肖榮， 魏云曉， 王遠(yuǎn)， 孟志剛， 梁成真， 陳全家， 張銳*

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花教育部工程研究中心，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

棉花不僅是紡織工業(yè)原料，還是重要的戰(zhàn)略物資。2020 年我國原棉消費(fèi)和棉花生產(chǎn)分別占世界市場的32%和23%，是世界上最大的原棉消費(fèi)國和第二大棉花生產(chǎn)國，因此，棉花在我國的國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位[1]。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育成功并大規(guī)模投入生產(chǎn)后，基因工程育種在棉花上獲得了廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)已獲得轉(zhuǎn)基因抗病、抗蟲、抗除草劑、高產(chǎn)、耐旱、耐鹽、營養(yǎng)高效等特性的轉(zhuǎn)基因棉花，促進(jìn)了棉花品種選育和棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。同時，隨著功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展和基因編輯技術(shù)在育種中的廣泛應(yīng)用，遺傳轉(zhuǎn)化的需求進(jìn)一步擴(kuò)大，尤其是高效率的無基因型限制的遺傳轉(zhuǎn)化方法[3]。

棉花的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、花粉管通道介導(dǎo)法和莖尖轉(zhuǎn)化法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)化方法，其利用農(nóng)桿菌侵染植物傷口后進(jìn)入細(xì)胞，將T-DNA 插入到植株基因組中，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化，該方法具備外源DNA 片段完整性好、遺傳穩(wěn)定好等優(yōu)點(diǎn)，但轉(zhuǎn)化周期較長，一般需要約8個月的時間才可獲得轉(zhuǎn)基因植株，這極大地延長了基因功能驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，進(jìn)而延緩了棉花新材料創(chuàng)制的時間；此外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因受基因型限制，極大地阻礙了部分棉花性狀功能驗(yàn)證的進(jìn)度，如棉花恢復(fù)基因的驗(yàn)證，需首先將目的基因?qū)朊藁ㄊ荏w材料，然后利用轉(zhuǎn)基因植株和恢復(fù)系雜交后代篩選含有目的基因的恢復(fù)系進(jìn)一步驗(yàn)證基因功能，因此比一般基因驗(yàn)證歷程增加了一代時間[4-9]。基因槍轟擊法是隨著新型技術(shù)發(fā)展起來的轉(zhuǎn)化方法，其利用外源DNA 吸附或包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。該方法具備轉(zhuǎn)化時間短、無宿主限制等優(yōu)點(diǎn)，但基因槍法轉(zhuǎn)化頻率低、所需設(shè)備昂貴、整合過程中易發(fā)生重排和高拷貝插入等現(xiàn)象，因而應(yīng)用受限[10-15]。花粉管通道法最早由我國科研人員周光宇提出，可用于任何開花植株，但目前僅在棉花上應(yīng)用比較普遍。其利用開花植物授粉后形成的花粉管通道，直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵細(xì)胞、合子細(xì)胞或早期胚胎細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化。該方法具備不需組培過程、無基因型限制等優(yōu)點(diǎn)，但受季節(jié)和環(huán)境條件限制，且依賴操作人員的經(jīng)驗(yàn)，因此難以廣泛推廣[16-19]。

棉花莖尖轉(zhuǎn)化原理與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法一致，利用農(nóng)桿菌侵染傷害處理的莖尖進(jìn)入細(xì)胞，將T-DNA 插入到植株基因組中，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化，二者區(qū)別在于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使用外植體為棉花下胚軸，莖尖轉(zhuǎn)化法使用外植體為棉花莖尖。棉花莖尖因不經(jīng)過組織培養(yǎng)階段，轉(zhuǎn)化周期短，簡單快速，是一種較理想的棉花基因轉(zhuǎn)化外植體，而且棉花莖尖培養(yǎng)時使用的是完整的分生組織，其再生相對容易，且能有效地用于基因轉(zhuǎn)化，因而莖尖分生組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化相結(jié)合可以開辟一條簡便、高效、直接的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系[20-29]。呂素蓮等[30]采用莖間轉(zhuǎn)化法將膽堿脫氫酶基因betA和突變的乙酰乳酸合成酶基因als導(dǎo)入3 個棉花優(yōu)良品種中，獲得抗除草劑氯磺隆和耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植株及其子代。Katageri 等[31]采用莖尖轉(zhuǎn)化法將抗蟲基因?qū)胗《汝懙孛奁贩N中。但是前人報(bào)道的莖尖轉(zhuǎn)化法存在轉(zhuǎn)化后代外源基因容易丟失、遺傳不穩(wěn)定的現(xiàn)象，限制了該方法的廣泛使用[32]。目前鮮有關(guān)于探究莖尖法轉(zhuǎn)基因棉花植株真實(shí)性鑒定方法的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用非T-DNA片段（載體骨架）PCR、靶基因RT-PCR、內(nèi)生菌培養(yǎng)及檢測、16S rRNA 片段PCR 等方法對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，旨在建立一套完整的莖尖法轉(zhuǎn)基因棉花植株真實(shí)性的鑒定方法，以期為進(jìn)一步深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

陸地棉TM-1 用于莖尖轉(zhuǎn)化法，陸地棉WC 用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，種子均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所棉花生物技術(shù)育種團(tuán)隊(duì)提供。DsRed2 載體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)金雙俠教授饋贈[33]。所用引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成?？侱NA 提取、PCR試劑及試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 棉花莖尖轉(zhuǎn)化法及莖段轉(zhuǎn)化法

1.2.1 外植體準(zhǔn)備 莖段準(zhǔn)備：將WC 種子在種苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，將下胚軸切成約5～8 mm 莖段，用于轉(zhuǎn)化（圖1A）。莖尖準(zhǔn)備：選取飽滿的TM-1 種子，用75%酒精清洗1 min，30%過氧化氫（H2O2）消毒1.5 h，無菌水清洗3～5 遍后用無菌水浸泡，放置于培養(yǎng)室過夜至種子露白。然后將種子播種于種苗培養(yǎng)基（1/2 MS 培養(yǎng)基）上培養(yǎng)1～2 d，最后將無菌苗切去子葉，剝出莖尖，用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（圖1C）[4,12-13]。

1.2.2 菌液侵染 取-80 ℃保存的菌液，置于冰上緩慢融化，在固體LB 培養(yǎng)基上劃線，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落，接種于2 mL 含有抗生素的液體LB 培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r·min-1搖床上培養(yǎng)過夜。再將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物（200 μL）轉(zhuǎn)入到含有抗生素的液體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 ℃、200 r·min-1，過夜培養(yǎng)至對數(shù)期。搖菌，5 000 r·min-1離心 10 min。棄上清，1/2 MS 稀釋沉淀至OD值為0.5。最后使用配置好的菌液浸泡莖尖/莖段20 min，將莖尖/莖段放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MSB培養(yǎng)基）2 d（圖1D）[4，12-13]。

1.2.3 轉(zhuǎn)化體篩選及培養(yǎng) 將莖尖繼代至篩選培養(yǎng)基（MSB 培養(yǎng)基+卡那霉素 50 mg·L-1），20 d 繼代一次（圖1E）。待分化幼苗長根后繼代至長苗培養(yǎng)基（MSB 培養(yǎng)基+IAA 激素 0.1 mg·L-1），20 d繼代一次（圖1F）。

圖1 棉花轉(zhuǎn)化流程Fig.1 Cotton transformation process

1.3 轉(zhuǎn)基因植株篩選及檢測

取轉(zhuǎn)基因植株幼苗時期的葉片及愈傷組織，按照植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]操作說明進(jìn)行基因組DNA 提取。使用靶基因、非 T-DNA、16S rRNA 片段引物（表1）進(jìn)行PCR 檢測。PCR 反應(yīng)體系：Mix 10 μL，正反向引物各 1 μL（10 μmol·L-1），DNA 模板 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。熒光定量PCR（RT-PCR）：分別提取轉(zhuǎn)基因植株葉片RNA，RNA 提取采用TIANGEN 試劑盒提取，并參照試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

表1 篩選引物序列Table 1 Screening primer sequence

1.4 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)生菌培養(yǎng)及檢測

本實(shí)驗(yàn)分別選取6株靶基因PCR 陽性植株及對照TM-1 的3 片葉片研磨加無菌水，吸取10 μL于卡那霉素抗性培養(yǎng)基上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)內(nèi)生菌。3 d后，6株植株的葉片周圍長出菌落，對照無菌落出現(xiàn)，然后分別選取6 株植株對應(yīng)的單菌落進(jìn)行DsRed2基因和非T-DNA片段PCR檢測，具體檢測方法同1.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 DsRed2基因PCR陽性植株檢測結(jié)果分析

2.1.1DsRed2基因及表達(dá)量檢測 本實(shí)驗(yàn)利用莖尖轉(zhuǎn)化法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將DsRed2 載體轉(zhuǎn)入棉花受體材料TM-1 和WC，經(jīng)卡那霉素篩選培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化苗及愈傷，利用DsRed2基因片段PCR 及熒光檢測初步鑒定陽性植株。將DsRed2載體轉(zhuǎn)入75 個莖尖，經(jīng)過篩選培養(yǎng)，最終獲得41株植株，其中 10 株長勢健壯，6 株長勢一般，25 株長勢較弱（圖2A），將16 株長勢較好的植株煉苗后移栽至營養(yǎng)缽中用于DsRed2基因片段PCR 檢測，結(jié)果顯示其中6株植株條帶明亮，為陽性。同時，將DsRed2 載體轉(zhuǎn)入受體材料WC，經(jīng)過篩選培養(yǎng)，將獲得愈傷用于靶基因片段PCR 檢測，得到193 bp 的條帶（圖2B），表明6 株莖尖轉(zhuǎn)化植株及愈傷均含有DsRed2基因片段。由于DsRed2基因翻譯表達(dá)紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP），在紫外線的照射下可發(fā)射紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)采用紫外照射6 株植株和愈傷組織，以TM-1 為陰性對照，結(jié)果顯示6 株植株表現(xiàn)與TM-1 一致，均無紅色熒光（圖2D、E），愈傷組織在紫外照射下發(fā)出紅色熒光（圖2F），表明6 株莖尖轉(zhuǎn)化植株無RFP的表達(dá)，愈傷組織有RFP的表達(dá)。

此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對6 株植株和愈傷組織進(jìn)行靶基因表達(dá)量的檢測，并以農(nóng)桿菌液為陽性對照，結(jié)果顯示愈傷組織與陽性對照一致為陽性，6 株植株均無擴(kuò)增條帶（圖2C），表明6 株靶基因PCR 陽性株無紅色熒光基因表達(dá)，導(dǎo)致無表型現(xiàn)象。

圖2 DsRed2基因及表達(dá)量檢測Fig.2 Detection of DsRed2 gene and expression

2.1.2 靶基因PCR 陽性株表達(dá)載體PCR 檢測農(nóng)桿菌通過侵染植株傷口后，一般解旋酶VirD1和核酸酶VirD2可將表達(dá)載體上的T-DNA 區(qū)域切割，隨后T-DNA 進(jìn)入植物細(xì)胞并插入到基因組中，而非T-DNA 片段則遺留在細(xì)胞外。2.1.1 結(jié)果顯示莖尖轉(zhuǎn)化法獲得6 株植株靶基因檢測為陽性，但無紅色熒光表現(xiàn)，推測植株存在完整表達(dá)載體，但T-DNA 片段并未完成基因組的整合，導(dǎo)致基因無表達(dá)且無表型。為進(jìn)一步證明以上推測，本實(shí)驗(yàn)在DsRed2 表達(dá)載體非T-DNA 片段的pVS1RepA和StaA兩處分別設(shè)計(jì)兩對引物，對 6 株植株和愈傷組織進(jìn)行檢測，并以表達(dá)載體農(nóng)桿菌液為陽性對照。結(jié)果顯示，6 株植株與陽性對照顯示大小一致的條帶（圖3），而愈傷組織與陰性對照一致，無擴(kuò)增條帶，表明6 株植株的DsRed2表達(dá)載體完整地存在于植株中，而愈傷組織基因完成了靶基因的插入且無完整表達(dá)載體的遺留現(xiàn)象。

圖3 靶基因PCR陽性株表達(dá)載體PCR檢測Fig.3 PCR detection of positive strain expression vector

2.2 靶基因PCR陽性株內(nèi)生菌檢測

2.1 結(jié)果顯示表達(dá)載體完整存在于6 株靶基因陽性株內(nèi)，故推測在遺傳轉(zhuǎn)化過程中農(nóng)桿菌由于侵染與植株共生形成內(nèi)生菌，導(dǎo)致完整表達(dá)載體的遺留現(xiàn)象。為進(jìn)一步證明以上推測，本實(shí)驗(yàn)對6 株植株進(jìn)行了內(nèi)生菌培養(yǎng)及檢測。內(nèi)生菌培養(yǎng)結(jié)果表明對照無菌落，6 株植株葉片分別長出菌落（圖4A、B）。實(shí)驗(yàn)以表達(dá)載體農(nóng)桿菌液為陽性對照，結(jié)果顯示，6 個菌落表現(xiàn)與陽性對照大小一致的條帶，靶基因片段為193 bp，非T-DNA 片段為449 bp（圖4C、D），表明6 株植株的內(nèi)生菌中存在完整的DsRed2表達(dá)載體。

圖4 靶基因PCR陽性株內(nèi)生菌檢測結(jié)果Fig.4 Endophyte detection results of target gene PCR-positive strains

2.3 靶基因PCR陽性株16S rRNA檢測

16S rRNA 是細(xì)菌編碼rRNA 相對應(yīng)的DNA序列，存在于細(xì)菌的基因組中，序列結(jié)構(gòu)保守[35]。結(jié)果顯示，靶基因陽性植株的內(nèi)生菌中存在完整的DsRed2 表達(dá)載體，為進(jìn)一步檢測內(nèi)生菌為農(nóng)桿菌，本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌的16S rRNA 序列設(shè)計(jì)兩對引物，分別對6 株植株和愈傷組織進(jìn)行檢測，以載體農(nóng)桿菌液為陽性對照，結(jié)果顯示愈傷組織無擴(kuò)增條帶，6 株植株和陽性對照表現(xiàn)大小一致的條帶（圖5），初步推測內(nèi)生菌包括攜帶完整載體的農(nóng)桿菌，推測在莖尖侵染時，農(nóng)桿菌進(jìn)入并遺留于植株中，進(jìn)而造成假陽性株的現(xiàn)象。

圖5 16S rRNA PCR結(jié)果Fig.5 16S rRNA PCR results

3 討論

莖尖遺傳轉(zhuǎn)化法具備轉(zhuǎn)化周期短、簡單快速的優(yōu)點(diǎn)，但由于獲得的轉(zhuǎn)基因植株后代外源基因容易丟失，給后續(xù)的研究工作造成很大的困難，限制了其廣泛運(yùn)用[20-32]。此外，植物內(nèi)生菌主要是指其生活史的某一階段生活在植物組織內(nèi)，使植株不發(fā)病或暫時不表現(xiàn)出癥狀的一類微生物。由于環(huán)境原因，致病菌能在植物體內(nèi)大量存在但不使植物發(fā)病，與寄主建立一定協(xié)作關(guān)系，從外源菌轉(zhuǎn)變?yōu)橹参飪?nèi)生菌[34-35]。本實(shí)驗(yàn)對莖尖轉(zhuǎn)化法獲得的靶基因PCR 陽性株進(jìn)行了系統(tǒng)的驗(yàn)證，提出了一套完整的假陽性株鑒定方法，首先通過DsRed2基因PCR 檢測篩選獲得6 株陽性株，但經(jīng)紫外照射均無紅色熒光表現(xiàn)，且RT-PCR 檢測6個轉(zhuǎn)基因植株中僅有極低量的表達(dá)或無表達(dá)。為證明表達(dá)載體是否完整存在于植株中，實(shí)驗(yàn)對植株進(jìn)行表達(dá)載體非T-DNA 片段PCR，結(jié)果為陽性。利用植株內(nèi)生菌檢測和農(nóng)桿菌16S rRNA 片段PCR 的方法，證明植株中含有包含完整載體的內(nèi)生菌，且內(nèi)生菌經(jīng)農(nóng)桿菌16S rRNA片段PCR檢測結(jié)果為陽性，推測二者由于侵染造成共生關(guān)系，進(jìn)而造成假陽性株的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步解釋了莖尖轉(zhuǎn)化假陽性植株存在的原因，由于遺傳轉(zhuǎn)化過程中農(nóng)桿菌侵染植株，導(dǎo)致農(nóng)桿菌與植株形成協(xié)作關(guān)系，從致病菌轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)生菌。然而農(nóng)桿菌與幼苗共生的這段時間，農(nóng)桿菌是否會對與之共生的幼苗生長產(chǎn)生影響，攜帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌是否會產(chǎn)生不同的影響等問題，均需要進(jìn)一步探究。

本實(shí)驗(yàn)初步確定由于攜帶完整載體的農(nóng)桿菌遺留在植株中，進(jìn)而造成莖尖轉(zhuǎn)化法假陽性株的現(xiàn)象。為減少以上假陽性植株的現(xiàn)象，未來可進(jìn)一步設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中頭孢等殺菌劑劑量梯度，探尋最適宜的殺菌劑劑量，使得殺菌劑在殺死農(nóng)桿菌的同時不影響幼苗生長，以此減少或排除農(nóng)桿菌的遺留。此外，由于本實(shí)驗(yàn)只檢測了轉(zhuǎn)化植株中長勢健壯及一般的幼苗，結(jié)果顯示均為假陽性苗，推測莖尖轉(zhuǎn)化法中長勢較快、較好的單株為真陽性苗的幾率較小。而長勢較快幼苗一般由侵染時傷害較小的莖尖發(fā)育而來，相反長勢較弱幼苗一般由侵染時傷害較大的莖尖發(fā)育而來，推測增加莖尖傷害可提高農(nóng)桿菌侵染效率。