甄珍， 竇迎港， 劉曉蘭

1.哈爾濱海關技術中心綜合實驗室，黑龍江齊齊哈爾161005；2.石河子大學化學化工學院，新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，新疆石河子832003；3.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161005

飼料及飼料添加劑的轉基因檢測是該領域的難點之一[1]，飼料成分復雜，包含多種動植物成分，再加上各種深加工產品相互混合，樣品成分復雜。樣品的復雜性直接決定了核酸的提取難度，一般的核酸提取方法很難得到理想的可供下游檢測所需的DNA。

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是我國玉米加工副產品之一，是玉米經過浸泡后分離粗淀粉乳，得到蛋白質水，再經過濃縮、脫水分離、干燥后得到的產品[2]，主要用作蛋白飼料。近年來，黑龍江省玉米蛋白粉等玉米飼料產品的出口額度逐年增加，主要出口俄羅斯、韓國、日本等國家。在進出口貿易中對轉基因含量有嚴格的規(guī)定，歐盟規(guī)定飼料轉基因含量需＜0.9%，韓國＜3%，日本＜1%，俄羅斯則規(guī)定不得含有轉基因成分，而飼料樣本本身的復雜性給進出口產品轉基因成分的檢測工作帶來了巨大的壓力和挑戰(zhàn)。在出口貿易中多次出現(xiàn)產品中含有轉基因成分（假陰性產品）被退回的情況，使得企業(yè)經濟受損且嚴重影響國家形象。玉米蛋白粉轉基因檢測難點主要集中在核酸提取問題上，玉米在加工過程中經過一系列物理或化學試劑處理后DNA 受到不同程度的破壞，且雜質含量高，這就造成了提取DNA 過程中要面臨核酸濃度極低和嚴重不純的問題，現(xiàn)有檢驗標準及試劑盒的提取方法對玉米飼料產品的核酸提取均具有局限性（假陰性問題），無法滿足出口檢驗要求，因此，如何在現(xiàn)有的檢驗方法基礎上更有效地檢測出轉基因成分已成為研究重點。本研究基于口岸進出口飼料產品轉基因檢測需要，針對性探討了適合于該類樣本的核酸提取方法，旨在為飼料、飼料添加劑等產品的轉基因檢測工作提供質量穩(wěn)定、適合下游多種檢測方式的核酸樣本。

1 材料與方法

1.1 原料及試驗樣品

1.1.1 試驗樣品 原料玉米在溫度為（50±2）℃的環(huán)境下，經過濃度為0.07%～0.18%的亞硫酸浸泡（浸泡時間≥26 h），浸泡后進行破碎、胚芽分離、精磨，精磨后得到精漿液，精漿液經過分離、濃縮離心、干燥得到含水量為55%～60%的產品，即為玉米蛋白粉。

本試驗所采用樣品均來自飼料加工廠，樣品狀態(tài)穩(wěn)定。提取DNA 所用玉米蛋白粉為經60 ℃烘箱4 h后的干制粉末，核酸提取前使用密閉法對樣品進行分裝，以保證樣品的準確性和穩(wěn)定性。送檢12 批次樣品均來自日常風險監(jiān)測的玉米蛋白粉。

1.1.2 標準品 ERM-BF413ak MON 810 MAIZE blank、ERM-BF413ck MON 810 MAIZE （level 1-nominal 0.5 % GMO）均購自歐洲委員會標準物質和測量研究院。

1.2 主要試劑

1.2.1 核酸試劑盒 7 種市售試劑盒如表1所示。

表1 市售7種試劑盒信息Table1 Information of seven commercially available kits

1.2.2 反應試劑 Premix Ex TaqTM（Probe qPCR，TaKaRa 公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，Sigma-Aldrich 公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，Sigma-Aldrich 公司）；三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇等試劑（國藥集團化學試劑有限公司）均為分析純或生化級試劑；實驗用水均為超純水。

1.2.3 引物探針 引物及探針合成、標記均為TaKaRa 公司產品，引物及探針序列根據SN/T1204-2016[3]標準中zSSIIb基因、MON810 特異性序列進行檢測。

1.3 方法

1.3.1 樣品中DNA 提取 ①對照試劑盒法：按照各核酸提取試劑盒說明書的方法進行試驗樣品中DNA 提取,提取的過程注意防止交叉污染。其中樣品量為每個試劑盒提取10×100 mg 樣品，在DNA 富集步驟中進行合并，最后統(tǒng)一用80 μL 雙蒸水進行洗脫，獲得樣品DNA。

②對照CTAB 法：稱取1 g 樣品干粉，按照農業(yè)部 1485 號公告-4-2010[4]提取 DNA，用 80 μL 雙蒸水溶解DNA。

③改良SDS-CTAB 提取法：稱取1 g 樣品干粉，置于50 mL離心管中，加入6 mL的SDS裂解液（2.5%SDS，0.5%PVP，1 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）10 mmol·L-1β-巰基乙醇。）充分震蕩混勻；置于電熱恒溫水槽中65℃ 溫育90 min，每隔5～10 min 混勻1 次；加入 3 mL 5 mol·L-1KAC（pH 6.0），并置于0 ℃冰浴 20 min；加入 2 mL CTAB 裂解液[2%CTAB，1.4 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）]，混 勻 ，65 ℃水浴30 min；加入6 mL 25∶24∶1 的苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液，置搖床上充分混勻后靜置10 min；13 000 g 離心 20 min 后，取全部上清液至新的50 mL 離心管中；重復抽提2次，轉移至新的10 mL 離心管中；加入1/3 體積預冷的異丙醇，混勻后-20 ℃ 放置4 h；25 ℃，13 000 g 離心20 min，棄上清，轉移至新的2 mL 離心管中；1.5 mL 無水乙醇洗滌沉淀2 次，每次10 min，通風柜風干沉淀1 h；加 80 μL 雙蒸水，37 ℃水浴 30 min 溶解 DNA后置4 ℃冰箱備用。

1.3.2 DNA 質量檢測 取 2 μL 提取的 DNA 用Denovix DS-11+測定其濃度、A260/A280和A260/A230的比值，以評估提取DNA 的質量和雜質去除情況。

1.3.3 實時熒光PCR 反應體系及程序 實時熒光 PCR 采用 25 μL 的總體系：Premix ExTaq（2×）12.5 μL；ROX Reference Dye II（2×）0.25 μL；上、下游引物（10 μmol·L-1）各 1 μL；探針(10 μmol·L-1)1 μL；DNA 模板4 μL，用無菌水補至總體系為25 μL。每個樣品設4 次重復，PCR 擴增反應及結果分析在ABI 7500 實時熒光PCR 儀上進行。反應程序為：95 ℃ 預變性 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，45個循環(huán)。

1.3.4 實驗室送檢玉米蛋白粉樣品轉基因成分檢測 采用改良SDS-CTAB 提取方法對實驗室送檢的12 批次玉米蛋白粉樣品提取DNA。利用實時熒光PCR 方法對樣品進行轉基因成分檢測，考慮到外源啟動子、終止子容易污染的問題，直接擴增內源zSSIIb基因和MON810 品系特異性基因，擴增體系和程序同1.3.3；同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法結果比較

分別用市售試劑盒法、CTAB 法和改良SDS-CTAB 法對玉米蛋白干粉進行DNA 提取并用核酸蛋白分析儀進行DNA 含量的測定。如表2和圖1 所示，類似玉米蛋白粉這種深加工的飼料產品,采用一般提取方法提取的DNA 含量很低[5]，市售7 種試劑盒方法和普通CTAB 法A260/A280、A260/A230比值比較發(fā)現(xiàn)，均存在嚴重的蛋白質污染，這基本符合樣本本身蛋白質為主要成分的結構特點，但從DNA 濃度和純度分析發(fā)現(xiàn)，試劑盒法和CTAB 法均無法滿足轉基因檢測的需要，后續(xù)的實時熒光PCR 實驗也驗證了這點，內源基因zSSIIb Ct值最小為35.23，無法滿足日常轉基因檢測需要[6]。在同樣樣品量，均用80 μL 雙蒸水溶解DNA 的前提下，本研究采用改良SDS-CTAB 法獲得的DNA 濃度和純度均比較理想，蛋白質、多糖等雜質含量較少。改良SDS-CTAB 法內源基因zSSIIb Ct值為28.14，較CTAB 法降低了27%，說明改良SDS-CTAB法在提取玉米蛋白粉DNA質量方面具有明顯優(yōu)勢。

圖1 3種方法提取玉米蛋白粉DNA使用zSSIIb基因擴增曲線Fig 1 Amplification of zSSIIb gene for corn gluten meal DNA extracted by three methods

表2 3種方法提取玉米蛋白粉DNA的濃度和純度以及zSSIIb 基因擴增結果Table 2 DNA concentration and purity and amplification of zSSIIb gene for corn gluten meal DNA extracted by three methods

2.2 實驗室送檢玉米蛋白粉樣本檢測結果

利用建立的改良SDS-CTAB 法提取7 批次實驗室送檢玉米蛋白粉樣品中DNA 成分，并對其玉米內源基因zSSIIb、外源MON810品系特異性基因進行實時熒光PCR 擴增，擴增結果見圖2 和表3。結果表明：7 批送檢玉米蛋白粉樣品均可檢出玉米內源基因zSSIIb，Ct值均在29～31之間，其中2批次玉米蛋白粉樣品種可檢出外源MON810品系特異性基因，Ct值在35 左右，重復驗證后結果一致，說明2 批次樣品含有轉基因玉米成分，同時表明建立的改良SDS-CTAB 法可有效用于日常轉基因檢測。

表3 SDS-CTAB法提取玉米蛋白粉DNA 使用MON810檢測結果Table 3 Detection for MON810 for corn gluten meal DNA extracted by SDS-CTAB methods

圖2 改良SDS-CTAB提取玉米蛋白粉DNA使用MON810擴增曲線Fig 2 Amplification of MON810 for corn gluten meal DNA extracted by modified SDS-CTAB methods

3 討論

隨著基因工程技術的高速發(fā)展，世界范圍內轉基因產品的數量和種類不斷增加。飼料中成分復雜,包含了當今主流的轉基因產品。與單一植物轉基因成分檢測相比，對飼料轉基因成分的檢測難度更大[7]。玉米蛋白粉是由玉米籽粒經過一系列物理或化學試劑處理后加工而成的深加工植物產品，在這些加工過程中DNA 受到不同程度的破壞[8]，同時玉米蛋白粉中蛋白質成分高達60%以上，進而造成了DNA 提取過程中要面臨核酸濃度極低和嚴重不純兩個主要問題。本試驗采用一般的CTAB 法和市售試劑盒法對玉米蛋白粉樣品進行處理后，發(fā)現(xiàn)提取的DNA 無法滿足下游需要，含量較低且蛋白質污染嚴重；而且，因為樣品核酸含量極低，一般的0.1～0.2 g 提取量顯然無法滿足要求，而加大樣品初始量，一般試劑盒法則大多需要合并和反復富集，時間有時會延長到2～3 h?，F(xiàn)有進出境產品轉基因檢驗中均采用CTAB 法，國內外文獻中對SDS-CTAB 法報道也較少，且多應用于植物及微生物DNA 提取中，本研究建立的改良SDS-CTAB 法在國內外尚屬首次應用于飼料轉基因產品中。本研究改良后的SDS-CTAB 法可以充分發(fā)揮SDS 與蛋白質結合成復合物釋放核酸以及CTAB 能與核酸形成穩(wěn)定復合物的雙重特性[9-11]，但是由于采用異丙醇和高濃度鹽沉淀DNA，為了不影響下游實驗，本研究采用差速離心、不同溫度條件等修正措施。此外，PVP 一般用于提取木本植物的DNA，防止植物細胞中的多酚類物質氧化，較少用于草本植物。研究表明，PVP 也具有去除多糖的效果[12-14]，且對下游PCR 實驗有一定的穩(wěn)定促進作用[15]，但高濃度PVP 會降低DNA 產出效率，因此最終選擇文中濃度。本研究建立的改良SDS-CTAB 法，可以結合SDS 和CTAB 自身的優(yōu)勢特點，有效去除蛋白質、多糖等污染成分，對下游PCR 抑制較小，可以基本滿足日常進出口玉米蛋白粉樣品的轉基因檢測，并且大大降低了“假陰性”率，但是耗時較長，全程8～10 h。在快速通關的背景下，進一步優(yōu)化程序，縮短檢測時間將是下一步的主要研究重點。