賀曉嵐，王建偉，陳新宏，李文旭，秦紹釗，湯 宏，吳顯芝

（1.凱里學(xué)院，a大健康學(xué)院，b.理學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；3,河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，鄭州 450002）

干旱、寒冷及高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，小麥（TriticumaestivumL.）是世界最重要的糧食作物之一，而每年因干旱、寒冷及高鹽等逆境所造成的減產(chǎn)約占世界小麥減產(chǎn)總量的70%，小麥生產(chǎn)受到了嚴(yán)重限制［1］。因此，挖掘并克隆抗旱、抗寒及抗鹽脅迫關(guān)鍵基因并轉(zhuǎn)入小麥，改善和提高小麥對(duì)非生物脅迫的抗性是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要目標(biāo)之一。

果聚糖是具有可溶性和黏性的聚合多糖，是溫帶和寒冷地區(qū)植物組織中重要的能量貯藏物質(zhì)，15%的被子植物其碳水化合物的主要儲(chǔ)存形式為果聚糖，如菊科、百合科和禾本科植物［2］。果聚糖不僅是植物重要的能量貯藏物質(zhì)，而且是參與植物生命代謝的重要物質(zhì)。植物可通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)果聚糖代謝來(lái)維持胞內(nèi)滲透壓及細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而應(yīng)對(duì)多種環(huán)境脅迫［3］。植物體內(nèi)果聚糖積累含量的提高有助于其抗旱、抗寒、抗鹽、耐貧瘠及抗土壤重金屬毒害能力的提高［4-8］。據(jù)報(bào)道，麥類植物中的果聚糖由3種酶參與合成，其中，蔗糖：果聚糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶（Sucrose：fructan 6-fructosyltransferase，6-SFT）是其關(guān)鍵酶［9］。自Sprenger等［10］首次從大麥中克隆到6-SFT基因以來(lái)，目前已在多種植物如小麥［11］、早熟禾［12］、梯牧草［13］、雀麥［14］、華山新麥草［4］、簇毛麥［5］和濱麥［15］等中成功分離到該基因，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證研究。大量研究表明，草本植物的6-SFT基因轉(zhuǎn)入煙草及擬南芥等植物時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株中果聚糖含量增加，抗逆境脅迫能力增強(qiáng)［4，5，15，16］。華山新麥草和簇毛麥均為多年生草本植物，華山新麥草具有早熟、耐旱、抗寒、抗鹽、抗病等優(yōu)異性狀［17］，簇毛麥具有抗旱、抗寒、抗鹽、抗多種病害及分蘗力強(qiáng)、小穗數(shù)多等優(yōu)良性狀［18］，因此華山新麥草和簇毛麥均為小麥遺傳改良的優(yōu)異野生基因資源。標(biāo)記基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用是篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但是如果其長(zhǎng)期存在于轉(zhuǎn)基因植物中，可能存在潛在的環(huán)境和食品安全等問(wèn)題，尤其對(duì)于糧食植物來(lái)說(shuō)，影響其商業(yè)化審批［19］。因此，采用共轉(zhuǎn)化法獲得無(wú)載體骨架序列無(wú)抗生素標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因小麥至關(guān)重要。

6-SFT基因功能在擬南芥、水稻等模式植物中被廣泛研究，但是對(duì)于華山新麥草和簇毛麥6-SFT基因轉(zhuǎn)化普通小麥的研究卻很少，而關(guān)于華山新麥草和簇毛麥6-SFT基因與篩選標(biāo)記基因以最小表達(dá)盒形式共轉(zhuǎn)化小麥的研究更是鮮有報(bào)道。本研究利用bar基因作為篩選標(biāo)記基因，通過(guò)基因槍法將Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因轉(zhuǎn)入小麥幼胚中，以期獲得含Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因的轉(zhuǎn)基因小麥，旨在探索利用Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因改良小麥抗旱、抗寒、抗鹽等性狀的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通小麥‘科農(nóng)199’（Kenong199，2n=6x=42，AABBDD）為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料。試驗(yàn)所用質(zhì)粒為 pCAMBIA1301-35SN 和 pEasy-Blunt-bar。pCAMBIA1301-35SN含Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因，pEasy-Blunt-bar含bar篩選基因，pCAMBIA1301-35SN由來(lái)自花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，pEasy-Blunt-bar由玉米Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（圖1），均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

圖1 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus和bar基因最小表達(dá)盒

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒提取及表達(dá)盒制備 挑取單菌落，在液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8。用天根生化科技（北京）有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取高質(zhì)量質(zhì)粒，用EcoRI、SphI和PmeI內(nèi)切酶分別切割pCAMBIA1301-35SN+Ph-6-SFT或CAMBIA1301-35SN+Dv-6-SFT和pEasy-Blunt-bar環(huán)形質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus和bar基因表達(dá)盒，分別將回收產(chǎn)物濃縮至1μg/μL，保存于-20°C冰箱備用。

1.2.2 受體材料的培養(yǎng) 取開(kāi)花授粉后12～16 d未成熟子粒，用70%的乙醇表面消毒1 min，10%NaClO消毒15 min，無(wú)菌水沖洗3～4次，然后在超凈臺(tái)上借助解剖鏡用解剖鑷子剝?nèi)∮着?，切去胚軸，盾片平面向上接種于含甘露醇9%的MS（Murashige and skoog）培養(yǎng)基（MS+2 mg/L 2，4-D+9%甘露醇）上作滲透培養(yǎng)，置22～23℃暗培養(yǎng)4 h后用于轟擊。

1.2.3 基因槍轟擊及組織培養(yǎng) 基因槍轉(zhuǎn)化及篩選過(guò)程參照賀曉嵐等［19］方法。取50μL直徑0.6μm金粉顆粒懸浮液（20 mg/mL），加入4μL總濃度1μg/μL的混合質(zhì)粒DNA（表1），在2.5 mol/L氯化鈣50μL，0.1 mol/L亞精胺20μL的參與下，將混合質(zhì)粒DNA沉淀并包被在金粉粒（Bio-Rad，美國(guó)）上，取包被有

表1 混合質(zhì)粒DNA的配比

DNA的金粉懸浮液，用150μL無(wú)水乙醇清洗2次，最后懸浮于85μL無(wú)水乙醇中，置冰上待用。將包被有DNA的金粉懸浮液涂于載體膜上，每片5μL，待干燥后用于轟擊。每次涂液前將懸浮液漩渦處理使之混合均勻。用PDS-1000/He基因槍（Bio-Rad公司）轟擊，用草丁膦（Phosphinothricin，PPT）作篩選劑，轟擊參數(shù)及篩選培養(yǎng)方法同賀曉嵐等［19］。

1.2.4 GUS組織化學(xué)染色 對(duì)轟擊3 d后的轉(zhuǎn)化幼胚（隨機(jī)取3個(gè)皿，每皿10個(gè)幼胚進(jìn)行GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)），T0代全部植株的少許葉片及T1代全部種子（半粒不帶胚的種子）進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，將需要鑒定的組織材料放入X-gluc反應(yīng)液中，真空抽氣6 min，37℃溫育5 h以上。葉片染色后，在光照條件下，用70%的乙醇脫色24 h，然后觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.2.5 候選轉(zhuǎn)化株DNA提取及PCR檢測(cè) 提取除草劑抗性小麥植株的DNA［20］并進(jìn)行g(shù)us基因的PCR檢測(cè)，gus基因的引物序列GUSF：AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC（5′→3′），GUSR：ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA（5′→3′），gus基因片段預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 051 bp，PCR反應(yīng)參數(shù)：循環(huán)38次，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，凝膠電泳檢測(cè)特異條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥轉(zhuǎn)化植株的bar篩選

Ph-6-SFT+gus或Dv-h-6-SFT+gus表達(dá)盒分別與bar表達(dá)盒按物質(zhì)的量比1∶2混合，用金粉包被后，在相同轟擊參數(shù)條件下，轉(zhuǎn)化科農(nóng)199幼胚，誘導(dǎo)愈傷，愈傷組織體積膨大，分化出綠色小芽（圖2a、圖2b、圖2c、圖2d），將再生組織轉(zhuǎn)到第一輪再生篩選RDZ+2.5 mg/L PPT培養(yǎng)基篩選21 d，有少量根系長(zhǎng)出（圖2e）；第二輪再生篩選在RDZ+3.5 mg/L PPT培養(yǎng)基篩選21 d，有大量根系和葉片長(zhǎng)出（圖2f）；然后，將抗性植株轉(zhuǎn)到R培養(yǎng)基上壯根10～15 d（圖2g），轉(zhuǎn)入花盆培育至成熟（圖2h、圖2i、圖2j）。

圖2 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus轉(zhuǎn)化普通小麥‘科農(nóng)199’的全過(guò)程

2.2 小麥轉(zhuǎn)化植株的GUS組織化學(xué)染色鑒定

打槍3 d后進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)部分結(jié)果見(jiàn)圖3a，T0代各株轉(zhuǎn)基因植株葉片GUS組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖3b，各株轉(zhuǎn)基因植株T1代種子GUS組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖3c。共獲得2株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，并且只有1株（轉(zhuǎn)Dv-6-SFT+gus基因）結(jié)實(shí)。

圖3 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus瞬時(shí)及穩(wěn)定表達(dá)

2.3 小麥轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定

提取抗性篩選所獲植株葉片的基因組DNA，通過(guò)PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因植株，gus基因的部分電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。共獲得2株轉(zhuǎn)基因植株，其中僅1株轉(zhuǎn)Dv-6-SFT基因的植株可正常開(kāi)花、結(jié)實(shí)。

圖4 部分轉(zhuǎn)Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gusT0代小麥PCR檢測(cè)

2.4 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus基因的轉(zhuǎn)化率

分別對(duì)419和532個(gè)被轟擊幼胚進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，并用PPT進(jìn)行再生篩選，分別獲得146和187株再生植株，其中PCR陽(yáng)性植株分別為4株和6株，GUS組織化學(xué)染色陽(yáng)性植株均為1株，最終轉(zhuǎn)化率分別為0.24%和0.19%（表2）。

表2 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus基因的轉(zhuǎn)化率

3 討論

果聚糖代謝不僅與植物碳素分配、源庫(kù)關(guān)系調(diào)節(jié)和非生物脅迫抗性密切相關(guān)，而且其產(chǎn)品作為一種益生素對(duì)人體健康十分重要。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高重要作物果聚糖含量的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。小麥抗逆基因工程研究雖然取得了一定進(jìn)展，但是由于其基因組龐大，遺傳背景復(fù)雜，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化效率低，受體十分狹窄，并且與其他作物如水稻、玉米、大豆等相比，獲得單拷貝、純合、穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株難度較大。本試驗(yàn)所轉(zhuǎn)Ph-6-SFT+gus和Dv-6-SFT+gus基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化煙草并進(jìn)行了抗旱、抗寒及抗鹽鑒定。本研究證明用這2個(gè)基因分別轉(zhuǎn)化小麥均獲得了成功。其中轉(zhuǎn)Dv-6-SFT+gus基因的小麥植株可正常開(kāi)花、結(jié)實(shí)，轉(zhuǎn)Dv-6-SFT+gus基因的小麥植株有望提高其非生物脅迫抗性。通過(guò)賀曉嵐等［19］建立的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系，本研究成功地將2個(gè)功能基因轉(zhuǎn)入小麥，經(jīng)PCR及GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)，最終得到了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，但與目前有關(guān)報(bào)道相比，本研究具有較低的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化頻率，其原因是錯(cuò)過(guò)了最佳取樣時(shí)期，并且剝胚數(shù)較少。

本研究對(duì)無(wú)篩選標(biāo)記無(wú)載體骨架轉(zhuǎn)化技術(shù)的深入研究及應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)除優(yōu)良性狀目的基因外，其他基因或序列零轉(zhuǎn)入，為普通小麥轉(zhuǎn)基因生物安全提供了參考依據(jù)。今后的工作重點(diǎn)是對(duì)后代植株進(jìn)行抗性鑒定，獲得純合轉(zhuǎn)化植株。

4 結(jié)論

本研究以bar為篩選標(biāo)記基因，通過(guò)基因槍介導(dǎo)法將Ph-6-SFT或Dv-6-SFT共同導(dǎo)入普通小麥‘科農(nóng)199’幼胚愈傷組織中，分子鑒定結(jié)果表明Ph-6-SFT和Dv-6-SFT基因已分別整合到小麥基因組中，獲得了無(wú)抗生素標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因小麥，為小麥抗逆育種奠定了基礎(chǔ)。