楊 立，伍 濤，劉 政，程寅勝，李謝雨，聶顯雙，秦仲麒

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/湖北省梨工程技術(shù)研究中心，武漢 430070）

梨（PyrusL.）屬于薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）或梨亞科（Pomideae）［1］，是世界五大水果之一，深受人們青睞。隨著現(xiàn)代水果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，消費(fèi)市場對梨綜合品質(zhì)的要求不斷升級。因此，利用基因工程手段定向培育農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種是現(xiàn)代果樹育種長期關(guān)注的重點(diǎn)。

遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程的重要環(huán)節(jié)，高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)是進(jìn)行果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究的關(guān)鍵。盡管梨樹中山梨、碭山酥梨等品種已建立了遺傳轉(zhuǎn)化再生植株體系［2，3］，但普遍存在轉(zhuǎn)化效率低的問題。愈傷組織是已分化的細(xì)胞回到脫分化的分生細(xì)胞狀態(tài)，更易于接受外源基因，在理論上作為受體的轉(zhuǎn)化效率更高。隨著愈傷組織在果樹遺傳轉(zhuǎn)化功能分析中的成功應(yīng)用［4-6］，有必要在‘Conference’梨中建立一套高效且可持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的愈傷組織無性系。

正交設(shè)計(jì)是研究與處理多因素試驗(yàn)的一種科學(xué)方法，可以實(shí)現(xiàn)最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到與大量全面試驗(yàn)等效的結(jié)果［7］。因此，本研究以‘Conference’為試材，通過正交設(shè)計(jì)研究不同外植體和生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織形成的影響，以期篩選得到最佳試驗(yàn)方案，建立一套成熟穩(wěn)定的梨無性培養(yǎng)系，為后期開展遺傳轉(zhuǎn)化的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為西洋梨品種‘Conference’無菌苗，為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)洪霓教授贈予，后實(shí)驗(yàn)室繼代保存。在無菌條件下，選擇長勢良好的植株作為試驗(yàn)接種的對象，分別剪取葉片（5 mm×5 mm）、葉柄（約0.5 mm）及帶芽的莖段（5～10 mm）為外植體。

1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3因素3水平正交試驗(yàn)，3因素為外植體和加入培養(yǎng)基中的TDZ和IBA，3水平因素與水平見表1［7］。

表1 L 9（34）正交試驗(yàn)因素與水平

1.3 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS，含6.5 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖，pH為5.8～5.9，培養(yǎng)溫度（25±0.2）℃，24 h暗培養(yǎng)。每個處理設(shè)置4～5個培養(yǎng)瓶，每瓶各接種10～15個外植體。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)各處理的外植體愈傷組織誘導(dǎo)率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)

對愈傷誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，因?yàn)椴糠痔幚斫M的脫分化率不在30%～70%，為提高顯著性檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度，對誘導(dǎo)率進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換［8］（表2）。

表2 正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過外植體、TDZ、IBA 3因素3水平共9個組合的正交試驗(yàn)，不同組合對誘導(dǎo)愈傷組織再生影響各不相同。組內(nèi)因素水平極差值（R）反映了該因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度。由表3可知，設(shè)計(jì)的3個因素對愈傷組織誘導(dǎo)作用主次關(guān)系為B＞A＞C，即培養(yǎng)基中TDZ的濃度＞外植體的類型＞IBA濃度。根據(jù)各因素平均值（Ki）的大小，可得出最優(yōu)組合為A1B3C3，即以莖段為外植體，置于培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA的組合條件下培養(yǎng)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。

表3 愈傷組織正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析（單位：%）

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果的方差分析及多重比較

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果方差分析 試驗(yàn)結(jié)果sin-1X的方差分析見表4。因素B對試驗(yàn)結(jié)果的影響具有顯著性（P＜0.05），在本試驗(yàn)組合中，TDZ濃度的高低能顯著影響梨組織的愈傷組織形成，同時，外植體類型（A）和生長調(diào)節(jié)劑IBA（C）對愈傷組織是否形成的影響不顯著。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.2.2 不同水平間的多重比較 不同水平之間多重比較的結(jié)果見表5，A1和A3、A3和A1、B1和B2、B1和B3、B2和B1、B3和B1水平之間呈顯著差異（P＜0.05）。但平均誘導(dǎo)率B3（62.21%）比B2（57.12%）高5.09個百分點(diǎn)，C3（63.85%）比C1（37.84%）高26.01個百分點(diǎn)，盡管B3和B2、C3和C1之間無顯著差異，但可以獲得更多的愈傷組織，因此因素B、C的最佳選項(xiàng)為B3和C3水平。

表5 不同水平間的多重比較分析

3 小結(jié)與討論

植物的再生途徑有多種方式，可通過根［9］、胚胎和子葉［10］、原生質(zhì)體［11，12］再生，或愈傷組 織再分化［13，14］等。王關(guān)林等［15］認(rèn)為，用于基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，其再生率一般80%～90%。其中，愈傷組織是經(jīng)歷了脫分化的分生細(xì)胞，分裂周期短、擴(kuò)大培養(yǎng)后易獲得大量受體細(xì)胞，因此，具有更明顯的轉(zhuǎn)化優(yōu)勢。

在本試驗(yàn)中，TDZ和IBA對試驗(yàn)結(jié)果有影響，誘導(dǎo)率由大到小依次為B3、B2、B1，C3、C2、C1，證明在適宜濃度范圍內(nèi)，愈傷誘導(dǎo)率與培養(yǎng)基中TDZ或IBA的濃度呈正比。盡管生長素在細(xì)胞脫分化過程中起主要作用，但當(dāng)配合一定濃度細(xì)胞分裂素時，誘導(dǎo)效果更明顯。例如，在IBA（C）濃度為0.1 mg/L時，B3C1組合中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為77.78%，當(dāng)IBA濃度為0.5 mg/L時，誘導(dǎo)效率達(dá)到100%。本研究獲得了‘Conference’梨大量的愈傷組織，以用于植物瞬時表達(dá)分析或優(yōu)化構(gòu)建植物再生轉(zhuǎn)化體系，為后期深入開展基因功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。