王玉虎， 趙明敏， 鄭紅麗

內蒙古農業(yè)大學園藝與植物保護學院，呼和浩特010019

植物內生固氮菌（endophytic diazotroph）是指與宿主植物進行聯(lián)合固氮并且定殖于植物體內的一類微生物[1]。它們不需要與植物產(chǎn)生結瘤，就可以侵入到宿主植物體內并定殖，可以直接或間接提供植物生長所需要的氮源，除了固氮作用外已經(jīng)被證實的有產(chǎn)IAA、溶磷、產(chǎn)鐵載體、拮抗病原菌等功能，可用于生物防治、促進植物生長等領域。植物內生固氮菌的研究始于20世紀60年代，之后在牧草、甘蔗、水稻等多種作物中均分離出了內生固氮菌。由于內生固氮菌定殖在植物體內，相比于根際和共生固氮菌位置優(yōu)勢更明顯。因此，研究內生固氮菌與植物之間的關系對農業(yè)生產(chǎn)、可持續(xù)發(fā)展等具有重要意義。

1 植物內生固氮菌的發(fā)現(xiàn)

1961 年,D?bereiner 等[2]在嘗試研究甘蔗固氮系統(tǒng)時，首次從根際分離到固氮細菌——拜葉林克氏菌（Beijerinck），這也是研究者首次證實禾本科植物存在生物固氮潛力。D?bereiner 等[3]在1974 年研究了熱帶牧草生物固氮系統(tǒng)，其由固氮螺菌（Azospirillum）和牧草形成，而且還發(fā)現(xiàn)固氮螺菌大多數(shù)聚集在牧草根表，但是有一部分菌株可以穿過根表皮細胞壁侵入到牧草根內部，這些侵入到植物體內的菌不與宿主植物形成特殊的共生組織，而是處于一種沒有表型特征而且松散的共生狀態(tài)，這一現(xiàn)象被稱為聯(lián)合共生固氮作用（associative symbiotic nitrogen fixation），這種固氮類型是介于根際自生固氮和結瘤固氮之間的過渡類型。D?bereiner 團隊還從甘蔗組織內部發(fā)現(xiàn)并分離出固氮菌，因其具有將乙醇氧化成乙酸的能力而且能夠在酸性條件下固氮，所以被命名為醋酸固氮菌（Acetobacter diazotrophicus）。這些菌在甘蔗根和莖中大量存在，并且可以在含糖培養(yǎng)基上表現(xiàn)出最佳生長態(tài)勢，這正是其在甘蔗汁中普遍存在的生長條件[4]，之后又被重命名為固氮葡糖醋桿菌[5]。Helvécio 等[6]采用乙炔還原法測定了2 種熱帶牧草中的固氮酶活性，并用15N 標記證實了植物的固氮能力。1978 年Tarrand 等[7]命名了拜葉林克氏菌屬（Azospirillum lipoferum）和巴西固氮螺菌屬（Azospirillum brasilense）的新型菌株，這2種菌是由D?bereiner 從馬唐屬和小麥中分離出來的。雖然越來越多的固氮菌被分離出來，但是對于固氮菌的劃分一直并未明確。直到1997 年Joséi 等[8]研究了根際、內生、兼性和專性固氮菌，然后根據(jù)固氮菌菌體是否可以侵入植物組織內部并定殖，將固氮菌分為根際固氮菌（rhizosphere diazotrophs）和內生固氮菌（endophytic diazotrophs），之后相繼發(fā)現(xiàn)甘蔗、水稻、玉米、牧草等具有重要經(jīng)濟價值的作物中均存在明顯的生物固氮現(xiàn)象。

植物內生固氮菌能否順利侵入植物體內并定殖是發(fā)生聯(lián)合固氮作用的決定性因素[9]。植物內生固氮菌由于在植物組織內部，相比于根外占據(jù)著更加有利的地位，具有供應營養(yǎng)物質、與病原菌競爭營養(yǎng)和空間、分泌植物生長激素等優(yōu)勢，相較于根外更容易形成高效固氮體系。內生固氮菌與植物的獨特關系和環(huán)境特點潛力，使其成為了一個具有重要意義的研究方向。

2 內生固氮菌與多種作物共生

內生固氮菌根據(jù)其特點不同，又可分為兼性內生固氮菌和專性內生固氮菌2 類。國外在甘蔗上的內生固氮菌相關研究報道較多。1961 年,D?bereiner[2]首先在甘蔗根際分離到大量的Beijerinck屬細菌，并提出了甘蔗聯(lián)合固氮作用（sugarcane associative nitrogen fixation）的概念。隨后陸續(xù)報道在甘蔗的根、莖、葉及根際中分離到了多種固氮細菌。2011 年我國科學家在廣西種植的不同甘蔗品種中分離出內生固氮菌[10]。黃杏等[11]通過采用3 種不同固氮菌的混合菌液接種甘蔗，發(fā)現(xiàn)甘蔗的根系活力、碳水化合物及蛋白質含量均得到明顯提高。羅霆等[12]采用15N 同位素稀釋法證明在接種固氮菌后，甘蔗的固氮量和固氮百分比均得到提高，同時，魏春燕等[13]發(fā)現(xiàn)甘蔗基因型對甘蔗與固氮菌間的聯(lián)合互作有影響。最近，史國英等[14]從廣西甘蔗莖基部組織分離篩選到1 株內生固氮菌株NN08200，其固氮促生效果明顯，有望研發(fā)成為優(yōu)良固氮微生物肥料生產(chǎn)菌種，并可進一步用于甘蔗聯(lián)合固氮菌作用機理的相關研究。

除了甘蔗之外，國內的科學家在水稻和玉米上的內生固氮菌研究報道最多，如丘元盛等[15]在廣東省水稻根分離出來的糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faccalis）。研究者還從水稻上分離到內生陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[16]。華南農業(yè)大學譚志遠團隊[17]在野生稻內生固氮菌方面的研究比較深入，已取得了一系列研究成果。該團隊在普通野生稻、澳洲野生稻、岑溪藥用野生稻、藤縣藥用野生稻中均分離到多種內生固氮菌，并證明這些分離到的菌不僅在遺傳方面具有多樣性，而且還含有一些高固氮酶活性的菌株，可以達到42.52 μmol C2H4·mL-1·h-1。該團隊將普通野生稻分離出的內生固氮菌進行回接實驗，結果表明其能夠顯著促進水稻生長。野生稻不僅是我國的一種重要種質資源，也是寶貴的功能微生物資源庫[18]。在野生稻內已發(fā)現(xiàn)的固氮菌目前有31 個屬74 個種，其中兼性內生固氮菌占絕大部分，并且寄主范圍廣、分布地域全球化。野生稻內生固氮菌存在巨大發(fā)掘空間，現(xiàn)有研究大多集中于其促進生長、抗病害作用等方面。

自從1996 年美國科學家Palus 等[19]從甜玉米莖內分離到可固氮的肺炎克雷伯氏菌（Kelebesilla pneumomiae）以來，此后相繼在玉米的根、莖、葉上分離到內生固氮菌[20]。其中，同一玉米樣品根內生固氮菌的多樣性最高，其次是葉，莖中最低[21]。一些玉米根、莖、葉上分離到的固氮菌株，如L1A1、L1A4、L1B9 和 L2A2 是多功能固氮菌，有研究者對這4 株菌的固氮、溶磷、拮抗、促生等一系列指標進行評價后，將這4菌株接種到小麥上，發(fā)現(xiàn)小麥的農藝性狀有明顯改善，植株更加健壯，幼苗的長勢也更好，并且在一定程度上可以提高小麥的抗干旱能力[22]。覃姚紅等[23]研究表明，玉米種子內生固氮菌對小麥生長及抗旱能力也有促進作用。此外，科學家們在小麥、禾本科牧草、蔬菜、果樹、林木上也分離鑒定出了不同類型的內生固氮菌，并研究了固氮活性及其菌株特性[24-28]，這引起了人們對植物內生生物固氮作用的廣泛關注。

近年來，內生固氮菌在薯類作物上的報道較少。Sessitsch 等[29]用 TRFLP 和 DGGE 技術相結合分析了不同馬鈴薯品種的地上莖、根及塊莖內生細菌的多樣性。Burkholderia vietnamiensisstrain RS1 是從甘薯根部分離獲得的內生固氮菌，其基因組大小為6 542 727 bp[30]?；蚪M中含有固氮基因 nif 基因簇（46.4 kb），由61 個開放閱讀區(qū)組成框架，包括nifQXNEKDHOTSZZBAUVPW 和與nif相關的基因（modACE、fdxBN 和fixAB）。此外，基因組中鑒定出幾個與植物生長促進有關的基因，如產(chǎn)鐵載體基因和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸的降解基因[30]。張磊等[31]從內蒙古武川縣的馬鈴薯根樣品中采用固氮基因nifH擴增方法獲得8 株內生固氮菌，其中3 株為短芽孢桿菌屬（Brevibacterium），3 株為芽孢桿菌屬（Bacillus），2 株為泛菌屬（Pantoea）。目前在不同植物上分離得到的內生固氮菌詳見表1。

表1 不同植物上分離到的內生固氮菌Table 1 Endophytic nitrogen-fixing bacteria isolated from different plants

3 植物內生固氮菌的侵入途徑與定殖

根據(jù)已有研究，植物體內的內生菌來源主要有2 種方式，第1 種是通過種子和塊根、塊莖等無性繁殖材料。這些菌侵入到種子內并且能夠系統(tǒng)地定殖，從種子萌發(fā)一直到植物開花結實始終存在于植物體內，伴隨著植物整個生長周期，且植物與內生菌形成了互利共生的關系，如賽魯普蒂卡草螺菌是前人從水稻的種子內分離得到的[32-33]。第2 種方式是通過根圍和葉圍侵入，以根圍侵入的方式為主。Hallmann 等[32]在分離的棉花內生菌中發(fā)現(xiàn)有82%也存在于根際中并且能夠分離得到。Boddey[34]研究認為，甘蔗固氮菌是通過莖切口進入并且繁殖內生寄生菌。在玉米和其他禾本科牧草的內生固氮菌也多數(shù)來自根圍。Sessitsch等[35]研究了馬鈴薯根、地上莖、塊莖3 個不同部位的內生菌，內生菌多樣性方面健康馬鈴薯植株明顯高于受脅迫植株，并證明內生菌相當一部分起源于宿主植物根際。

種子的內生固氮菌主要通過種皮裂開的縫隙、種臍或者維管系統(tǒng)進入種子內部，并借助種子調運進行遠距離傳播[36]。來源于根圍或葉圍的內生菌侵入寄主植物主要通過植物自然孔口（氣孔、表皮裂隙、皮孔等）、傷口（機械損傷、病害損傷、自然災害損傷等）和根毛。植物根生長的初期因幼根組織較弱，凱氏帶尚未形成，成為固氮菌侵入的最佳時期。根皮層細胞間、葉肉、葉薄壁組織和維管組織中的木質部是內生固氮菌侵入后定殖最多的部位,根（根毛）表皮細胞同樣分布著較多的內生固氮菌[37]。內生固氮菌還可以利用宿主植物體內的分泌物或者其他產(chǎn)物，如重氮營養(yǎng)醋桿菌（Acetobacter diazotrophicus）能夠利用甘蔗細胞間溶液生存并定殖于甘蔗體內，這是因為細胞間溶液的蔗糖濃度和pH比較適合，并且成分接近培養(yǎng)重氮營養(yǎng)醋酸桿菌的培養(yǎng)基。固氮醋酸桿菌的侵入是由根尖和側根的發(fā)生部位開始，它們從根部侵入后進入上皮細胞，從莖部的木質部導管向上傳輸?shù)接啄劢M織和葉肉組織，且能侵入甘蔗根毛形成侵染線樣結構[38]（表2）。也有研究表明，內生固氮菌表面的纖維素酶和果膠酶是可以改變寄主植物細胞膜通透性的，從而引起寄主植物細胞K+外流，細胞間隙溶液的 pH 從 5.5 升高到 7.0～7.5，使寄主植物細胞中蔗糖、氨基酸等營養(yǎng)物質流入細胞間隙，從而為內生固氮菌的定殖創(chuàng)造條件[39]。

表2 幾種代表性內生固氮菌侵入植物的途徑Table 2 Pathway of several representative endophytic nitrogen-fixing bacteria invading plants

據(jù)推測，內生固氮菌定殖前會與植物進行一系列的相互作用，這些作用與根瘤菌和植物特異性結合比較相似。根瘤菌表面產(chǎn)生的多糖可以與豆科植物根系分泌的豆凝素特異性識別，然后結合并吸附在根毛上。某些細菌的表面結構能夠在內生固氮菌侵入過程中起到接觸和識別作用，特別是革蘭氏陰性細菌外膜上LPS的O-抗原特異側鏈在細菌的特異性識別和接觸過程中發(fā)揮重要作用[40]。此外，也有研究者推測內生固氮菌的定殖部位與高效固氮機制是由于內生固氮能夠誘導呼吸系統(tǒng)變化，使環(huán)境中的氧分壓降低，呼吸作用變得更加活躍并且能夠高效固氮。推測是在這種“超誘導”的狀態(tài)下，固氮酶的鐵蛋白在細胞內膜上聚集，與形成的高效固氮功能膜“diazosomes”有關[41]。

圖1 氮從重氮營養(yǎng)體向寄主植物的轉移模型[31]Fig.1 Model for nitrogen transfer from diazotroph to host plant[31]

4 植物內生固氮菌的固氮機理

固氮菌之所以能夠固氮是因為其體內有一種具有特殊功能的蛋白質——固氮酶，而固氮功能與固氮酶結構、調控基因、活性密切相關。

4.1 固氮酶結構及調控基因

固氮酶由固氮基因nif編碼，nif一般存在于細菌的質?；蛘呷旧w上。在固氮菌的基因組中，固氮相關的nif（vnf/anf）基因都是作為一個或幾個基因簇存在的，稱為固氮基因簇（nitrogen-fixationgene cluster），是生物固氮遺傳基礎的核心[42]。人們可利用已知固氮菌nif基因簇中的共有基因簇特征序列，進行篩選發(fā)現(xiàn)新的固氮菌。目前已知的固氮酶包括鉬鐵（MoFe）固氮酶、釩鐵（VFe）固氮酶和鐵鐵（FeFe）固氮酶3 種類型。雖然這3 種固氮酶中所含金屬離子不同，但是這些固氮酶亞型在結構催化機制和系統(tǒng)進化上是相關的[43]。固氮酶由兩部分組成（圖2）:nifH編碼的鐵蛋白（又稱為固氮還原酶）和nifDK編碼的鉬鐵蛋白(又稱為固氮酶)，nifD編碼鉬鐵蛋白的 α 亞基，nifK編碼鉬鐵蛋白的β 亞基[44]。當這2 種蛋白形成一種固氮酶復合物后才具有催化氮還原成氨的能力，單獨任何一個都不具有固氮活性。鐵蛋白負責轉移電子給鉬鐵蛋白，其是1 個由Fe4-S4簇橋連的同源二聚體[45]，包含在2個亞基之間的界面上，通過每個亞基中的2 個半胱氨酸殘基與之結合。鉬鐵蛋白負責鐵蛋白與鐵鉬輔因子之間的電子轉移，它是 1 個 α2β2異四聚體，含有 1 個 P 簇（Fe8-S7）。鐵鉬輔因子是1 個（7Fe-Mo-9S-homocitrate-X）簇，作為底物結合和還原的位點偶聯(lián)Mg-ATP 水解釋放的自由能，鐵蛋白與鉬鐵蛋白共同催化N2還原為NH3的反應。如圖2所示，當鐵蛋白與鉬鐵蛋白互作時，F(xiàn)e 蛋白中的Fe4S4團簇與MoFe 蛋白中的P團簇接近，然后電子被轉移到鐵鉬輔因子，N2分子被還原成NH3分子。整個反應可以寫為式（1）。

圖2 固氮酶復合物（PDB ID 1N2C）三維結構[44]Fig 2 Three dimensional structure of the nitrogenase complex(PDB ID 1N2C)[44]

比較所有測序的固氮菌基因簇表明，至少有6 個保守基因:nifH、nifD、nifK、nifE、nifN和nifB，并且它們都是固氮所必需的[46]，其中，6 個共有基因中至少有3 個位于1 個連續(xù)的區(qū)域內，通常是nifHDK成簇存在；也有nifDK與nifEN相鄰的情況；也有的6 個共有基因位于基因組內的一個單獨區(qū)域內，但是這種情況較少見。

4.2 固氮酶活性調節(jié)機制

在某些固氮光合細菌和固氮螺菌中，固氮活性在代謝水平上受到調節(jié)，這種調節(jié)最早在深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）中發(fā)現(xiàn)，固氮酶活性調節(jié)表現(xiàn)為一種關閉效應（switch-off）。當光關閉或者將效應物（銨離子或谷氨酰胺）添加到固氮培養(yǎng)物中時，固氮酶活性喪失。當光被接通或添加的效應物被代謝，固氮酶活性恢復。在巴西固氮螺菌中能量的關閉效應是由氧氣的去除引起的。在分子水平上，固氮酶活性喪失是由于鐵蛋白亞基之一精氨酸的可逆ADP 核糖基化(圖3)，在深紅紅螺菌中為Arg101。Arg101 位于Fe 蛋白和MoFe 蛋白的相互作用區(qū)域內，因此，修飾在空間上阻礙了兩種蛋白的相互作用，從而無法發(fā)生電子轉移。催化可逆修飾的兩種酶是DraG（dinitrogenase reductase activating glycohydrolase）和 DraT（dinitrogenase reductase ADP-ribosyl transferase）。目前人們對DraG 和DraT 在分子水平上的了解十分有限，關于DraT 的調控知之甚少，但可以確定PII蛋白在響應細胞的氮狀態(tài)時參與了這種調控。PII蛋白構成1 個三聚體蛋白家族，在原核細胞中調節(jié)與氮代謝相關或部分氮代謝的過程。DraG活性調節(jié)已確定與深紅紅螺菌中的色素細胞（質）膜相關[44]。

圖3 DraT和DraG對Fe蛋白的可逆ADP核糖基化作用[46]Fig 3 Reversible ADP-ribosylation of the Fe protein by DraT and DraG[46]

目前，在甘蔗固氮葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）上的研究已經(jīng)十分成熟，在固氮機理、酶和基因等方面的研究比較深入。先前的研究發(fā)現(xiàn)固氮葡糖醋桿菌上的nifA基因位于染色體上，并且對O2和NH4+敏感，該基因的排列和功能與其他固氮菌相似，固氮酶的最適催化pH和最大活性pH 為7.0，并且固定同化的氮是谷氨酰胺（Gln）合成酶催化的。有研究者從固氮酶上分離到結構基因GlnA，并且利用插入突變技術確定了表達調控蛋白的GlnB同源基因（GlnB,Glnk1和Glnk2）的存在，這些調控蛋白能夠感知銨離子濃度，進而調控固氮酶的表達和活性[47]。巴西桿菌的固氮調控模型也已經(jīng)被提出，其中PⅡ蛋白直接或間接地控制了nif基因轉錄激活因子NifA的活性，尿苷化形式的PⅡ蛋白是活性nifA 蛋白所必需的，而且尿苷化形式的PⅡ蛋白是雙功能尿苷轉移酶/尿苷去除酶GlnD 催化的。此外，有研究者利用GlnD突變株證實GlnD 蛋白參與解除NifL 對NifA活性的抑制[48]。

4.3 固氮酶氧保護機制

固氮酶還有一種防止氧傷害的保護機制[49]。固氮作用必須在無氧條件下進行，這是因為固氮酶對氧極其敏感。鉬鐵固氮酶是一種氧敏感酶，氧氣會影響固氮酶活性，但是大多數(shù)固氮菌必須在有氧條件下才能生活，因此固氮菌自身產(chǎn)生了一種保護機制來防止氧損傷固氮酶。目前已經(jīng)明確的固氮酶保護機制，有呼吸保護、構象保護、“雙保險”或調節(jié)機制3種。

4.3.1 呼吸保護 固氮菌屬的許多細菌通過提高自身的呼吸強度迅速耗盡固氮部位周圍的氧，以使固氮酶處于無氧的環(huán)境中從而免受氧的傷害。在呼吸保護中，呼吸鏈的組成部分涉及氰化物敏感的細胞色素帶抗氰化物細胞色素巴酚氧化酶，在高氧條件下固氮酶保護起主要作用。

4.3.2 構象保護 大多數(shù)固氮菌體內均含有一種特殊功能的蛋白質——Fe-SⅡ蛋白，其能夠起到構象保護的作用，在氧分壓增高時，該蛋白與固氮酶結合，此時，固氮作用隨著固氮酶構象的改變而喪失；固氮酶周圍的氧濃度降低后，該蛋白便從酶分子上解離，固氮酶恢復原有的構象和固氮能力。Gluconacetobacter diazotrophicus還可以利用菌落黏液的路徑長度來維持最佳的O2濃度，且不抑制固氮酶活性和細胞代謝。呼吸保護和構象保護均涉及Fe-SⅡ蛋白協(xié)同作用。

4.3.3 “雙保險”式調節(jié)機制 通過加強呼吸作用與改變構象兩者相互協(xié)調，組成一個“雙保險”式調節(jié)機制，以保證固氮酶的活性。

此外，要實現(xiàn)生物固氮還必須具備以下幾個基本條件：還原型電子供體、ATP 和Mg2+離子、來源于水的質子、嚴格的無氧環(huán)境。實際上固氮酶的機理非常復雜，至今仍有很多問題尚不明確。

5 植物內生固氮菌對植物的促生作用及其機制

內生固氮菌侵入植物體內后定殖在木質部導管并發(fā)揮固氮能力。木質部導管可以提供細菌生長所需要的能源、滿足低氧分壓的環(huán)境，還可以提供交換代謝產(chǎn)物的場所，避免與土壤微生物之間的競爭和土壤化合態(tài)氮對固氮酶活性的抑制作用，固定的氮無需經(jīng)過其他方式即可以直接被植物吸收利用。目前已發(fā)現(xiàn)的植物內生固氮菌多通過以下幾方面發(fā)揮促生作用。

5.1 為植物提供氮源

內生固氮菌都含有固氮酶，能夠大量定殖在植物組織內部，而且無需形成特殊的共生結構或組織就能發(fā)揮固氮作用，這與固氮菌能夠形成被膜或基質包圍的內生特征有關[50]。它們可以定殖在宿主植物體內，能夠侵入宿主植物的大部分營養(yǎng)器官內并且發(fā)揮固氮作用，為植物提供可利用的氮源，有些內生固氮菌固定的氮素還可以直接被植物吸收同化。由目前的研究表明，這一系列作用不會引起寄主植物產(chǎn)生任何不良反應[51]，有些可以將大氣中固定的氮素一部分提供給宿主吸收利用，其余部分被細菌自身轉化利用，當細菌死亡后釋放出的有機氮也被植物吸收利用。

5.2 產(chǎn)生植物激素類物質

內生固氮菌能分泌的刺激植物生長的植物激素類物質有吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素等[52]。分離自墨西哥的重氮營養(yǎng)醋桿菌(Acetobacteria)具有產(chǎn)生長素（IAA）的能力[53]。林敏[54]分析水稻根系成分時，發(fā)現(xiàn)糞產(chǎn)堿菌（A.faecalis）存在于水稻根際并且能產(chǎn)生赤霉素、生長素及玉米素，可以促進水稻根系生長發(fā)育，同時刺激水稻根的分泌作用。田宏等[55]從草坪草根際得到分離物，對分離物成分進行分析并發(fā)現(xiàn)大部分都能夠產(chǎn)IAA，但產(chǎn)IAA 的能力差異較大,濃度在 3.18～22.3 mg·L-1之間。植物根內生細菌可以通過吲哚-3-丙酮酸（IPyA）、吲哚-3-乙酰胺（IAM）、吲哚-3-乙腈（IAN）和色胺（TAM）等途徑來合成IAA[56]，從而促進宿主植物的生長或者調節(jié)植物生理代謝活動。也有內生固氮菌通過產(chǎn)生鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶等其他物質來促進植物生長[57]。陽潔等[58]從野生稻中分離到多種內生固氮菌，接種后能顯著促進水稻生長。尹坤等[59]從野生稻體內分離到1 株變棲克雷伯氏菌（K.variicola），這株菌不僅具有較強的分泌生長素和鐵載體的能力，還能夠有效促進水稻的萌發(fā)和生長。

5.3 促進內根際的生理變化

研究發(fā)現(xiàn)，植物內生固氮菌具有促進內根際的生理變化作用。主要表現(xiàn)在促進根際多元酚的分泌、促進植物根際ATP 含量增加、促使根部氧化酶活性降低，提高還原酶活性。以固氮葡糖醋桿菌為例，其具有糖酵解、戊糖磷酸途徑和一種獨特的細胞外醛糖氧化途徑，利用含吡羅-喹啉-醌（PQQ）的葡萄糖脫氫酶將胞外葡萄糖氧化為葡萄糖酸酯[60]。在此過程中產(chǎn)生的額外還原當量主要通過產(chǎn)生ATP 的電子傳遞鏈傳遞，ATP 同時用于固定N2過程，這一途徑在高能量需求和碳限制條件下均可運行，同時還具有溶磷等功能以改善根際內生理條件。

5.4 生物防治作用

內生固氮菌對植物病害有顯著的抑制作用。Braun 等[61]在研究成團腸桿菌時發(fā)現(xiàn)，接種成團腸桿菌的小麥可以有效防治丁香假單胞菌引起的小麥粒疫病，并且防治率可以達到45%～74%。楊海蓮等[62]也發(fā)現(xiàn)采用陰溝腸桿菌接種水稻可以對水稻紋枯病、稻瘟病和白枯病起到一定防治效果。目前，對固氮菌生防作用的機理有2種推測，一種是固氮菌通過在與致病菌的競爭過程中占據(jù)有利生態(tài)地位達到抑制致病菌的作用；另一種認為可能是內生固氮菌產(chǎn)生了某種特異性抑菌物質，從而發(fā)揮抗病功能[63]。

6 展望

植物內生固氮菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然成分，由于長期的共同進化，植物內生固氮菌與宿主建立了良好的互利共生關系。內生固氮菌寄生于宿主植物組織內，并不引起直觀的表型變化，使該領域的研究具有一定的難度；同時，由于內生固氮菌的生境特殊，并受多種因素的影響，限制了內生固氮接種劑在農業(yè)生產(chǎn)中的應用。近年來,隨著一些新研究方法的應用，包括化學分析、遺傳工程、分子生物學、免疫學等,推動了固氮菌領域的研究深度，使人們進一步了解內生固氮菌與植物之間的相互關系，并促進了內生固氮菌合理運用。但目前，仍有很多問題尚未解決，如內生固氮菌的來源、侵入的分子機制、作用特點及人工接種其他植物是否會造成影響，此外，針對固氮機理方面的研究也并不深入，生防機制方面也只是推測并未明確。因此，明確植物和內生固氮菌的互作關系，以及內生固氮菌與植物根形成固氮體系的機理等，將更有利于人們了解內生固氮菌并充分利用，對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。