袁鈺涵， 樊佳麗， 楊文竹， 陳茹梅*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；2.集寧師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000

葉色突變是一種頻率高、易識(shí)別的遺傳現(xiàn)象，突變?cè)谥参锷L(zhǎng)的任何一個(gè)階段均可能對(duì)植物的發(fā)育造成影響。相關(guān)研究表明，大多數(shù)葉色突變與葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能變異[1-3]、葉綠素生物合成和降解機(jī)制[4]、血紅素生物合成[5-6]、光合作用[7]以及葉綠體發(fā)育相關(guān)[8-10]。因此，葉色突變體不僅可作為雜交育種的標(biāo)記，還可用于研究光合作用、葉綠素合成、葉綠體發(fā)育等相關(guān)過(guò)程，具有廣泛的研究和應(yīng)用潛力。目前研究人員己在多種農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了葉色突變體，并對(duì)其展開(kāi)了表型鑒定、遺傳分析、基因的定位和克隆等研究。

在早期的葉色研究中，Gustaffsson[11]結(jié)合大量的表型數(shù)據(jù)，根據(jù)植物葉色將葉色突變體分為5種類(lèi)型，分別為白化、黃化、淺綠、條紋和斑點(diǎn)；隨后Awan 等[12]將植物葉色突變體進(jìn)一步細(xì)化分類(lèi)為黃化、綠黃、黃綠、淺綠、白化、白翠、綠白和條紋8 種類(lèi)型。由于光照、溫度、濕度以及土壤環(huán)境等外界因素也會(huì)影響植物的葉色變化，因此根據(jù)影響因素的不同，又將對(duì)光信號(hào)和外界溫度敏感的葉色突變體分別命名為光敏型[13-14]和溫敏型[15]。此外，基于生理特性差異，F(xiàn)albel 等[16]以葉綠素為指標(biāo)又將葉色突變體分為4 種類(lèi)型，即總?cè)~綠素增加型、總?cè)~綠素缺乏型、葉綠素a 缺乏型和葉綠素b缺乏型。

近年來(lái)隨著全球人口的增加、農(nóng)業(yè)耕地面積的短缺和氣候變化，人們對(duì)糧食作物的產(chǎn)量、抗逆性提出了更高的要求[17-19]。而如何提高植物光合效率，生成更多的生物量，是解決世界糧食安全問(wèn)題的關(guān)鍵。玉米作為世界上最重要的糧食作物之一，其種類(lèi)繁多，種植廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年我國(guó)玉米種植面積和產(chǎn)量均居于三大作物之首。因此提高玉米光合作用能力是增加玉米產(chǎn)量，減少損失，解決糧食問(wèn)題的有效途徑之一。而葉色突變體則因其特殊的產(chǎn)生機(jī)制，成為研究光合作用、葉綠體發(fā)育以及葉綠素合成等相關(guān)途徑的理想材料。目前關(guān)于玉米葉色突變體的研究仍處于遺傳分析和基因定位的階段，在玉米數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.maizegdb.org）中已報(bào)道了約200 多個(gè)與玉米葉色相關(guān)的基因或QTL 位點(diǎn)，分布在玉米10條染色體上[20]。如從玉米自交系Ye478 和Yuanwu02的雜交后代中分離得到的黃綠葉突變體ygl-1，該突變體在所有生長(zhǎng)階段均呈現(xiàn)黃綠葉表型，與野生型相比，其葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的含量顯著降低，葉綠體的發(fā)育異常，光合作用的能力減弱。通過(guò)基因圖譜的克隆，研究人員獲得了編碼葉綠體信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白（cpSRP43）的ZmYGL1基因，該基因突變導(dǎo)致植物前質(zhì)體發(fā)育異常，進(jìn)而影響了葉綠素的合成，證明了YGL1基因在玉米葉綠體發(fā)育中有至關(guān)重要的作用[21]。

本研究由甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate，EMS）處理后的不同玉米誘變?nèi)后w中篩選到的2 株黃葉突變體yl-1、yl-2以及從玉米自交系鄭58（Z58）中發(fā)現(xiàn)的1株自然黃葉突變體yl-3等3個(gè)表型相似的玉米黃葉突變體為試驗(yàn)材料，并通過(guò)表型鑒定、光合色素含量測(cè)定、葉綠素前體物質(zhì)含量測(cè)定等分析其生理特征，以期為進(jìn)一步研究玉米葉綠素代謝及光合作用的遺傳和分子機(jī)制、突變基因的定位和克隆以及玉米高光效種質(zhì)資源挖掘與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

yl-1（Z58 背景）與yl-2（B73 背景）來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的玉米EMS 誘變突變體庫(kù)，yl-3是在玉米自交系Z58 中發(fā)現(xiàn)的自然突變體。3 個(gè)突變體均經(jīng)多代自交，黃葉表型遺傳穩(wěn)定。對(duì)照材料為玉米自交系Z58與B73。

突變體和對(duì)照的部分材料在大田中種植，鑒定表型并于大喇叭口期取樣分析葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素含量；另一部分材料在溫室中催芽并移盆培養(yǎng)，于出苗2周后取樣測(cè)定葉綠素合成前體物質(zhì)。

1.2 葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素測(cè)定

參 考 Lichtenthaler 等[22]、Zhou 等[23]的 測(cè) 量 方法，取突變體與對(duì)照新鮮葉片，去中脈，剪成2～3 mm 的小碎片，稱(chēng)取 0.1 g 于 2 mL 離心管中，加入抽提 Buffer（無(wú)水乙醇∶丙酮∶H2O=4.5∶4.5∶1）2 mL，4 ℃避光抽提 12～24 h。10 000 r·min-1離心5 min，取上清適當(dāng)稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛扔?jì)UV-2802 測(cè)定 470、646 和 663 nm 這 3 個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度值，以抽提Buffer 為空白對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)公式（1）（2）（3）分別計(jì)算葉綠素a（Chl a）、葉綠素 b（Chl b）以及類(lèi)胡蘿卜素（Car）的含量：

式中，CChla、CChlb、CCar分別表示葉綠素 a、葉綠素b 和類(lèi)胡蘿卜素濃度（mg·g-1）；V：抽提液體積（mL）；n：稀釋倍數(shù)；W：葉片的重量（g）；A470、A646、A645為分光光度計(jì)上讀取的光密度值。

1.3 葉綠素前體物質(zhì)的測(cè)定

1.3.1 δ-氨基乙酰丙酸（delta-aminolevulinic acid，ALA）含量測(cè)定 ALA 測(cè)定參考Dei 等[24]的方法，并略有改動(dòng)。稱(chēng)取0.3 g 新鮮葉片，液氮充分研磨，加入10 mL 4%三氯乙酸，18 000 r·min-1離心10 min，取上清 5 mL 加入 2.35 mL 1 mol·L-1醋酸鈉和0.15 mL 乙酰丙酮，沸水（100 ℃）浴10 min 后冷卻至室溫。取1 mL 溶液與1 mL 顯色劑（Ehrlich-Hg 試劑：1 g 4-二甲氨基苯甲醛溶于30 mL 冰乙酸中，加入9.09 mL 70%的高氯酸，用冰乙酸定容至50 mL，最后加入0.159 g HgCl2）等體積混合，黑暗條件下置于室溫15 min 后測(cè)定553 nm 處的吸光度值（以等體積的4%TCA 緩沖液與Ehrlich-Hg試劑混合作為對(duì)照）。按照公式（5）計(jì)算ALA。

式中：A553為分光光度計(jì)上讀取的光密度值；摩爾消光系數(shù)（MES）為 7.2×104L·mol-1·cm-1；V：抽提液體積（mL）；W：葉片的重量（g）。

1.3.2 膽色素原（porphobilinogen，PBG）含量測(cè)定 PBG含量測(cè)定參考Peng等[25]的方法。稱(chēng)取新鮮葉片0.5 g，液氮研磨后加入5 mL 抽提液（0.6 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.2，0.1 mol·L-1EDTA），充分勻漿后 18 000 r·min-1離心 10 min，取 1 mL 上清液加入等體積Ehrlich-Hg 試劑，黑暗中靜置15 min，然后測(cè)定其553 nm 處的吸光度值。按照公式（6）計(jì)算PBG。

式中，A553為分光光度計(jì)上讀取的光密度值；MES為6.1×104L·mol-1·cm-1；V：抽提液體積（mL）；W：葉片的重量（g）。

1.3.3 原卟啉Ⅸ（Proto-Ⅸ）、鎂原卟啉Ⅸ（Mg-Proto-IX）和原葉綠素酸酯（Pchlide）含量測(cè)定 Proto-Ⅸ、Mg-Proto-IX 與Pchlide 的測(cè)量方法參考Hodgins等[26]。取0.5 g新鮮葉片，液氮研磨后加入5 mL 80%堿性丙酮，充分勻漿后13 000 r·min-1離心15 min，測(cè)定575、590和628 nm處吸光度值，按公式（7）（8）（9）分 別 計(jì) 算 Proto-Ⅸ 、Mg-Proto-IX 與 Pchlide 含 量（mg·g-1）。

式中，A575、A628、A590、A628為分光光度計(jì)上讀取的光密度值；V：抽提液體積（mL）；W：葉片的重量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 SPSS Statistics 26 軟件（IBM）和 Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型分析

利用不同濃度的EMS處理玉米自交系Z58及B73 的花粉，構(gòu)建玉米 EMS 突變體庫(kù)。經(jīng) M1、M2嚴(yán)格套袋自交，從M3群體中篩選出2 株表型類(lèi)似但背景不同的黃葉突變體，分別命名為yl-1（Z58背景）和yl-2（B73 背景），同時(shí)在大田生長(zhǎng)的自交系Z58 群體中發(fā)現(xiàn)了1 株自然突變產(chǎn)生的黃葉突變體，命名為yl-3（Z58 背景）。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，3 個(gè)黃葉突變體從出苗開(kāi)始整株即表現(xiàn)出黃葉性狀（圖1A～C），且植株生長(zhǎng)過(guò)程中始終處于黃化狀態(tài)，不復(fù)綠，且均表現(xiàn)出生長(zhǎng)較慢、發(fā)育遲緩、植株矮小等現(xiàn)象（圖1D～F）。同時(shí)3 個(gè)黃葉突變體的黃化程度呈現(xiàn)明顯差異，yl-3黃化程度最深，yl-2次之，yl-1黃化程度最淺。

圖1 3個(gè)玉米黃葉突變體的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of three maize yellow leaf mutants

2.2 突變體的光合色素含量比較

在大田和溫室條件下，3 個(gè)黃葉突變體均表現(xiàn)為黃色，但黃化程度存在差異。為了揭示這種差異與光合色素的關(guān)系，測(cè)定了成熟期Z58、B73及yl-1、yl-2、yl-3這 3 個(gè)黃葉突變體同一部位的葉片的光合色素含量，如表1所示，與對(duì)應(yīng)的對(duì)照植株相比，3個(gè)黃葉突變體的葉綠素a、葉綠素b的含量均顯著降低（P＜0.05），yl-1葉綠素a、葉綠素b的含量分別為Z58 的59.94%和9.02%，yl-2葉綠素a、葉 綠 素 b 的 含 量 分 別 為 B73 的 12.26% 和3.22%，yl-3葉綠素 a、葉綠素 b 的含量為 Z58 的15.74%和4.17%；同時(shí)3 個(gè)突變體葉綠素a/葉綠素b的比值均顯著提高（P＜0.05），表明葉綠素b的降低程度均高于葉綠素a。3 個(gè)突變體總?cè)~綠素含量均較對(duì)照顯著降低（P＜0.05）；類(lèi)胡蘿卜素與總?cè)~綠素的比值均有提高，yl-1類(lèi)胡蘿卜素/總?cè)~綠素的比值與Z58相比有所升高但差異不具有統(tǒng)計(jì)意義，而yl-2與yl-3與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），且 3 個(gè)突變體葉綠素 a/葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素/總?cè)~綠素相比差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。表明與對(duì)照植株相比，3 個(gè)突變體的葉綠素含量降低，同時(shí)葉色突變影響了類(lèi)胡蘿卜素的合成，導(dǎo)致了黃葉表型的產(chǎn)生，且3 個(gè)突變體各指標(biāo)的變化幅度存在差異，總?cè)~綠素含量、葉綠素a/葉綠素b、總?cè)~綠素/類(lèi)胡蘿卜素差異具有統(tǒng)計(jì)意義，說(shuō)明3 個(gè)黃葉突變體產(chǎn)生黃化突變的原因可能并不相同。

表1 3個(gè)玉米黃葉突變體葉片的光合色素含量及相對(duì)比值情況Table 1 Determination and relative ratio of photosynthetic pigment content in leaves of three maize yellow leaf mutants

2.3 突變體的葉綠素前體物質(zhì)研究

為探究葉綠素合成受阻及3 個(gè)突變體產(chǎn)生黃葉表型的原因，并為進(jìn)一步定位相關(guān)突變基因提供數(shù)據(jù)支持，利用分光光度法測(cè)定了yl-1、yl-2、yl-3以及自交系Z58 和B73 三葉期葉片的ALA、PBG、Proto-Ⅸ、Mg-Proto-IX、Pchlide 這5 種葉綠素前體物質(zhì)的含量。結(jié)果如圖2 所示，ALA 作為葉綠素及血紅素的共同前體在3 個(gè)黃葉突變體中均顯著下降（P＜0.05），可能使四吡咯途徑中的總代謝流減少；yl-1、yl-2中其余4個(gè)中間代謝產(chǎn)物與對(duì)照相比均顯著降低（P＜0.05），與Z58 相比，yl-3中PBG 含量雖有所降低但差異不顯著，Proto-Ⅸ、Mg-Proto-IX、Pchlide 這 3 個(gè)中間代謝產(chǎn)物的含量均顯著降低（P＜0.05）。這與葉綠素含量測(cè)定結(jié)果一致，表明葉綠素合成受阻是導(dǎo)致3 個(gè)突變體產(chǎn)生黃葉表型的直接原因。

圖2 葉綠素合成前體物質(zhì)的測(cè)定Fig.2 Determination of precursor substances for chlorophyll synthesis

2.4 代謝路徑分析

結(jié)合對(duì)葉綠素合成途徑中幾個(gè)中間代謝產(chǎn)物含量測(cè)定的結(jié)果，將突變體表型與其生理特征間的聯(lián)系作圖（圖3）。ALA、Proto-Ⅸ等葉綠素途徑中間代謝產(chǎn)物的顯著降低（圖4），特別是四吡咯化合物的共同前體ALA 顯著降低，表明突變體四吡咯途徑中的代謝流顯著減少，進(jìn)而可能影響了四吡咯途徑終產(chǎn)物葉綠素和血紅素等合成，同時(shí)，3 個(gè)突變體的黃化程度呈現(xiàn)明顯的差異，總?cè)~綠素、類(lèi)胡蘿卜素以及葉綠素合成途徑中相關(guān)中間代謝產(chǎn)物含量的變化程度并不一致，推測(cè)3 個(gè)黃葉突變體的黃葉表型是由不同的基因突變引起的（圖4）。

圖3 3個(gè)黃葉突變體表型與生理特征間的聯(lián)系Fig.3 The relationship between the phenotype and physiological characteristics of three yellow leaf mutants

圖4 葉綠素合成前體物質(zhì)的含量分析Fig.4 Analysis of the content of precursor substances for chlorophyll synthesis

3 討論

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，通過(guò)葉綠素等光和色素轉(zhuǎn)換太陽(yáng)能量。根據(jù)光的折射原理，葉綠素折射綠光而不吸收，植物葉片呈現(xiàn)綠色是葉綠素積累的直接體現(xiàn)。葉色突變體的表型變化往往與葉綠素的含量有直接的聯(lián)系，黃葉突變體植株葉綠素降低使其葉片光合能力及碳同化能力減弱，一般在生長(zhǎng)過(guò)程中較野生型表現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)弱勢(shì)，往往導(dǎo)致植株矮小，最終影響作物的產(chǎn)量。例如玉米黃葉突變體yl1001[27]，其葉綠素降低，突變體在整個(gè)發(fā)育周期呈黃色，生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯弱于野生型植株，同時(shí)不能產(chǎn)生雌雄穗；黃綠葉突變體5941ys[28]的葉綠素降低，植株矮化，株高較野生型顯著降低，且千粒重降低。此外，部分黃化突變會(huì)導(dǎo)致植株死亡，如黃葉突變體xnt7[29]，生長(zhǎng)極其緩慢，三葉期后逐漸死亡。

本研究中，yl-1、yl-2、yl-3這 3 個(gè)玉米黃葉突變體的葉綠素含量在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期均顯著低于野生型，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，株高也顯著降低，同時(shí)類(lèi)胡蘿卜素的變化較小。相關(guān)研究表明植物中葉綠素b 的缺乏會(huì)導(dǎo)致葉綠體內(nèi)囊體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，基粒減少[30]，而血紅素也是葉綠體發(fā)育早期必不可少的[6]。葉綠體發(fā)育不良又反過(guò)來(lái)影響葉綠素的合成，進(jìn)而影響光合效率，使光合作用強(qiáng)度降低。突變體光合能力減弱導(dǎo)致其總體生物量合成減少，株高降低，最終導(dǎo)致作物生物量積累減少，作物減產(chǎn)。

yl-1、yl-2在葉綠素合成途徑的第一階段變化程度較yl-3更顯著，前者ALA 和PBG 含量較野生型均顯著降低，而yl-3的PBG 含量較野生型變化并不顯著，但其Proto-Ⅸ和Mg-Proto-Ⅸ含量的變化趨勢(shì)與yl-1、yl-2并不一致。推測(cè)對(duì)ALA合成有直接影響的相關(guān)催化酶的編碼基因發(fā)生突變導(dǎo)致了yl-1、yl-2的葉綠素合成受阻，產(chǎn)生黃葉表型；而yl-3可能是由于葉綠素途徑第二階段或血紅素分支途徑相關(guān)編碼基因突變導(dǎo)致下游產(chǎn)物合成受阻，進(jìn)而發(fā)生黃化突變。但具體突變的基因及相關(guān)機(jī)理的變化還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究鑒定了3 個(gè)表型類(lèi)似、來(lái)源背景不同的玉米黃葉突變體，這些突變體在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期均表現(xiàn)出黃葉表型，且黃化程度呈現(xiàn)差異。通過(guò)對(duì)光合色素含量的測(cè)定初步確定，與相應(yīng)野生型相比，葉綠素含量顯著下降，不同光合色素含量比例的失調(diào)直接導(dǎo)致3 個(gè)突變體產(chǎn)生了不同程度的黃葉表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)突變體葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但變化幅度存在差異，表明3個(gè)突變體的黃葉表型可能是由不同的基因突變影響了四吡咯化合物的合成所引起的。本研究對(duì)于揭示玉米葉綠素合成機(jī)制具有重要意義，為探究葉綠體發(fā)育及光合作用的機(jī)理提供了參考。