，保留上清。利用丙酮酸測(cè)試試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測(cè)上清液丙酮酸含量。
1.8 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法
利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)λ=730 nm 的透光度并以此確定藻細(xì)胞濃度OD730的數(shù)值。根據(jù) Choi 等[12]報(bào)道的方法，認(rèn)為 OD730/0.171 即為干細(xì)胞重量（dry cell weight，DCW）。
1.9 數(shù)據(jù)分析
利用Origin 9.0 進(jìn)行圖像繪制與數(shù)據(jù)分析[13]，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果與分析
2.1 工程藻株的成功構(gòu)建
轉(zhuǎn)化的菌株經(jīng)PCR 驗(yàn)證并鑒定基因序列，經(jīng)驗(yàn)證，整合基因位點(diǎn)大小正確，且被整合位點(diǎn)基因完全被消除，表明成功構(gòu)建工程藻株。
2.2 乙醇的合成與菌株的生長(zhǎng)
觀察對(duì)比菌株生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)定期采集SETH01 和SETH02 的樣品進(jìn)行乙醇的測(cè)定。在乙醇測(cè)定試驗(yàn)中，野生型集胞藻PCC 6803 與菌株SETHΩ 在7 d 的觀察期內(nèi)未合成任何乙醇。如圖 2 所示，菌株 SETH01 與 SETH02 均成功合成乙醇，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，累積的乙醇含量逐漸上升。培養(yǎng)7 d 后，菌株SETH01 乙醇產(chǎn)量達(dá)到445 mg·L-1，菌株 SETH02 產(chǎn)量達(dá)到 593 mg·L-1，其在相同時(shí)間內(nèi)，合成的乙醇產(chǎn)量約為菌株SETH01 的1.3 倍。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，在相同培養(yǎng)條件下，SETH02 的乙醇產(chǎn)量增長(zhǎng)明顯快于SETH01，兩菌株的產(chǎn)量差距由第1 天的26 mg·L-1增至第7天的148 mg·L-1。結(jié)果顯示，slr1556基因的敲除明顯促進(jìn)了菌株乙醇的合成。
圖2 菌株的乙醇生產(chǎn)曲線Fig.2 Ethanol production curve of the strains
如圖3 所示，多個(gè)菌株在7 d 的觀察期內(nèi)生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，方差分析表明結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證明slr1556基因的敲除對(duì)集胞藻細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響。
圖3 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.3 The growth condition of the strains
2.3 丙酮酸含量的檢測(cè)
如圖4 所示，野生型集胞藻中丙酮酸含量約為 0.85 μmol·g-1·DCW-1。在菌株 SETHΩ 中檢測(cè)到丙酮酸含量為 1.25 μmol·g-1·DCW-1，其含量約為野生型集胞藻中丙酮酸含量的1.5 倍。結(jié)果表明敲除slr1556基因阻斷了丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，造成了內(nèi)源性代謝物丙酮酸的積聚，增加了集胞藻中內(nèi)源性丙酮酸含量。
圖4 不同菌株的丙酮酸含量Fig.4 The content of pyruvate in different strains
2.4 酶活性檢測(cè)
如 圖 5 所 示 ，SETH02 中 的 PDC（300 μmol·min-1·mg-1）、YqhD（780 μmol·min-1·mg-1）酶活性均高于 SETH01（240、690 μmol·min-1·mg-1），表明阻斷丙酮酸可逆轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑，一定程度上促進(jìn)了合成乙醇相關(guān)酶活性的升高。
圖5 不同菌株的酶活性Fig.5 The enzyme activity in different strains
2.5 菌株優(yōu)化培養(yǎng)
為高產(chǎn)量的合成乙醇，對(duì)菌株SETH02 進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。優(yōu)化方式為向培養(yǎng)體系中通入5% CO2和95%空氣。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，持續(xù)觀察菌株SETH02 生長(zhǎng)30 d，并記錄30 d 內(nèi)乙醇合成情況。如圖6 所示，在優(yōu)化培養(yǎng)的前15天，集胞藻細(xì)胞迅速增殖，在15 d 后趨于平穩(wěn)，OD730達(dá)到14 左右。累積的乙醇產(chǎn)量在前25 天急速增加，并在 28 d（OD730≈14.6）達(dá)到最大值（1.8 g·L-1）。
圖6 SETH02的菌株生長(zhǎng)與乙醇生產(chǎn)情況Fig.6 The growth condition and ethanol production in strain SETH02
3 討論
以丙酮酸作為乙醇合成前體，丙酮酸脫羧酶與醛還原酶的組合表達(dá)被廣泛應(yīng)用于集胞藻乙醇合成研究中[1]。在乙醇合成關(guān)鍵酶的選擇上，考慮到集胞藻細(xì)胞內(nèi)NADPH 輔助因子含量遠(yuǎn)高于NADH，引入的醛還原酶與NADPH 相互作用，可有效促進(jìn)乙醇的合成[15]。YqhD 在SETH01中的活性達(dá)到 690 μmol·min-1·mg-1，約為相同條件下丙酮酸脫羧酶活性的3倍，結(jié)果表明，yqhD基因的選擇有效促進(jìn)了乙醇的合成。
在集胞藻生物合成的研究中，多個(gè)啟動(dòng)子被應(yīng)用于驅(qū)動(dòng)外源乙醇合成基因的表達(dá)，如NblA[16]、PpetE[17]、PrbcL[1]等。PrbcL 作為光強(qiáng)啟動(dòng)子，其被歸類為強(qiáng)啟動(dòng)子[17]。光強(qiáng)啟動(dòng)子PrbcL可以消除金屬離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子（PpetE 等）可能造成的關(guān)鍵酶活性降低與外源基因低表達(dá)等不利影響[18]。在選擇PrbcL作為啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，選用來(lái)源于集胞藻編碼核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶/加氧酶的rbcL基因設(shè)計(jì)終止子TrbcL。PrbcL 搭配TrbcL的設(shè)計(jì)在之前的研究中被廣泛應(yīng)用于集胞藻的合成實(shí)驗(yàn)中，并顯示出高表達(dá)效率[1]。
內(nèi)源性代謝與目標(biāo)生物合成途徑之間的代謝不平衡往往限制微生物系統(tǒng)的合成產(chǎn)量。為進(jìn)一步提高乙醇合成的產(chǎn)量，需平衡內(nèi)源性代謝與生物合成途徑之間相互沖突的關(guān)系而進(jìn)行基因敲除[17,19]。在集胞藻PCC 6803 中內(nèi)源性代謝生成的丙酮酸被大量的內(nèi)源性途徑消耗。中間代謝物丙酮酸的含量限制了合成乙醇的產(chǎn)量[20]。由藻細(xì)胞糖酵解生成的丙酮酸在內(nèi)源性代謝過(guò)程中由乳酸脫氫酶可逆地轉(zhuǎn)化為乳酸[21]，該乳酸脫氫酶由基因slr1556編碼，表明敲除slr1556基因可以有效地消除乳酸脫氫酶酶活性，從而促進(jìn)乙醇合成前體丙酮酸的積累，促進(jìn)乙醇的合成。本研究結(jié)果顯示，敲除slr1556基因，中間代謝物丙酮酸的含量提高為原來(lái)的1.5倍，同時(shí)合成的乙醇產(chǎn)量提高為原來(lái)的1.3倍，表明阻斷丙酮酸轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑可提高乙醇合成產(chǎn)量。
研究表明，100 μmol photons·m-2·s-1的光強(qiáng)能完全驅(qū)動(dòng)PrbcL 啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)并最有利于集胞藻的生長(zhǎng)[22]。本研究在優(yōu)化培養(yǎng)下，設(shè)置光強(qiáng)為100 μmol photons·m-2·s-1持 續(xù) 照 射 ，利 用 菌 株SETH02 最后合成了約1.8 g·L-1的乙醇，與前人相比產(chǎn)量仍存在一定的差距[1,23]。酶活性分析表明，SETH02 中 PDC 活性為 300 μmol·min-1·mg-1，而YqhD 活性約為PDC 活性的2.5 倍。另外通過(guò)SETH02 培養(yǎng)基中中間產(chǎn)物乙醛含量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SETH02 培養(yǎng)基中并無(wú)乙醛的存在，表明YqhD活性遠(yuǎn)高于PDC 活性，PDC 活性限制了乙醇的高產(chǎn)量合成，因此，提高PDC 酶活性，突破PDC 對(duì)乙醇合成的限制，可以有效促進(jìn)乙醇的合成。未來(lái)可將質(zhì)粒ETH01 轉(zhuǎn)入菌株SETH02 中，以提高乙醇生物合成量。
綜上所述，在集胞藻PCC6803 中敲除編碼乳酸脫氫酶的slr1556基因，有效地增加了乙醇合成前體丙酮酸含量并促進(jìn)PDC、YqhD酶活性從而提高了集胞藻乙醇合成的產(chǎn)量。另外，集胞藻PCC 6803 中競(jìng)爭(zhēng)性丙酮酸轉(zhuǎn)化乳酸代謝途徑的阻斷對(duì)集胞藻細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
