張 華，王晨輝，李 煒，劉 琪，張 媛，秦艷華，朱懷遠，廖惠云

江蘇中煙工業(yè)有限責任公司，南京市建鄴區(qū)興隆大街29號 210019

煙草提取物（含浸膏、凈油和酊劑等）是煙用香精香料的主要原料之一，其中，云南和津巴布韋煙草提取物是卷煙調(diào)香中常用的兩類香原料［1-2］。云南煙草提取物具有沁人心脾、令人愉悅的清甜香，津巴布韋煙草提取物具有甜潤、醇和的自然香韻，在卷煙配方中均具有調(diào)香、調(diào)味和提質(zhì)的功能［3-4］。云南與津巴布韋煙草提取物香氣成分組成較為相似，但相關差異性研究基本處于空白狀態(tài)［5-6］。目前對煙草提取物的研究更多是從香韻角度進行感官評價［7］，易受經(jīng)驗、主觀判斷所制約，缺乏客觀量化依據(jù)，難以對不同產(chǎn)地煙草提取物信息進行深入研判［8-9］。鑒于云南、津巴布韋及其他產(chǎn)地煙草提取物在卷煙用功能性香基模塊中應用廣泛，需要對其產(chǎn)地、組分及感官功效等進行針對性研究，以便于卷煙企業(yè)開展自主調(diào)香工作［10］。

煙草提取物來源廣泛、成分較為復雜，除了含有易揮發(fā)香味組分外，也含有植物蠟、色素和糖類等難揮發(fā)組分［11-12］。在樣品分析前處理過程中，相較于傳統(tǒng)液液萃取，固相支持液液萃取（Solid-phase supported liquid-liquid extraction，SLE）是一種新型前處理方法。SLE 采用經(jīng)過處理的硅藻土為吸附劑，具有吸水性強、性質(zhì)穩(wěn)定及不存在乳化現(xiàn)象的特點，能夠提高分析結果的重現(xiàn)性及降低前處理過程的損失，已成功應用于醫(yī)藥、食品和環(huán)境等領域的樣品前處理［13-15］。與此同時，近年來非靶向代謝組學手段在食品領域的產(chǎn)地溯源［16-17］、品質(zhì)鑒別［18-19］和摻假鑒別［20-22］等方面應用廣泛，具有明顯技術優(yōu)勢，這為利用物質(zhì)的組分對煙草提取物產(chǎn)地鑒別研究提供了參考［23-24］。為此，本研究中使用SLE-GC-MS 方法，結合非靶向代謝組學分析中常用的化學計量學方法，對云南、津巴布韋及其他產(chǎn)地煙草提取物樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性組分進行檢測分析，篩選出可用于識別樣品來源的有效指標，構建預測模型實現(xiàn)對未知煙草提取物的產(chǎn)地溯源，旨在為增強天然香原料屬性認知和提升自主調(diào)香核心技術掌控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

83個國內(nèi)外不同產(chǎn)地煙葉制備的煙草提取物樣品（由鄭州煙草研究院提供，其中，云南煙草提取物12個，津巴布韋煙草提取物22個和其他煙草提取物30個，分別簡稱YN、JBBW和QT，且QT樣品主要包括河南、湖南、巴西和弗吉尼亞等國內(nèi)外煙草提取物），以及用于模型預測的19個不同產(chǎn)地煙草提取物，樣品常溫密封保存。

乙醇（AR 級，國藥集團化學試劑有限公司）；二氯甲烷（HPLC 級，美國Tedia 公司）；正十七碳烷（標準品，≥99%，比利時Acros 公司）；正構烷烴C7～C40（1 000 mg/L的正己烷溶液，上海安譜實驗科技股份有限公司）；實驗用水為GB/T 6682—2008 規(guī)定的一級水（電阻率＞18.2 MΩ·cm）；ProElutLLE 液液萃取柱［5 g/（10 mL），北京迪科馬科技有限公司］；離心管（5 mL，PP材質(zhì)，美國Corning公司）。

8890-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；ME204電子天平（感量0.000 1 g，美國Mettler Toledo 公司）；EOFO-945617 數(shù)顯型多管渦旋混合器（美國Talboys公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 溶劑萃取

稱取0.2 g煙草提取物樣品于5 mL離心管中，再準確移入50 μL濃度為1 000 μg/mL的正十七碳烷乙醇溶液；然后分別加入1.0 mL純水和1.0 mL乙醇，使用渦旋混勻器于1 500 r/min 條件下分散20 min，得樣品萃取液。

1.2.1.2 固相支持液液萃取

先對ProElut LLE+硅藻土固相萃取柱進行活化，即用10 mL 甲醇去雜質(zhì)，排干液體；然后將樣品萃取液全部轉(zhuǎn)入已活化過的固相萃取柱，同時用濃縮瓶接收洗脫液，待上樣溶液全部流入小柱上篩板后，靜置平衡約5 min；隨即用30 mL二氯甲烷分3次對固相萃取柱進行淋洗，并收集所有淋洗液；最后在50 ℃、常壓條件下，將淋洗液濃縮至1 mL左右，再將其轉(zhuǎn)移至2 mL色譜瓶中進行GC-MS分析。分析條件：

色譜柱：HP-5MS 毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（≥99.999%）；進樣口溫度：250 ℃；柱流量：1 mL/min（恒流模式）；進樣量：1 μL；分流比：5∶1；程序升溫：電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：35～550 amu；溶劑延遲：5 min。

1.2.2 定性定量方法

采用組分在質(zhì)譜庫NIST17和FLAVOR2中匹配度≥85%的方法進行定性分析，同時參照文獻［25］的方法計算保留指數(shù)（Retention index，RI），并與文獻資料相關化合物保留指數(shù)進行比對（通過webbook.nist.gov、www.flavornet.org 以及標準譜庫等進行查找），將絕對值相差20以內(nèi)的確定為同一化合物。

采用內(nèi)標法定量，通過內(nèi)標物的峰面積和樣品溶液中各組分的峰面積比值，按公式（1）計算各個組分的相對質(zhì)量濃度：

式中：Ci為待測組分的質(zhì)量濃度，μg/mL；Ai和As為待測組分i 和內(nèi)標化合物的色譜峰面積；V為待測樣品溶液的體積，mL；Ws為加入內(nèi)標化合物的質(zhì)量，μg。本實驗中假定各待測組分i的相對校正因子均為1。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用Agilent MassHunter Unknowns Analysis B10.1 軟件解卷積處理質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，導出轉(zhuǎn)換為cef 格式文件，再導入到Agilent MassHunter Mass Profiler（MPP）15.1軟件中進行峰識別、峰對齊、過濾（在所有樣品中出現(xiàn)50%以上）等前處理，獲得質(zhì)量高的樣品目標組分數(shù)據(jù)矩陣；利用SIMCA-P 14.1軟件對數(shù)據(jù)矩陣進行中心化和歸一化處理后進行主成分分析（Principal components analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）和變量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）值分析，并利用SPSS 26.0 軟件進行方差分析，篩選出組間存在顯著性差異的化合物；采用metaboanalyst（http：//www.metaboanalyst.ca）在線方式繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 分析方法重復性驗證

煙草提取物大多呈半流體狀態(tài)且非常黏稠，加香時常采用混合溶劑使樣品基質(zhì)分散，萃取液中含有部分水分，直接進行GC-MS分析會嚴重影響微量香味成分的定量分析。因此，必須進行溶劑轉(zhuǎn)換，即采用含硅藻土的固相萃取柱進行萃取，使用二氯甲烷洗脫出目標組分，而水、色素大分子以及雜質(zhì)顆粒等被保留在SPE柱填料中?？紤]到樣品處理過程較為復雜，對樣品分析過程的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的可靠性進行監(jiān)測，評估分析方法的重復性和穩(wěn)定性。為此，分別以典型云南煙草提取物和津巴布韋煙草提取物為對象，按照上述樣品前處理方法分別隔日進行3次處理，樣品的GC-MS 總離子流色譜圖如圖1所示，計算共有色譜峰相對于內(nèi)標色譜峰質(zhì)量分數(shù)比值的相對標準偏差（RSD），考察分析方法的重復性。依據(jù)匹配度≥85%的原則，云南煙草提取物中共鑒定出151個共有色譜峰，其中，有132個組分質(zhì)量分數(shù)的RSD 介于0.17%～9.26%之間，其余19個組分介于10.52%～18.21%之間；津巴布韋煙草提取物中共鑒定出162個共有色譜峰，其中，有135個組分質(zhì)量分數(shù)的RSD 介于0.24%～9.65%之間，其余17個組分介于11.93%～19.01%之間。以上結果表明，所有組分的RSD 均小于20%，對于微量目標組分的量化分析而言，該方法具有較好的穩(wěn)定性和重復性，所采集的數(shù)據(jù)可用于進一步研究和分析。本研究中通過多元數(shù)據(jù)分析造成的數(shù)據(jù)誤差是由樣品本身差異造成的，而非系統(tǒng)或分析造成的。

圖1 典型云南（a）和津巴布韋（b）煙草提取物的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of typical tobacco extracts from Yunnan（a）and Zimbabwe（b）

2.2 煙草提取物揮發(fā)性、半揮發(fā)組分分析

對3組煙草提取物中揮發(fā)性、半揮發(fā)化合物進行定性分析的結果見表1?？芍?組煙草提取物樣品中共鑒定出125個揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分，其中除煙堿外，還包括醇類化合物19個、酯類26個、醛類4個、酮類22個、酸類7個、烷烴類19個、烯烴類3個、酚類5個、胺類8個、醚類2個和其他類化合物9個。從化合物官能團分類看，①YN樣品中分離鑒定出的煙堿（64.34%，質(zhì)量分數(shù)，下同）、酯類（9.36%）和胺類（9.09%）化合物質(zhì)量分數(shù)較高，三者在YN 樣品中所占比例約為82.79%；酮類（4.74%）、酸類（4.27%）、醇類（3.63%）、烯烴類（1.64%）、其他類（1.18%）和烷烴類（1.04%）等相對較低；酚類（0.37%）和醚類（0.05%）基本上可忽略不計。其中，除質(zhì)量分數(shù)最高的煙堿外，芥酸酰胺（7.21%）、棕櫚酸（3.77%）、東莨菪內(nèi)酯（3.31%）、丙烯酸十二酯（2.59%）、新植二烯（1.57%）和9-羥基-4，7-巨豆二烯-3-酮（1.31%）的相對質(zhì)量分數(shù)均在1%以上。②JBBW樣品中分離鑒定出的煙堿（49.99%）、醇類（16.17%）和酯類（13.18%）化合物的質(zhì)量分數(shù)較高，三者在JBBW 樣品中共約占79.34%；胺類化合物的質(zhì)量分數(shù)也相對較高，達8.87%；其余則是酮類（3.04%）、醛類（2.03%）、酸類（1.99%）、其他類（1.47%）、烯烴類（1.19%）和烷烴類（1.10%）化合物；酚類（0.85%）和醚類（0.07%）的質(zhì)量分數(shù)較低。其中，除質(zhì)量分數(shù)最高的煙堿和溶劑丙二醇（7.96%）外，芥酸酰胺（7.40%）、乳酸乙酯（5.11%）、O-（4-丁基苯甲酰基）-O'-（異丁氧羰基）-1，2-苯二醇（3.61%）、5-羥甲基糠醛（1.99%）、乳酸甲酯（1.88%）、丙烯酸十二烷基酯（1.78%）、棕櫚酸（1.65%）、東莨菪內(nèi)酯（1.51%）、肼基甲酸乙酯（1.31%）、新植二烯（1.15%）和一縮二丙二醇（1.12%）的相對質(zhì)量分數(shù)較高。③QT樣品中煙堿（59.36%）、酯類（12.48%）和胺類（8.07%）化合物的質(zhì)量分數(shù)較高，三者共占約83.62%；醇類（6.83%）化合物的質(zhì)量分數(shù)也相對較高；其余為酮類（4.04%）、酸類（2.36%）、烯烴類（1.73%）、酚類（1.66%）和其他類（1.53%）化合物，醛類（0.90%）、烷烴類（0.89%）和醚類（0.15%）化合物的質(zhì)量分數(shù)極低。其中，除質(zhì)量分數(shù)最高的煙堿外，芥酸酰胺（7.12%）、棕櫚酸乙酯（4.08%）、東莨菪內(nèi)酯（2.93%）、棕櫚酸（1.75%）、丙烯酸十二烷基酯（1.74%）、豆甾醇（1.73%）、新植二烯（1.68%）和α-生育酚（1.38%）的相對質(zhì)量分數(shù)均在1%以上。由以上結果可見，3 組煙草提取物中所鑒定出的揮發(fā)性、半揮發(fā)性化合物的種類和相對質(zhì)量分數(shù)差異明顯，有利于后續(xù)探尋不同組煙草提取物產(chǎn)地鑒別。

表1 不同煙草提取物樣品揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分測定結果Tab.1 Results of volatile and semi-volatile components in different tobacco extract samples

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

2.3 煙草提取物產(chǎn)地鑒別

2.3.1 主成分和聚類熱圖分析

在對不同煙草提取物揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的相對質(zhì)量分數(shù)總體分析的基礎上，采用無監(jiān)督的PCA 進行分析，結果如圖2所示。根據(jù)PCA 結果，2個PC 成分貢獻率僅占方差的30.4%（其中，PC1 為16.9%，PC2為13.5%），不能反映出樣品的總體特征，而模型的Q2也僅為0.204，遠小于0.5，說明模型并不可靠。3 組煙草提取物樣品大部分均在95%置信橢圓內(nèi)，分布較為無序，部分組樣品之間更是交叉在一起，個別樣品還位于95%置信橢圓外，無法反映不同組樣品之間的差異。

圖2 不同煙草提取物的主成分得分圖Fig.2 PCA score plot of different tobacco extracts

熱圖具有能夠直觀展示重大研究對象的表達數(shù)據(jù)量差異變化情況的優(yōu)勢，可縮小主觀判斷的誤差［9］。因此，為分析不同組煙草提取物樣品之間的差異，采用metaboanalyst 在線方式對3 組煙草提取物進行聚類熱圖分析，結果如圖3所示。在熱圖中，每一行代表了一種揮發(fā)性物質(zhì)，顏色由藍變紅代表質(zhì)量分數(shù)由低到高，反映出各揮發(fā)性成分在不同煙草提取物中質(zhì)量分數(shù)的差異?？芍?，3組煙草提取物樣品分布較為紊亂，部分YN和部分JBBW組內(nèi)樣品分別各自聚集在一起，樣品相互交叉聚合，且與QT 組樣品間隔聚合，說明不同產(chǎn)地煙草提取物揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分種類及質(zhì)量分數(shù)變化較為復雜，不具有明顯的組間聚集規(guī)律，這與主成分分析的結果相對應。因此，有必要進一步對不同煙草提取物中揮發(fā)性、半揮發(fā)性組分進行OPLS-DA篩選研究。

圖3 不同煙草提取物的聚類熱圖Fig.3 Cluster heat map of different tobacco extracts

2.3.2 OPLS-DA分析和產(chǎn)地預測

進一步采用OPLS-DA對YN、JBBW和QT樣品進行分析，以考察YN、JBBW和QT樣品之間的差異特征揮發(fā)性成分。OPLS-DA 是一種基于正交偏最小二乘回歸算法的有監(jiān)督模型，能夠?qū)?shù)據(jù)降維并將無關的信號過濾去除，達到準確區(qū)分組間差異的目的，實現(xiàn)復雜數(shù)據(jù)的可視化、判別分析和預測［27］。由模型得分情況（圖4a）可知，基本上所有樣本均在95%置信區(qū)間內(nèi)，極個別樣品處于置信區(qū)間附近，JBBW 樣品主要分布在左側(cè)象限，QT 和YN 樣品分別位于右側(cè)象限上下兩端，顯示不同組樣品能夠得到有效區(qū)分。使用有監(jiān)督的OPLS-DA 時容易產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象，因此，又采用200次響應的置換檢驗驗證分析模型是否有過擬合現(xiàn)象。如圖4b所示，置換檢驗得到的R2=0.837，Q2=-0.778，Q2于Y 軸的截距是負值，說明此模型沒有過擬合現(xiàn)象，模型預測能力好，可用于后續(xù)的不同樣品組間差異特征揮發(fā)性成分篩選。

OPLS-DA 因子載荷圖可直觀地反映出每一個變量在得分圖上的貢獻［18］。對不同煙草提取物中主要揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進行分析，結果如圖4c 所示。區(qū)別于JBBW 和QT 樣品，A4（絲氨醇）、B4（γ-丁內(nèi)酯）、D1（4-環(huán)戊烯-1，3-二酮）、D7（2，2，5-三甲基-3，4-己二酮）、D9（2，5-二甲基-3-己酮）、H2（菜籽多酚）、F13（1-碘十二烷）、G1（4-乙酰氧基-3-甲氧基苯乙烯）、K7（2-芐基硫基-4-甲氧基苯甲腈）等成分是凸顯YN樣品特征的物質(zhì)組分；區(qū)別于YN和QT樣品，B1（乳酸乙酯）、F19（3-甲基三十一烷）、A7［2-（2-羥基丙氧基）-1-丙醇］、A8（一縮二丙二醇）、B13（5-羥基戊酸2，4-二叔丁基苯酯）等成分是凸顯JBBW樣品特征的組分，以酯類和醇類較為突出；區(qū)別于YN 和JBBW 樣品，H5（α-生育酚）、K1（2-羥基-5-甲基吡啶）、B3（1-羥基-2-丙基乙酸酯）、E2（乙酰丙酸）、D19（6，7-二甲氧基-1，4-二氫-2，3-喹喔啉二酮）、D6［5-（羥甲基）二氫呋喃-2（3H）-酮］和D2（2-吡咯烷酮）等成分是QT組煙草提取物的特征組分。

圖4 不同煙草提取物的OPLS-DA圖Fig.4 OPLS-DA plots of different tobacco extracts

OPLS-DA 模型不僅能夠驗證3 組煙草提取物的分類結果，并且能夠預測未知煙草提取物的類別。本研究中OPLS-DA 模型由每個實際煙草提取物構建，3 組樣品具有良好的分類。在預測之前，先對該模型進行訓練，判斷模型的準確度，結果如表2所示，準確度均為100%，識別率高達100%。說明該模型準確度較高，可用于下一步的樣本預測［20，26］。為了證明該模型的預測能力，除了用于尋找特征差異物和建立分類模型的64個煙草提取物樣品外，又使用19個不同產(chǎn)地的煙草提取物，導入OPLS-DA 模型進行預測，所有不同組預測樣本均沒有出現(xiàn)分類錯誤，模型預測結果與實際樣本產(chǎn)地結果均一致，準確度為100%。進一步表明構建的OPLS-DA模型具有良好的預測能力，能夠?qū)υ颇?、津巴布韋和其他產(chǎn)地煙草提取物進行正確分類，可用于煙草提取物的產(chǎn)地溯源。

表2 OPLS-DA模型預測煙草提取物的分類結果Tab.2 Classification results of tobacco extracts predicted by OPLS-DA model

2.3.3 不同組煙草提取物特征成分比較

變量投影重要性（VIP）可用于篩選對不同煙草提取物有重要影響的關鍵標記物。如圖5所示，51個VIP 值大于1 的揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物在判別中具有重要作用。對VIP 大于1 的變量進行單因素方差分析共篩選出16個特征揮發(fā)性成分，以P＜0.01表示極顯著差異的成分，P＜0.05 表示顯著差異的成分，其中，在YN、JBBW 和QT 樣品中的相對質(zhì)量分數(shù)差異結果見表3。對比YN和JBBW兩組煙草提取物，A4（絲氨醇）、A8（一縮二丙二醇）、B1（乳酸乙酯）、B4（γ-丁內(nèi)酯）和D1（4-環(huán)戊烯-1，3-二酮）5個成分具有極顯著差異，其中一縮二丙二醇為丙二醇的縮合物，非煙草本身含有的組分；對比YN 和QT樣品，A4（絲氨醇）和B2（2-羥基丙基乙酸酯）具有極顯著性差異；對比JBBW和QT樣品，B1（乳酸乙酯）、F19（3-甲基三十一烷）和K1（2-羥基-5-甲基吡啶）3個成分具有極顯著性差異。結合表3中均值排序，絲氨醇、γ-丁內(nèi)酯和4-環(huán)戊烯-1，3-二酮的P值均小于0.01，且對YN 樣品具有較好的辨別能力，可作為鑒別YN樣品的特征性組分；2-（2-羥基丙氧基）-1-丙醇、乳酸乙酯、間苯二甲酸二（4-辛基）酯和3-甲基三十一烷均對JBBW 樣品具有相對較好的辨別能力，其中乳酸乙酯具有極顯著差異，可作為鑒別JBBW樣品的特征性組分；2-羥基丙基乙酸酯和1-羥基-2-丙基乙酸酯在QT 樣品中質(zhì)量分數(shù)均值高，相比于YN 和JBBW 樣品均具有顯著差異，可作為QT樣品的特征性組分。

圖5 不同煙草提取物樣品特征揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分的VIP圖Fig.5 VIP analysis of characteristic volatile and semi-volatile components in different tobacco extract samples

表3 不同煙草提取物樣品特征揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分差異比較Tab.3 Comparison of characteristic volatile and semi-volatile components among different tobacco extract samples

3 結論

①通過固相支持液液萃取-GC-MS 方法，結合化學計量學手段，確定了云南、津巴布韋和其他煙草提取物中共125個揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分，其中煙堿的質(zhì)量分數(shù)最高；②PCA和聚類熱圖分析表明，不同組樣品分類不明顯，而OPLS-DA對不同組煙草提取物區(qū)分效果較好，模型訓練和預測的準確度均為100%；③篩選出16個特征揮發(fā)性物質(zhì)，其中，云南、津巴布韋和其他產(chǎn)地煙草提取物中分別篩選出3個、1個和2個可有效表征煙草提取物產(chǎn)地的特征組分。相比于常規(guī)采用的感官評價方法，本方法具客觀、準確度高的特點，可為煙草提取物的質(zhì)量鑒別與產(chǎn)地溯源提供方法參考。