王宗文 李小東 朱乾坤 曾世聰 翟博

原發(fā)性肝癌是世界上第六大常見癌癥，其起病隱匿、發(fā)展迅速、致死率高。據(jù)統(tǒng)計肝癌在男性癌癥死亡原因中排第二，是我國癌癥患者的第三大死亡原因，其中肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發(fā)性肝癌的80%[1-2]。手術(shù)切除和肝移植是早期肝癌患者最有效的治療方式，然而大部分患者在確診時已經(jīng)處于進(jìn)展期階段，喪失了根治治療的機(jī)會，因此系統(tǒng)性的治療在中晚期肝癌中扮演著極其重要的角色[3-4]。目前，分子靶向治療藥物索拉非尼(Sorafenib)作為HCC一線治療藥物已廣泛應(yīng)用于臨床。索拉非尼作為一種多激酶抑制劑，其作用靶點多樣，通過作用于JAK/STAT、RAF/ERK/MEK、Wnt/β-catenin、VEGFR和PDGFR等通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少腫瘤血管生成，進(jìn)而改善中晚期肝癌患者生存期；但隨著患者長期應(yīng)用索拉非尼治療，索拉非尼的有效性降低和耐藥率已引起廣泛關(guān)注[3-6]。據(jù)多項研究表明人類驅(qū)動蛋白家族成員14(KIF14)在包括HCC在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的耐藥[6-8]。本研究以人正常肝細(xì)胞LO2、肝細(xì)胞癌SMCC-7721及其相應(yīng)的索拉非尼耐藥細(xì)胞SMCC-7721-SR為研究對象，探討KIF14在HCC對索拉非尼耐藥中的作用及機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)肝癌在索拉非尼耐藥中的治療尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常肝細(xì)胞LO2和人肝細(xì)胞癌SMCC-7721細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。索拉非尼購于濟(jì)南精合醫(yī)藥科技有限公司。凋亡檢測試劑盒購于美國BD Biosciences公司。PCR相關(guān)試劑(TRIzol、PCR擴(kuò)增試劑盒、Real-Time PCR試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶)購于GENEWIZ生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑siRNAs購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Lipofectamine 3000TM轉(zhuǎn)染試劑盒和OPTI-MEM購于美國Thermo Fisher公司。KIF14兔抗人多克隆抗體購于英國 Abcam 公司，β-actin 鼠抗人單克隆抗體和羊抗兔/鼠二抗購于北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肝細(xì)胞LO2和人肝細(xì)胞癌SMCC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 DMEM高糖培養(yǎng)液中(含有 1%的青鏈霉素雙抗)，并置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。采用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)SMCC-7721對索拉非尼的耐藥細(xì)胞株并將其命名為SMCC-7721-SR，以索拉非尼0.5 μmol/L 為起始濃度開始培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長后逐漸提高索拉非尼的濃度，每次提高0.25 μmol/L，直至細(xì)胞能在10 μmol/L的索拉非尼培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。耐藥細(xì)胞始終培養(yǎng)于含索拉非尼10 μmol/L的培養(yǎng)液中，以維持耐藥細(xì)胞對索拉非尼的耐藥特性。待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時，選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，常規(guī)使用0.25%胰酶(0.02%EDTA)消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

取對數(shù)生長期的LO2、SMCC-7721和SMCC-7721-SR細(xì)胞，根據(jù)試劑說明書用TRIzol提取總RNA。按照引物設(shè)計合成技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合文獻(xiàn)設(shè)計合成 KIF14 基因引物，并以 GAPDH 作為內(nèi)參，其相關(guān)序列如表1所示。將提取的總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，繼而利用 Mx3000P實時PCR系統(tǒng)(Stratagene，USA)將從總RNA獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加載到Taq Man陣列上，用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)。通過解鏈曲線確認(rèn)擴(kuò)增的特異性，并使用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)公式：CT值=2-ΔCT[ΔCT=CT靶基因-CTGAPDH]，用CT值計算KIF14的mRNA相對表達(dá)水平，重復(fù)三次實驗并計算平均值。

表1 KIF14及GAPDH的引物序列

1.4 Western blot檢測

取處于對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞，在用提前預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗3次后根據(jù)試劑商說明書提蛋白。然后將30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。使用5%的脫脂牛奶(含0.1% Tween20的TBS緩沖液)封閉PVDF膜1 h，然后在4℃下與抗KIF14(1∶1 500)、β-actin(1∶2 000)的一抗孵育過夜，用TBST(含0.1% Tween20的TBS緩沖液)洗滌5次后，室溫下二抗(1∶5 000)繼續(xù)孵育2 h。然后用TBST沖洗5次，后在凝膠成像系統(tǒng)中，加入200 μL等體積混合的顯色液A液和B液，觀察抗體抗原復(fù)合物顯色反應(yīng)，以β-actin為對照。所有實驗重復(fù)三次。

1.5 siRNA的設(shè)計、合成及轉(zhuǎn)染

檢索NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫，獲取本研究中擬進(jìn)行干預(yù)基因KIF14的基因序列。按照siRNA的設(shè)計原則，采用Invitrogen公司的RNAi express在線的設(shè)計軟件，結(jié)合文獻(xiàn)，設(shè)計針對KIF14及其無同源性的非特異性對照組雙鏈siRNA序列，然后由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成實驗所需siRNA雙鏈。設(shè)計合成兩條針對KIF14特異性的siRNA命名為siKIF14-1、siKIF14-2，陰性對照siRNA稱為NC。它們的序列和相應(yīng)的靶基因如表2所示。

表2 靶基因及序列

取處于對數(shù)生長期的SMCC-7721-SR以每孔5×105個細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板中，培養(yǎng)24～48 h，待細(xì)胞生長到70%～90%融合后，按照操作說明書用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000 TM和siKIF14或NC。然后將稀釋的siKIF14或NC等體積加入到Lipofectamine 3000 TM中，獲得50 nmol/L 作為siKIF14和NC的最終工作濃度。為驗證siRNAs的有效性，通過Western blot分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。接下來將相應(yīng)的siRNAs轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞24～48 h，然后進(jìn)行相應(yīng)實驗的細(xì)胞活力檢測。以上實驗重復(fù)三次。

1.6 CCK-8法測細(xì)胞活力

采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力，取對數(shù)生長期的LO2、SMCC-7721、SMCC-7721-SR或轉(zhuǎn)染siKIF14的SMCC-7721-SR以 3×103個/孔的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中過夜，和/或與10μmol/L的索拉非尼孵育 24～48 h加入10 μL/孔CCK-8 溶液新鮮培養(yǎng)基然后在 37℃下孵育2 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀測量450 nm處的光密度值。細(xì)胞活力(%)=(實驗OD值-空白OD值)/(對照OD值-空白OD值)×100%。重復(fù)三次實驗，計算平均值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，將siKIF14轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞和/或與10 mol/L索拉非尼于6孔板中孵育24～48 h，棄上清液，PBS重懸離心，用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度為每毫升1×106個細(xì)胞，后抽取細(xì)胞懸液100 μL加至5 mL流式管中，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻避光室溫孵育10 min，然后再加入5 μL PI，混勻避光室溫孵育5 min。接下來使用Beckman Coulter epics Altra II細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。以上實驗重復(fù)三次，計算平均值。

1.8 藥物協(xié)同作用的評價方法

使用參考文獻(xiàn)藥物協(xié)同計算方法[6，9]，按公式計算藥物相互作用指數(shù)(CDI)，CDI=AB/A×B。AB為聯(lián)合用藥細(xì)胞活力指數(shù)，A、B分別為各單藥的細(xì)胞活力指數(shù)。當(dāng)CDI>1兩藥作用性質(zhì)為拮抗，CDI=1時兩藥作用性質(zhì)相加，CDI<1時兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同，CDI<0.7則協(xié)同作用顯著。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞耐藥性的驗證

CCK-8法和凋亡檢測結(jié)果顯示，索拉非尼對SMCC-7721的抑制作用明顯強(qiáng)于SMCC-7721-SR，在10 μmol/L索拉非尼作用48 h后SMCC-7721-SR細(xì)胞活力達(dá)(72±4)%，凋亡率為(29±3)%，而親本細(xì)胞SMCC-7721幾乎無存活，細(xì)胞活力僅為(31±4)%，凋亡率為(62±2)%。表明誘導(dǎo)建立的耐藥細(xì)胞SMCC-7721-SR對索拉非尼出現(xiàn)明顯的耐藥性(圖1)。

圖1 耐藥細(xì)胞耐藥性的驗證Figure 1 Verification of drug resistance of the drug resistant cellsNote：A.The effects of sorafenib on viability of SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells；B.The effects of sorafenib on apoptosis of SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the corresponding SMCC-7721-SR cells.

2.2 KIF14參與肝細(xì)胞癌SMCC-7721索拉非尼的獲得性耐藥

在人正常肝細(xì)胞LO2和肝細(xì)胞癌SMCC-7721及SMCC-7721-SR中，qRT-PCR、Western blot結(jié)果顯示與人正常肝細(xì)胞LO2相比，KIF14在肝細(xì)胞癌SMCC-7721表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)；與肝細(xì)胞癌SMCC-7721相比，KIF14在其耐藥細(xì)胞SMCC-7721-SR也顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2)。結(jié)果提示KIF14與肝細(xì)胞癌SMCC-7721索拉非尼的的獲得性耐藥相關(guān)。

圖2 KIF14參與HCC的進(jìn)程，調(diào)控索拉非尼的獲得性耐藥Figure 2 KIF14 was involved in the drug resistance of sorfenib in SMCC-7721 cellsNote：A.The expression of KIF14 at a mRNA level was measured in LO2 cells，SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells by qRT-PCR；B.The expression of KIF14 protein in LO2 cells，SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells；C.The density was normalized by β-actin.**P<0.01，***P<0.001.

2.3 抑制KIF14能夠增強(qiáng)SMCC-7721-SR對索拉非尼的敏感性

為驗證siKIKF14s轉(zhuǎn)染的有效性，Western blot分析結(jié)果顯示，與對照組相比，設(shè)計合成的siKIF14均能有效的下調(diào)SMCC-7721-SR細(xì)胞中KIF14蛋白的表達(dá)(P<0.05)，且siKIF14-2作用效果更好(圖3A，3B)，故采用siKIF14-2進(jìn)行后續(xù)實驗。接下來，將siKIF14-2轉(zhuǎn)染的SMCC-7721-SR耐藥細(xì)胞和/或與10 mol/L索拉非尼單藥或聯(lián)合再培養(yǎng)，CCK-8法和凋亡檢測結(jié)果顯示SMCC-7721-SR耐藥細(xì)胞接受單獨索拉非尼或siKIF14-2敲除后，其相對細(xì)胞活力分別為(78±2)%和(71±3)%，聯(lián)合作用后其相對細(xì)胞活力為(38±3)%，聯(lián)合作用指數(shù)為0.686，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用(P<0.01)；應(yīng)用索拉非尼或siKIF14-2敲除單獨作用后其凋亡率分別為(27±3)%和(32±2)%，與索拉非尼或siKIF14-2單獨作用相比，兩者聯(lián)合作用其凋亡率為(45±2)%(P<0.01)(圖3C，3D)。以上研究結(jié)果表明抑制KIF14的表達(dá)能夠增強(qiáng)SMCC-7721-SR對索拉非尼的敏感性。

圖3 抑制KIF14能夠增強(qiáng)SMCC-7721-SR對索拉非尼的敏感性Figure 3 Silencing KIF14 enhanced the sensitivity of SMCC-7721-SR cells to sorafenibNote：A.The expression of KIF14 protein in SMCC-7721-SR cells after knocking down KIF14；B.The density was normalized by β-actin；C.The effect of sorafenib synergistic KIF14 silencing on cell viability，the cell viability was compared with the control group；D.The effect of sorafenib synergistic KIF14 silencing on cell apoptosis.*P<0.05，**P<0.01.

3 討論

近些年我國肝癌的發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢，給我國造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。索拉非尼是近十年來唯一獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的對進(jìn)展期肝癌系統(tǒng)治療藥物，但HCC對其耐藥的問題頗為嚴(yán)重，患者的獲益有限、預(yù)后較差，因此急需探索新的治療方式[10]。自索拉非尼獲批以來人們對索拉非尼的耐藥機(jī)制進(jìn)行了大量研究，索拉非尼在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中通過阻斷與血管生成相關(guān)的膜受體VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR從而阻斷MAPK通路，起到抗血管形成作用。但血管萎縮引起局部組織缺氧從而誘發(fā)缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的表達(dá)，HIF-1通過結(jié)合缺氧反應(yīng)元件激活下游眾多靶基因從而參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等諸多環(huán)節(jié)[11-12]。PI3K/AKT通路是HCC索拉非尼耐藥的關(guān)鍵通路，該通路通過參與調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；阻斷AKT通路會增加HCC對索拉非尼的敏感性，研究還發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路的激活主要導(dǎo)致AKT磷酸化水平升高[3，12]。此外也有研究證明腫瘤干細(xì)胞、JAK-STAT通路、自噬通路均與HCC對索拉非尼的獲得性耐藥相關(guān)[6]。

KIF14是驅(qū)動蛋白超家族(KIFS)中的成員之一，位于染色體1q32.1上，通過調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的形成、參與染色體的分離和胞質(zhì)分裂的完成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。有研究表明KIF14在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、卵巢癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，成為癌癥的預(yù)后標(biāo)志物和癌基因[7-8，14]。本研究中采用濃度梯度遞增法建立HCC對索拉非尼的耐藥細(xì)胞系，應(yīng)用qRT-PCR及Western blot檢測人正常肝細(xì)胞LO2、肝細(xì)胞癌SMCC-7721及其相應(yīng)耐藥細(xì)胞SMCC-7721-SR中KIF14的表達(dá)情況，結(jié)果表明肝癌細(xì)胞中KIF14表達(dá)上調(diào)，與肝癌親本細(xì)胞相比在耐藥細(xì)胞中KIF14表達(dá)更明顯，推測KIF14可能參與調(diào)控HCC SMCC-7721對索拉非尼的獲得性耐藥，后續(xù)實驗在耐藥細(xì)胞中通過敲低KIF14，結(jié)果表明抑制KIF14可以增強(qiáng)SMCC-7721-SR對索拉非尼的敏感性，與我們先前在Huh-7和HepG2細(xì)胞系的研究有一致結(jié)果[6]。我們先前研究中證明了Huh-7和HepG2耐藥細(xì)胞系中上調(diào)了KIF14和p-AKT的表達(dá)，并通過沉默KIF14下調(diào)p-AKT的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞活力[6，15-16]。SMCC-7721-SR是否可通過沉默KIF14下調(diào)p-AKT增敏索拉非尼的療效則需要進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究表明KIF14參與HCC的進(jìn)程，調(diào)控索拉非尼的獲得性耐藥。KIF14表達(dá)上調(diào)是HCC細(xì)胞對索拉非尼耐藥的原因之一，它的阻斷與索拉非尼有協(xié)同作用。這些發(fā)現(xiàn)為抑制KIF14的表達(dá)作為索拉非尼治療失效后的二線治療靶點提供了依據(jù)，或與索拉非尼聯(lián)合用藥以增強(qiáng)HCC的抗腫瘤作用。