蔣夏蘭 黃翠霖 徐世強 張木清

摘 ?要：甘蔗（Saccharum officinarum）是我國重要的糖料作物之一，90%以上的食用糖是由甘蔗產生的，我國有85%以上的甘蔗種植區(qū)是分布在旱地，干旱是限制甘蔗生產重要的因素之一。因此，改良和培育抗旱甘蔗新品種對甘蔗產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。AP2/ERF轉錄因子是植物中特有的基因家族之一，該基因家族成員通過調控逆境脅迫相關基因的表達，從而在植物的干旱、鹽害、冷凍等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。前期研究表明斑茅轉錄因子EaDREB2B在近緣種甘蔗中異源表達可提高甘蔗的抗旱性，但EaDREB2B在甘蔗中的互作蛋白有待挖掘，其調控甘蔗抗旱的分子機制尚待闡明。本研究在前期研究基礎上，構建了干旱脅迫下轉EaDREB2B基因甘蔗GN18的酵母cDNA文庫，擬利用生物信息學和酵母雙雜交技術篩選EaDREB2B的互作蛋白，為闡明EaDREB2B調控甘蔗抗旱的分子機制奠定基礎。結果表明：EaDREB2B編碼325個氨基酸，含有一個位于N端71～129氨基酸區(qū)域的AP2保守結構域，EaDREB2B存在轉錄激活活性，其自激活區(qū)位于EaDREB2B的C端255～325氨基酸區(qū)域;利用截短的EaDREB2B（1～255氨基酸）作為誘餌蛋白在甘蔗酵母cDNA文庫中篩選其互作蛋白，初步篩選出498個候選陽性克隆，通過PCR檢測篩選到432個有效陽性克隆，經測序和比對去除重復克隆后，成功篩選出269個與EaDREB2B互作的候選蛋白，候選互作蛋白主要包括轉錄因子、泛素蛋白酶、乙烯不敏感蛋白、脫水誘導蛋白、核糖體蛋白、延伸因子、解旋酶、蛋白激酶和一些未知蛋白等。通過KEGG功能分析顯示，162個候選蛋白被KEGG注釋，并且參與44條KEGG信號通路，主要涉及泛素介導蛋白水解、光合作用、核糖體、氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸、調節(jié)自噬、內質網中的蛋白質加工、碳代謝和RNA轉運等通路;通過KEGG富集分析發(fā)現互作蛋白在光合作用、泛素介導蛋白水解和氨基酸生物合成等途徑顯著富集，推測EaDREB2B可能通過其相互作用蛋白泛素化介導蛋白降解參與逆境響應，推測EaDREB2B可能通過蛋白泛素化介導蛋白降解參與逆境響應。

關鍵詞：EaDREB2B;甘蔗;干旱;酵母雙雜;蛋白互作

中圖分類號：S961.6 ? ? ?文獻標識碼：A

Screening and Analysis of EaDREB2B Interaction Proteins from Sugarcane

JIANG Xialan， HUANG Cuilin， XU Shiqiang， ZHANG Muqing*

Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology Provincial， Guangxi University / Provincial & Ministerial Collaborative Innovation Center for Sugar Industry， Nanning， Guangxi 530005， China

Abstract： Sugarcane is the most important sugar crop， in China. More than 90% sugar is produced by sugarcane. More than 85% of sugarcane planting areas are distributed in dry land， and drought is one of the important factors restricting sugarcane production.The AP2/ERF gene family is one of the plant-specific gene families， which participate in the regulation and expression of genes related to adverse stress， and play a very important role in adverse stress. The previous research of the research group showed that EaDREB2B can improve the drought resistance of sugarcane， but the interaction protein of EaDREB2B in regulating the drought resistance of sugarcane remains to be clarified. In this study， a yeast cDNA library of EaDREB2B transgenic sugarcane GN18 under drought stress was constructed based on previous research. Bioinformatics and a yeast two-hybrid technique were used to screen the EaDREB2B interaction proteins to clarify the role of EaDREB2B in regulating sugarcane drought resistance. The functional domain prediction showed that EaDREB2B contained 978 base pairs， encoding 325 amino acid residues with a calculated molecular mass of 36.52 kDa and a predicted pI of 4.57， and the AP2/ERF of EaDREB2B existed in the N-terminal 71?129 amino acid region. The transactivation activity analysis showed that EaDREB2B had transcriptional activation activity in yeast. EaDREB2B had self-activation in the C-terminal 255?325 amino acid region. In this study， the truncated EaDREB2B （1?255 amino acid） was used as the bait protein to screen the sugarcane cDNA library and aimed to identify proteins that interacted with EaDREB2B. In this study， 498 positive candidate clones were initially screened， and 432 effective positive clones were further screened by PCR. After sequencing and comparison to remove identical clones， a total of 269 candidate proteins that interacted with EaDREB2B were screened out. The candidate interacting proteins mainly include transcription factors， ubiquitin proteases， ethylene insensitive proteins， dehydration-inducing proteins， ribosomal proteins， elongation factors， helicases， protein kinases， some unknown proteins and so on. The results of KEGG pathway analysis showed that a total of 162 proteins were annotated with KEGG and assigned to 44 KEGG pathways， including Ubiquitin mediated proteolysis， photosynthesis， ribosome， biosynthesis of amino acids， cysteine and methionine metabolism， regulation of autophagy， protein processing in endoplasmic reticulum， carbon metabolism and RNA transport. KEGG enrichment analysis indicated that 269 candidate proteins were significantly enriched in photosynthesis， ubiquitin-mediated proteolysis， amino acid biosynthesis， and other pathways， suggesting that EaDREB2B might mediate protein degradation through ubiquitination.

Keywords： EaDREB2B; sugarcane; drought; yeast two-hybrid; interaction protein

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.007

植物在生長發(fā)育過程中會受到許多不利因素的影響，包括生物因素和非生物因素。據報道，世界上主要的農作物近50%的產量損失與非生物脅迫有關[1]。近年來，隨著全球氣候變暖，干旱已然成為影響作物產量的重要因素。甘蔗（Sac?c?ha?rum officinarum）是我國最重要的糖料作物，全國近90%的食糖由甘蔗提供[2]。我國85%以上的甘蔗種植區(qū)分布在旱地，有效灌溉面積小，干旱嚴重限制了甘蔗的生長發(fā)育，從而導致產量顯著下降[3-4]。長期的進化過程中，植物形成了多種應答機制來抵御逆境脅迫。轉錄因子在植物響應干旱和高溫逆境脅迫過程中扮演著關鍵角色[5]。

AP2/ERF類轉錄因子是植物特有的轉錄因子，該類轉錄因子至少含有1個高度保守的AP2/ERF結構域[6]。在擬南芥和水稻中，根據序列的相似性和AP2 的數量將AP2/ERF基因家族分為AP2、ERF（ethylene-responsive factor）、RAV（ABI3/VP1）和Soloist 4個亞族，AP2/ERF結構域中的第14位氨基酸和第19位氨基酸對轉錄因子與DNA的結合尤為重要。在ERF亞族中根據第14位氨基酸和第19位氨基酸的類型，將ERF家族分為ERF和DREB（dehydration-responsive element-binding protein）[7]。

DREB轉錄因子參與不同的信號傳遞，低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫能誘導大部分DREB基因的表達。擬南芥的AtDREB2A基因能特異性地結合干旱應答元件CRT/DRE（C-repeat/dehydration- responsive element）的核心序列（A/GCCGAC），調控高鹽、干旱和低溫相關基因的表達[8-9]。StDREB2基因通過調控氣體交換、滲透物質累積、抗氧化酶活性、活性氧（ROS）清除及與逆境相關基因的表達，從而提高棉花的抗旱能力和植物生物量[10]。CHEN等[11]發(fā)現GmDREB2受干旱脅迫誘導，可激活轉基因擬南芥系列下游基因的表達，提高轉基因株系對干旱的耐受性。JIANG等[12]報道番茄SlDREB1基因在干旱脅迫下強烈表達，將其遺傳轉化擬南芥后，發(fā)現其能增強轉基因擬南芥的耐旱能力。WANG等[13]研究發(fā)現水稻OsDREB1F基因、OsDREB2A基因均受高鹽脅迫誘導，分別在擬南芥中過表達OsDREB1F基因、OsDREB2A基因，并且發(fā)現轉基因株系均表現出較強抗鹽能力。本課題組前期構建了以rd29A為啟動子的表達載體prd29a-dreb- hyg，通過基因槍轟擊轉化甘蔗，獲得轉基因GN18植株，在后續(xù)研究中發(fā)現GN18與野生型FN95-1702相比，具有優(yōu)異的抗旱性，表明EaDREB2B能夠提高甘蔗的抗旱性[14]。然而，關于EaDREB2B調控甘蔗抗旱分子機制尚不清楚，因此本研究擬利用酵母雙雜交技術篩選EaDREB2B的互作蛋白，為闡明EaDREB2B調控甘蔗抗旱的分子機制奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

酵母雙雜實驗所用的Y2HGold酵母菌株、質粒pGADT7和pGBKT7購于Clontech公司;高保真酶2 × Phanta（南京，諾唯贊）、DNA Ligation Kit（TaKaRa）、Top10感受態(tài)細胞（上海，唯地生物）、質粒DNA小提試劑、DNA純化回收試劑盒（北京，天根）、酵母質粒提取試劑盒（北京，索萊寶）等均購自商業(yè)公司;引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司和南寧捷尼斯生物公司共同完成，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。研究使用的甘蔗材料為GN18（轉EaDREB2B基因株系）和FN95-1702（受體材料），由本實驗室種植保存。甘蔗材料的種植及處理參見XU等[15]的方法，采集正常澆水、輕度干旱、重度干旱和復水5 d的GN18甘蔗葉片用于甘蔗cDNA酵母文庫構建。

1.2 ?方法

1.2.1 ?EaDREB2B生物信息學分析 ?利用Expasy在線分析工具ProtParam tool（https：//web.expasy. org/protparam/）對EaDREB2B蛋白氨基酸序列進行氨基酸數目、相對分子質量、等電點等理化性質分析，ProtSacle（https：//web.expasy. org/protscale/）在線分析親水性和疏水性;Prosite tool（https：// prosite.expasy.org/prosite.html）分析EaDREB2B蛋白的保守結構域;NetPhosK 1.0 Server（http：// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預測潛在的磷酸化位點;TMHMM Server v. 2.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析其跨膜結構域。

1.2.2 ?pGBKT7-EaDREB2B載體構建 ?EaDREB2B的AP2保守結構域位于N端71～129氨基酸區(qū)域，對EaDREB2B蛋白從C端進行氨基酸截短。根據前期分析的EaDREB2B基因序列信息及結合pGBKT7多克隆位點信息，設計帶有EcoR I和Sal I的EaDREB2B全長（1～325 aa）及一系列截短蛋白（1～295 aa、1～275 aa和1～255 aa）的PCR擴增引物，引物序列見表1。PCR反應體系為：總體積為50 μL，其中2×Phanta? Max Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板質粒1 μL，ddH2O 20 μL。反應程序為：95℃ 3 min;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環(huán);72℃ 5 min。PCR產物回收后與酵母表達載體pGBKT7分別用EcoR I和Sal I雙酶切，回收后的目的基因與載體片段用DNA Ligation Kit連接酶16℃連接30 min后，取5 μL連接產物轉化50 μL大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆，經菌液PCR檢測后擴大培養(yǎng)提取質粒，委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序，測序正確即成功構建誘餌表達載體。

1.2.3 ?酵母Y2HGold感受態(tài)細胞制備及自激活驗證 ?酵母感受態(tài)細胞制備及轉化參照鄢敏麗[16]的方法。按照Clontch公司酵母雙雜交試劑盒說明方法，將含有EaDREB2B（1～325 aa、1～295 aa、1～275 aa、1～255 aa）片段的載體與pGBKT7（BD空載）分別轉化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞，涂布于SD/-Trp/X-α-Gal平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，根據菌斑生長情況及顏色變化判斷是否有轉錄自激活活性。

1.2.4 ?酵母文庫建立及互作蛋白的篩選 ?本研究使用的甘蔗均一化pGADT7-cDNA酵母文庫，委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司構建。將pGBKT7-EaDREB2B（1～255 aa）與pGADT7- cDNA文庫質粒共同轉化Y2HGold酵母感受態(tài)，以pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對照，以pGBKT7-Lam+ pGADT7-T為陰性對照，將轉化后的酵母涂布于DDO/A/X（SD/-Leu/-Trp/AbA（125 ng/mL）/X-α-Gal（40 μg/mL）平板上;30℃培養(yǎng)3～5 d后，挑選藍色菌落劃線于QDO/A/X（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/AbA/X-α-Gal）平板上;30℃培養(yǎng)3～5 d后，挑選在QDO平板正常生長的藍色菌落于QDO液體培養(yǎng)基中;30℃搖床培養(yǎng)2～3 d，提取渾濁菌液質粒DNA，用AD載體通用引物進行PCR擴增，引物信息見表1;挑選片段大于500 bp單一產物進行測序，測序結果通過Blast比對割手密基因組數據庫（http：//www.life. illinois.edu/ming/downloads/Spontaneum_genome/），獲取候選蛋白注釋信息。

2 ?結果與分析

2.1 ?EaDREB2B生物信息學分析

理化性質分析發(fā)現，EaDREB2B蛋白分子量為36.52 kDa，等電點（pI）為4.57，分子式為C1576H2454N444O532S12 ，不穩(wěn)定系數為59.63。親水性和疏水性分析預測，發(fā)現EaDREB2B蛋白質的氨基酸序列中多為親水性氨基酸（圖1A），推測EaDREB2B為親水蛋白質;磷酸化預測結果顯示，EaDREB2B蛋白質中有19個Ser（絲氨酸）位點可發(fā)生磷酸化修飾，有8個Thr（蘇氨酸）位點可發(fā)生磷酸化修飾，4個Tyr（酪氨酸）位點可發(fā)生磷酸化修飾（圖1B），推測EaDREB2B翻譯后可能進行磷酸化修飾發(fā)揮其功能;跨膜結構分析，發(fā)現EaDREB2B蛋白沒有跨膜結構（圖1C）。EaDREB2B蛋白保守結構域分析發(fā)現，EaDREB2B蛋白共編碼325個氨基酸，具有一個高度保守的AP2結構域，包含58個氨基酸殘基，位于71～129 aa區(qū)域。EaDREB2b蛋白的N端存在KRWKESNQNVDEKPRRK核定位序列（NLS），C端的202～240 aa之間存在一個谷氨酸富集區(qū)（圖1D）。蛋白質二級結構分析，EaDREB2B蛋白由43.69%的無規(guī)則卷曲、38.46%的α-螺旋和6.15%的β-轉角組成。

2.2 ?誘餌載體構建及自激活檢測

通過PCR擴增EaDREB2B全長及其截短片段，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后獲得目的條帶（圖2A），產物純化后插入pGBKT7，轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)，測序后確認和已知的EaDREB2B全長及其截短的EaDREB2B序列完全一致。重組質粒自激活檢測結果顯示，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上均能正常長出菌落，表明重組質粒成功轉入Y2H酵母菌株;轉化EaDREB2B全長、截短EaDREB2B片段（1～295 aa和1～275 aa）的酵母菌落變藍色，而轉化pGBKT7（BD）空載和重組EaDREB2B（1～255 aa）截短片段的酵母菌落未變藍，結果表明EaDREB2B具有自激活活性，自激活區(qū)域位于C端255～325區(qū)域（圖2B）。

2.3 ?酵母文庫的篩選和陽性克隆的鑒定

選用無轉錄激活活性的pGBKT7-EaDREB2B（1～255 aa）與pGAD7-cDNA酵母文庫質?；旌虾蠊餐D化Y2H酵母感受態(tài)，均勻涂布于DDO/A/X營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d。挑選平板上直徑大于2 mm的藍色菌落，重新劃線于QDO/A/X平板上初步得到820個陽性克隆，挑選四缺板上的陽性克隆與3 mL QDO/X/A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d，提取酵母質粒后用載體通用引物進行PCR驗證，結果篩選到432個陽性克?。▓D3A），挑選片段大于500 bp陽性克隆進行測序分析（圖3B）。測序結果通過Blast檢索割手密基因組cDNA數據庫，去除重復序列后獲得269個候選蛋白的注釋信息，主要包括轉錄因子、泛素蛋白酶、乙烯不敏感蛋白、脫水誘導蛋白、核糖體蛋白、延伸因子、解旋酶、蛋白激酶和一些未知蛋白等（表2）。

利用百邁克在線分析工具[17]，對269個候選互作蛋白進行GO功能注釋分類，269個候選蛋白中有242個蛋白得到注釋，這些蛋白參與15種生物進程，14種細胞組分合成和9種分子功能（圖4A）。KEGG pathway功能分析顯示，269個候選蛋白中有162個蛋白參與44條信號通路，主要涉及泛素介導蛋白水解（ubiquitin mediated proteolysis）、光合作用（photosynthesis）、核糖體（ribosome）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、半胱氨酸和蛋氨酸（cysteine and methionine metabolism）、調節(jié)自噬（regulation of autophagy）內質網中的蛋白質加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、碳代謝（carbon metabolism）和RNA轉運（RNA transport）等通路（圖4B）。

3 ?討論

前人研究發(fā)現，大多數DREB2s轉錄因子僅含有一個由58個氨基酸殘基組成的AP2結構域，N末端是富含堿性氨基酸的核定位信號區(qū)，C端存在轉錄自激活區(qū)域。QIN等[18]研究發(fā)現玉米中ZmDREB2A轉錄因子自激活區(qū)域在于C端235～ 272 aa區(qū)域。水稻中OsDREB2B具有轉錄激活活性，研究發(fā)現OsDREB2B蛋白的284～373 aa區(qū)域其轉錄活性很重要[19]。SAKUMA等[20]研究發(fā)現，擬南AtDREB2A蛋白的C端存在一個含有脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸形成的信號肽，正常條件下，信號肽對AtDREB2A蛋白有抑制作用，當刪除這段氨基酸殘基后（AtDREB2A-CA），過表達AtDREB2A-CA基因可提高擬南芥的抗旱能力。EaDREB2B生物信息學分析發(fā)現，EaDREB2B蛋白的N端有一個堿性核定位區(qū)，只有1個AP2結構域，位于N端71～129 aa區(qū)域，共58個氨基酸殘基，編碼的蛋白主要以β-折疊和α-螺旋為主，根據DREB亞族分類條件，EaDREB2B屬于DREB2s類轉錄因子，推測其可能存在轉錄激活區(qū)域。通過構建EaDREB2B蛋白全長及從截短蛋白片段的誘餌表達載體，并進行自激活區(qū)域檢測，結果顯示EaDREB2B全長具有轉錄激活活性，能轉錄激活調控下游一系列相關基因的表達，其轉錄激活區(qū)域在EaDREB2B的C端255～325 aa區(qū)，與前人研究發(fā)現DREB2s類轉錄因子C端存在轉錄激活活性的結果一致。

酵母雙雜交技術是驗證蛋白間相互作用的經典方法，最早由美國紐約州立大學的FIELDS等在1989年提出并且建立了基本模型[21]。1997年，STOCKINGER等[22]利用酵母單雜技術，首次從擬南芥cDNA文庫中分離到DREB轉錄因子CBF1。LEE等[23]從擬南芥酵母cDNA文庫中篩選DREB2C的互作蛋白bZIP蛋白（ABF2），ABF2可調節(jié)對ABA依賴性基因的表達。朱路平[24]研究發(fā)現OsDREBA5轉錄因子有轉錄激活活性，其自激活區(qū)域在C端，選擇無自激活活性的pGBKT7-OsDREBA5-1-f2質粒，從水稻酵母文庫中成功篩選出43個互作蛋白，表明利用C端截短的DREB轉錄因子可通過酵母雙雜交篩選與其相互作用的蛋白。本研究利用酵母雙雜交技術，以截短的EaDREB2B（1～255 aa）為誘餌質粒，從甘蔗酵母cDNA文庫成功篩選到269個與EaDREB2B（1～255 aa）互作的候選蛋白。

本研究篩選到與EaDREB2B互作的候選蛋白中涉及蛋白激酶和泛素蛋白酶體等防御相關的蛋白較多，說明EaDREB2B在抗非生物脅迫中有著重要作用。泛素-蛋白酶系統(tǒng)在生物體內控制許多蛋白質的降解速率，從而調節(jié)多個基本的細胞生理過程，包括植物生長、細胞信號傳導和應激反應[25-26]。泛素-蛋白酶系統(tǒng)在真核生物中是機械保守的，涉及復雜的酶和酶復合物收集，這些酶和酶的復合物結合到特定靶標蛋白并促進其進行泛素化的降解。蛋白質靶標是通過ATP依賴性反應級聯作用于泛素化，一般是通過E1 Ub激活酶、E2 Ub結合酶、E3 Ub連接酶3個連續(xù)作用進行標記[27]。據報道，DREB2A互作蛋白（DRIP1和DRIP2）與DREB2B相互作用，作為RING型E3泛素連接酶將DREB2A靶向26s蛋白酶體水解[28]。ZHANG等[29]發(fā)現擬南芥中編碼E3泛素蛋白的TaSAP5可介導與DREB2A互作蛋白DRIPs的降解，從而增加DREB2A蛋白的積累，進而影響其下游基因的表達。

EaDREB2B互作候選蛋白FREE1是內體蛋白分選轉運裝置（endosomal sorting complex required for transport， ESCRT）所需的內體分選復合物關鍵蛋白，參與多囊泡/前室區(qū)蛋白質的分選的調節(jié)。BUESO等[30]和BELDA-PALAZON等[31]發(fā)現RSL1介導ABA受體PYL4和PYR1泛素化，FREE1可與RSL1相互作用，將質膜上的ABA受體復合物轉運至ESTCRT機制中進行泛素化降解，減弱ABA信號傳導。FREE1與轉錄因子ABF4和ABI5相互作用，以通過減少他們與下游基因的順式調控序列的結合而在轉錄上抑制ABA信號傳導途徑[32]。推測EaDREB2B可能通過候選互作蛋白FREE1介導PYL4ABA受體的泛素化，參與依賴ABA信號傳導途徑響應干旱脅迫。

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