劉 芳，張志剛，方 偉，王開梅，2，王月瑩

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物農(nóng)藥創(chuàng)制重點實驗室/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心，武漢 430064；2.洪山實驗室，武漢 430070）

熱休克應(yīng)答（Heat shock response）是生物體受熱激誘導(dǎo)所進行的一種轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控，暫時性抑制一些參與細胞正常功能的蛋白合成，同時啟動一組保守的蛋白——熱休克蛋白（Heat-shock proteins，Hsp）的合成。熱休克蛋白最早于1962年在昆蟲中被發(fā)現(xiàn)［1］，是機體為響應(yīng)環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的一類重要的分子伴侶蛋白，直接參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)從初始鏈的聚合到多亞基復(fù)合體層疊、組裝等多個生物過程［2，3］。在昆蟲中，熱休克蛋白廣泛表達，在增強昆蟲對非生物和生物脅迫的耐受以及調(diào)節(jié)正常發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用［4，5］。根據(jù)分子質(zhì)量和功能，昆蟲熱休克蛋白可分為4大家族：小熱休克蛋白（Small heat-shock proteins）、Hsp60、Hsp70和Hsp90［5］。多種昆蟲的熱休克蛋白可被非生物脅迫誘導(dǎo)表達和調(diào)控，包括極端溫度［6-8］、紫外線輻射［9，10］、農(nóng)藥［11，12］、重金屬［13，14］、干燥［15-17］、饑餓［18，19］和缺氧［20-22］，以及寄生蟲［23，24］、病原體［25，26］和高種群密度［27］等生物傷害。研究昆蟲熱休克蛋白和溫度等環(huán)境條件的關(guān)系，有利于了解昆蟲生長發(fā)育對環(huán)境因素的依賴規(guī)律。

草地貪夜蛾屬于鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾屬（Spodoptera），又名秋黏蟲，廣泛分布于美洲大陸熱帶和亞熱帶地區(qū)，是玉米和其他主要經(jīng)濟作物重要的遷飛性害蟲之一［28-30］。具有寄主廣泛、適生范圍廣泛、遷飛速度快、繁殖能力強、防控難度大等特點，在國際上有“無敵破壞王”之稱，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織全球預(yù)警的遷飛性農(nóng)林業(yè)重大害蟲［31］。它們主要為害水稻、玉米、甘蔗高粱、大豆等186種重要農(nóng)作物［32，33］。2016年起，草地貪夜蛾散播至非洲、亞洲各國，并于2019年1月起出現(xiàn)在中國，發(fā)生面積超過3 333.33 km2［34］，已在多國造成巨大的農(nóng)業(yè)損失。其危害的潛在風(fēng)險較大，今后在中國有可能常態(tài)化發(fā)生［33］，將對華南、黃淮海及北方玉米主產(chǎn)區(qū)的玉米生產(chǎn)和中國糧食生產(chǎn)安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅［35］。

春夏季節(jié)氣溫升高，導(dǎo)致草地貪夜蛾向北遷移，而秋季時，隨著光照時間逐漸縮短且溫度逐漸降低，草地貪夜蛾又會回遷［36］。在大范圍的遷飛定居過程中，草地貪夜蛾需要面對各種環(huán)境的脅迫。不良環(huán)境脅迫因子會對昆蟲的生存、發(fā)育與繁殖產(chǎn)生威脅。高溫會導(dǎo)致昆蟲蛹羽化率低和壽命短等現(xiàn)象［37，38］；低溫則影響昆蟲的存活率［39］。為了應(yīng)對不良環(huán)境，昆蟲能夠通過改變蟲體結(jié)構(gòu)和物質(zhì)能量代謝以適應(yīng)環(huán)境脅迫。大量研究表明，昆蟲響應(yīng)環(huán)境脅迫的機制與特殊生理生化物質(zhì)密切相關(guān)，包括熱休克蛋白、海藻糖、抗氧化酶等小分子保護劑［40，41］，但目前國內(nèi)有關(guān)草地貪夜蛾響應(yīng)環(huán)境脅迫的分子機制研究較少。

近年來，轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)的可用性極大地促進了越來越多來自不同昆蟲物種的熱應(yīng)激蛋白基因的鑒定，并促進了它們的功能研究［8，12，42-44］。然而，對于具有強破壞性的害蟲——草地貪夜蛾的hsp基因信息仍然十分有限。據(jù)報道，草地貪夜蛾不同大小的熱休克蛋白均可以被高溫條件誘導(dǎo)而大幅上調(diào)表達［45］，說明熱休克蛋白可能參與草地貪夜蛾對抗大范圍遷飛定居過程中面對的各種環(huán)境脅迫。Hsp70蛋白是目前為止研究最多、最深入的熱休克蛋白家族成員之一，具有應(yīng)激誘導(dǎo)表達特性，其表達量和昆蟲生長發(fā)育及應(yīng)對環(huán)境脅迫的能力密切相關(guān)。以草地貪夜蛾的Hsp70為研究對象，利用生物信息學(xué)的方法分析其理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)修飾位點以及同源性等，為研究草地貪夜蛾熱休克蛋白的功能和尋找草地貪夜蛾的防治靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因序列材料

從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）DNA序列數(shù)據(jù)庫中查找獲得草地貪夜蛾熱休克蛋白Hsp70的核苷酸完整編碼序列（Completed CDs）和氨基酸序列，登錄號分別為MN735776.1和QNN88712.1。選取另外12種鱗翅目昆蟲以及1種鞘翅目、2種半翅目、1種雙翅目昆蟲和斑馬魚（Daniorerio）的Hsp70核苷酸序列和氨基酸序列作為對照參考，核苷酸序列和氨基酸序列登錄號：柞蠶（Antheraea pernyi，GU945198.1，ADI50267.1）、天 蠶（Antheraea yamamai，AB179657.1，BAD18974.1）、蠟螟（Galleria mellonella，MG992397.1，AXY94835.1）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera，HM593518.1，ADP37711.1）、苜蓿夜蛾（Heliothisviriplaca，GQ199477.1，ACS72236.1）、甘 藍 夜 蛾（Mamestrabrassicae，AB251895.1，BAF03555.1）、煙 草 天 蛾（Manducasexta，AY220911.1，AAO65964.1）、黏蟲（Mythimnaseparata，EU306518.1，ABY55233.1）、菜粉蝶（Pierisrapae，HQ647013.1，ADV03160.1）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua，F(xiàn)J862049.1，ACQ78180.1）、斜 紋 夜 蛾（Spodopteralitura，HQ012004.2，ADV03160.1）、粉紋夜蛾（Trichoplusiani，DQ845103.1，ABH09732.1）、赤擬 谷 盜（Triboliumcastaneum，MK000439.1，QCI56580.1）、大豆蚜（Aphis glycines，JQ340173.2，AFO70211.1）、桃 蚜（Myzuspersicae，MF509827.1，AWN00453.1）、黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster，AY084193.1，AAL89931.1）和 斑 馬 魚（Daniorerio，BC036370.2，AAH36370.1）。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

本研究所用生物信息學(xué)分析工具如表1所示。多序列比對采用Mega-X［46］軟件的Muscle［47］算法，比對結(jié)果通過trimAl軟件［48］的automated方法對齊，隨后，通過Mega-X［46］軟件采用最大似然法（Maximm likelihood）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值［49］重復(fù)計算1 000次。

表1 生物信息學(xué)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性分析

ProtParam分析結(jié)果顯示，草地貪夜蛾Hsp70蛋白由651個氨基酸殘基組成，分子式為C3099H4982N882O985S24，分子質(zhì)量為71 126.41 u，理論等電點（PI）為5.47，為弱酸性蛋白，負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為93，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為82，不穩(wěn)定指數(shù)（Instability indexⅡ）為39.68，歸類為穩(wěn)定蛋白。Hsp70蛋白中氨基酸含量最高的為丙氨酸（Ala），占比9.4%（61/651），其次為甘氨酸（Gly），占比為8.8%（57/651）（圖1）。

圖1 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的氨基酸組成

利用ProtScale工具分析Hsp70蛋白的親疏水性，結(jié)果顯示蛋白最小值為-3.767，最大值為2.300，為親水蛋白（圖2）。

圖2 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的親水/疏水分析

2.2 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

利用NetSurfP 3.0預(yù)測草地貪夜蛾Hsp70蛋白的二級結(jié)構(gòu)。該蛋白中37.48%的氨基酸形成α螺旋（Alpha helix）（244個氨基酸殘基），26.11%形成延伸鏈（Extended strand）（170個氨基酸殘基），21.66%形成無規(guī)則卷曲（Random coil）（141個氨基酸殘基）（圖3）。

圖3 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL預(yù)測了草地貪夜蛾Hsp70蛋白的三級結(jié)構(gòu)。該蛋白三維建模最高全局模型質(zhì)量估計值（GMQE）為0.79，表明結(jié)構(gòu)預(yù)測較為可靠（＞0.7）。參考蛋白為綠藻（Chlamydomonasrein-hardtii）的熱休克蛋白Heat shock protein 70A（SMTL ID：7sqc.391），兩者氨基酸序列一致性為70.05%。如圖4所示，該蛋白主要結(jié)構(gòu)為α螺旋，其次為延伸鏈和無規(guī)則卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖4 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的信號肽跨膜區(qū)及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SignalP-6.0和TMHMM工具，分析了草地貪夜蛾Hsp70蛋白的信號肽跨膜區(qū)及跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，3個蛋白均不具有信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)（圖5）。

圖5 草地貪夜蛾Hsp70蛋白質(zhì)的信號肽跨膜區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

2.4 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取另外12種鱗翅目昆蟲，以及1種鞘翅目、2種半翅目和1種雙翅目昆蟲Hsp70的核苷酸序列和氨基酸序列作為對照參考，與草地貪夜蛾Hsp70蛋白的氨基酸序列進行同源性分析，結(jié)果如圖6所示，草地貪夜蛾的Hsp70與鱗翅目昆蟲甜菜夜蛾和斜紋夜蛾親緣關(guān)系較近，但與鱗翅目昆蟲蠟螟、粉紋夜蛾和黏蟲親緣關(guān)系較遠。

圖6 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 小結(jié)與討論

熱休克蛋白是一組在生物進化過程中高度保守的蛋白質(zhì)分子家族，在許多昆蟲物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的熱休克蛋白基因。熱休克蛋白是在環(huán)境脅迫下生存的重要調(diào)節(jié)劑，也是正常發(fā)育和滯育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在不良環(huán)境下昆蟲體內(nèi)的熱激蛋白通過穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)或消解錯誤蛋白來維持正常生命活動，提高生物細胞對應(yīng)激源的耐受力，阻止細胞凋亡［55，56］。Hsp70家族蛋白參與由環(huán)境脅迫而引起刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)答、抗凍、熱休克和金屬結(jié)合等過程。從分子水平上檢測熱休克蛋白基因表達變化是一種檢測農(nóng)藥等污染物的良好手段。同時隨著全球氣候變暖問題的日益嚴(yán)重，農(nóng)業(yè)害蟲溫度適應(yīng)能力增強，造成活動范圍的擴大，熱休克蛋白的研究不但為深入開展害蟲抗逆適應(yīng)性機制研究奠定理論基礎(chǔ)，而且可以為害蟲的綜合治理提供幫助。

草地貪夜蛾的入侵和迅速擴散已在中國造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅中國農(nóng)業(yè)及糧食生產(chǎn)安全，然而其如何抵抗環(huán)境脅迫的相關(guān)機理研究仍有欠缺。本研究選用的Hsp70蛋白基因來自草地貪夜蛾，該物種的hsp70基因共編碼20種651個氨基酸，其中，丙氨酸含量最高，色氨酸含量最低。該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為39.68，屬于穩(wěn)定的親水蛋白，且該蛋白不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。在同源性分析中選取12種鱗翅目昆蟲，以及1種鞘翅目、2種半翅目和1種雙翅目昆蟲的Hsp70蛋白序列與草地貪夜蛾比對，經(jīng)Mega-X比對，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾Hsp70蛋白與鱗翅目昆蟲甜菜夜蛾和斜紋夜蛾親緣關(guān)系較近，而與鱗翅目昆蟲蠟螟、粉紋夜蛾和黏蟲的物種親緣關(guān)系較遠。以上結(jié)果為進一步研究草地貪夜蛾熱休克蛋白的功能和尋找草地貪夜蛾的防治靶點提供了一定的理論基礎(chǔ)。