邢國(guó)珍，孫 帥，李 旭，邱 睿，程 琨，李 博，陳佳敏，何 雷，李淑君，鄭文明*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63號(hào) 450002

2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道與青梅路交叉口 461000

3.中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州市金水區(qū)商務(wù)外環(huán)15號(hào) 450018

近年來(lái)，由于煙草栽培制度、氣候變化以及品種單一等問題，導(dǎo)致煙草病害呈現(xiàn)多發(fā)且加重的趨勢(shì)［1］。煙草根莖類病害是制約煙草生產(chǎn)發(fā)展的重要因素，常見的有鐮刀菌根腐病、黑脛病、根黑腐病以及由擬莖點(diǎn)霉屬引起的擬莖點(diǎn)霉莖枯病等。擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）是半知菌亞門、腔孢綱、球殼孢目中的一個(gè)真菌屬，是重要的病原菌和內(nèi)生真菌［2］。目前該屬真菌已達(dá)900多種，主要危害被子植物和裸子植物，有時(shí)還可能侵染苔蘚或蕨類植物，引起植物莖枯、潰爛、根腐和葉枯等多種癥狀［3-4］。近年來(lái)，已有報(bào)道擬莖點(diǎn)霉在多種重要經(jīng)濟(jì)作物上造成嚴(yán)重危害，姜淑霞等［5］在山東泰安、臨沂等地發(fā)現(xiàn)一種新的病原菌，通過形態(tài)學(xué)特征鑒定和rDNA-ITS序列比對(duì)分析，將其定名為板栗擬莖點(diǎn)霉（P.castaneae mollissima）。紀(jì)兆林等［6］結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、rDNA-ITS序列比對(duì)分析和致病性測(cè)定結(jié)果，確定了江蘇、浙江桃枝枯病病原菌為桃擬莖點(diǎn)霉（P.amygdali）。在煙草上，自2013年首次報(bào)道煙草擬莖點(diǎn)霉引起的煙草莖枯病為煙草新病害以來(lái)，擬莖點(diǎn)霉莖枯病已成為煙草生產(chǎn)上日益嚴(yán)重的病害之一［7］。煙草真菌病害?；旌习l(fā)病，病害癥狀往往較為相似，特別是在發(fā)病早期難以通過癥狀來(lái)快速準(zhǔn)確判斷為何種病原菌引起的病害。根莖類病害的防治難度大，快速鑒定根莖類病害的病原菌同時(shí)明確其種類以及分布情況是開展煙草根莖類病害防控的基礎(chǔ)。

隨著基因組學(xué)技術(shù)快速發(fā)展和生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，分子檢測(cè)已成為植物病害早期快速檢測(cè)的主要方式［8］。Liu 等［9］綜合使用ITS 和β-Tublin 序列建立了煙草黑脛病和根黑腐病雙重PCR 檢測(cè)技術(shù)。謝中玉等［10］利用q-PCR建立了煙草赤星病的檢測(cè)體系。王井田等［11］通過田間和鏡檢試驗(yàn)研究了獼猴桃擬莖點(diǎn)霉侵染規(guī)律，發(fā)現(xiàn)該病菌在越冬過程中多以菌絲體或孢子器附著于病枝、病殘?bào)w和殘留果梗上，待次年春季孢子則大面積傳播，以侵染幼果為主，該病癥早期不明顯，直到果實(shí)成熟或采收后才開始緩慢顯現(xiàn)［12］，因此建立病原菌早期侵染檢測(cè)方法非常必要。王云飛等［13］通過對(duì)已報(bào)道的鐮孢屬reductase-like基因序列的比對(duì)分析，在SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，可檢測(cè)出南方鐮孢Fusarium meridionale，檢測(cè)靈敏度為500 pg/μL 基因組DNA。代玉立等［14］依據(jù)GenBank中已登錄的玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型基因序列，建立的特異性多重PCR 檢測(cè)方法靈敏度達(dá)到10 pg/μL 基因組DNA。而目前有關(guān)煙草根莖病害的PCR快速分子檢測(cè)的報(bào)道較少，煙草擬莖點(diǎn)霉分子檢測(cè)方法則鮮見報(bào)道。為此，根據(jù)煙草擬莖點(diǎn)霉病原菌rDNA-ITS區(qū)域設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，并優(yōu)化建立了煙草擬莖點(diǎn)霉的PCR 分子檢測(cè)技術(shù)體系，旨在為該病害的防治和病情預(yù)警提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2016—2018年在河南省煙草主產(chǎn)區(qū)采集發(fā)病煙株，利用PDA培養(yǎng)法分離鑒定出11種病原菌，見表1。

表1 河南煙田病害的病原菌Tab.1 Pathogens in tobacco fields from Henan Province

1.2 基因組DNA的制備

將分離純化的病原菌菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d，收集菌絲體。采用CTAB 法［15］提取病原菌基因組DNA，于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 特異性引物的設(shè)計(jì)

利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)病原菌的rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，共得到11條序列，見圖1。利用DNAMAN軟件對(duì)11條序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇這11 條序列中堿基差異較大的區(qū)域，通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性的上下游引物P2F/P3R和P3F/P3R，見表2。

圖1 通用引物ITS1和ITS4對(duì)11種病原菌的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of 11 pathogens with universal primers ITS1 and ITS4

表2 擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis sp.）引物序列信息Tab.2 Sequences of primers for Phomopsis sp.

1.4 引物特異性鑒定

將設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)11個(gè)病原菌基因組DNA和陰性對(duì)照（ddH2O）進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件：反應(yīng)總體積20 μL，包括2×PCR mixture 10 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 反應(yīng)在ABI 梯度PCR 儀器完成。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃10 min，終止反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增出的條帶大小與引物設(shè)計(jì)時(shí)理論條帶大小是否一致來(lái)判斷引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用于克隆和測(cè)序分析。

1.5 特異性引物靈敏度鑒定

用滅菌超純水（ddH2O）將煙草擬莖點(diǎn)霉的基因組DNA 模板進(jìn)行梯度稀釋，分別為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL和10 fg/μL，并以此系列濃度的基因組DNA為模板對(duì)所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢驗(yàn)引物的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

用通用引物ITS1 和ITS4 分別對(duì)11個(gè)病原菌基因組DNA 進(jìn)行溫度梯度PCR 檢測(cè)，在55 ℃、60 ℃和65 ℃退火溫度條件下分別進(jìn)行擴(kuò)增。在60 ℃退火溫度條件下11 種病原菌的擴(kuò)增條帶單一，且擴(kuò)增效率高。因此，選擇60 ℃為最適退火溫度。

2.2 特異性引物的設(shè)計(jì)

在60 ℃退火溫度條件下，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，共獲得11 條DNA 序列。11 條DNA 序列比對(duì)結(jié)果以及特異性引物對(duì)P2F/P3R 和P3F/P3R 的位點(diǎn)見圖2和圖3。

圖2 病原菌rDNA-ITS序列比對(duì)及特異性引物P2F/P3R的位點(diǎn)Fig.2 Sequence alignment of rDNA-ITS regions of pathogens and locations of specific primers P2F/P3R

圖3 病原菌rDNA-ITS序列比對(duì)及特異性引物P3F/P3R的位點(diǎn)Fig.3 Sequence alignment of rDNA-ITS regions of pathogens and locations of specific primers P3F/P3R

2.3 引物特異性的檢測(cè)

利用特異性引物P2F/P3R對(duì)11種煙草常見病原菌DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，僅有擬莖點(diǎn)霉的DNA能夠擴(kuò)增出1條420 bp的清晰條帶，見圖4。特異性引物P3F/P3R 對(duì)11 種煙草病原菌DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，僅有擬莖點(diǎn)霉的DNA 能夠擴(kuò)增出1 條381 bp的清晰條帶，見圖5。擴(kuò)增條帶經(jīng)測(cè)序，并將序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果表明該片段與擬莖點(diǎn)霉ITS序列一致性達(dá)到99%。因此，確定為擬莖點(diǎn)霉序列。

圖4 引物P2F/P3R的特異性PCR擴(kuò)增Fig.4 Specific PCR amplification with primers P2F/P3R

圖5 引物P3F/P3R的特異性PCR擴(kuò)增Fig.5 Specific PCR amplification with primers P3F/P3R

2.4 引物的靈敏度鑒定

以10 倍梯度稀釋的煙草擬莖點(diǎn)霉基因組DNA（100 ng/μL～10 fg /μL）為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢驗(yàn)特異性引物的靈敏度，結(jié)果見圖6和圖7。當(dāng)PCR體系中含有≥10 pg 模板時(shí)，特異性引物P2F/P3R 和P3F/P3R均能擴(kuò)增出清晰的目的條帶。因此，引物靈敏度較高。

圖6 P2F/P3R引物對(duì)的靈敏度鑒定Fig.6 Sensitivity identification of primer pair P2F/P3R

圖7 P3F/P3R引物對(duì)的靈敏度鑒定Fig.7 Sensitivity identification of primer pair P3F/P3R

3 結(jié)論

利用真菌rDNA-ITS 通用引物在擬莖點(diǎn)霉和其他10 種煙草病原菌DNA 中進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增、片段回收和DNA 測(cè)序。在序列差異區(qū)設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異檢測(cè)引物，并鑒定了引物的靈敏度和特異性，優(yōu)化建立了PCR反應(yīng)體系。在退火溫度為60 ℃時(shí)，兩對(duì)特異性引物P2F/P3R 和P3F/P3R 分別從煙草擬莖點(diǎn)霉DNA樣本中擴(kuò)增出420 bp和381 bp的特異性條帶，而在其他10個(gè)煙草病原菌DNA 以及陰性對(duì)照（ddH2O）中均不能擴(kuò)增出任何條帶。兩對(duì)特異性引物的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到10 pg/μL，可實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草擬莖點(diǎn)霉的快速和準(zhǔn)確檢測(cè)。