郭旭利 郭曉紅 楊曉彬 袁樂(lè)中 查銀蓮 易智君

1 廣東省惠州市中心人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 516000； 2 惠州市惠城區(qū)水口人民醫(yī)院內(nèi)科； 3 惠州市中心人民醫(yī)院病理科

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排第4位的腫瘤，發(fā)病率及死亡率逐年攀升并嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命，也是導(dǎo)致中國(guó)人因癌癥死亡的第4大常見(jiàn)原因，也是第3大最頻繁診斷的癌癥[1]。結(jié)直腸癌主要據(jù)其臨床病理分期判斷治療方案和預(yù)后。但發(fā)現(xiàn)分期相同的患者生存時(shí)間有較大差別，有些術(shù)后分期早的患者反而較早出現(xiàn)復(fù)發(fā)。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，10%～20%的Ⅱ期和30%～40%的Ⅲ期結(jié)直腸癌患者在治療后復(fù)發(fā)，而有關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的研究仍較少[2]。FLOT1在多種惡性腫瘤中有異常表達(dá)，對(duì)治療方案、生存預(yù)后有指導(dǎo)意義[3]。FLOT1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征及對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響不明確，尋找與結(jié)直腸癌發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物有利于分析腸癌的發(fā)病原因，指導(dǎo)制定治療方案及患者預(yù)后的評(píng)估。本研究使用RT-qPCR法研究FLOT1在結(jié)直腸癌及癌旁組織中表達(dá)的差異，旨在為臨床提供理論參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年1月—2020年12月收治的經(jīng)病理結(jié)果證實(shí)的50例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行研究，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。所有患者中，男28例，女22例；年齡40～78歲，平均年齡(62.03±1.47)歲。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，制成4μm厚切片備染。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-qPCR法：提取總RNA并定量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。linc RNA FLOT1引物，上游5’-CACTGGGGAACTCTGACTCC-3’，下游5’-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3’；GAPDH引物，上游5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。PCR反應(yīng)試劑：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNas-e H Plus)，Ta Ka Ra Code：DRR420A去1μl的2×Prime STAR Max Premix，0.4μl的sense primer，0.4μl的anti-sense primer ，加滅菌蒸餾水至20μl，混合后離心。PCR反應(yīng)體系，95℃下孵育30s，60℃下孵育20s，共進(jìn)行40次循環(huán)反應(yīng)；然后72℃下孵育20s，95℃下孵育15s后停止，使用熒光定量PCR方式處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.2 石蠟包埋組織免疫組化法：所采用的試劑Flotillin-1多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司，枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液(pH6.0)、DAB顯色液及PBS緩沖液均購(gòu)自邁新公司。每個(gè)組織切片經(jīng)脫蠟、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液熱修復(fù)，過(guò)氧化氫、牛奶封閉后滴加一抗(1∶200)4℃過(guò)夜。復(fù)溫后滴加二抗，37℃孵育10min，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育3min，最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和鄰近的非癌組織中FLOT1 mRNA、FLOT1表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織FLOT1 mRNA水平、FLOT1高表達(dá)占比高于非癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 癌組織和鄰近的非癌組織中FLOT1mRNA、FLOT1表達(dá)比較

2.2 結(jié)直腸癌組織中FLOT1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期與FLOT1表達(dá)密切相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中FLOT1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織預(yù)后的影響因素 Logistic多因素回歸分析，F(xiàn)LOT1蛋白是結(jié)直腸癌患者的預(yù)后獨(dú)立影響因素(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 結(jié)直腸癌組織預(yù)后的影響因素

3 討論

結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物成為熱點(diǎn)，目前已有一些相關(guān)分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，但往往特異性較差，臨床應(yīng)用價(jià)值相對(duì)較低。發(fā)現(xiàn)有效的結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物并將其作為診斷和預(yù)測(cè)疾病的依據(jù)，為患者提供合理有效的治療方案尤其重要[4]。因此，尋找特異性較好、臨床應(yīng)用價(jià)值較高的分子標(biāo)志物成為熱點(diǎn)。

諸多研究表明，脂質(zhì)筏的蛋白質(zhì)標(biāo)記物參與人類(lèi)癌癥各種各樣的生物學(xué)過(guò)程。Flotillin脂質(zhì)筏家族成員FLOT1編碼一種Caveolae相關(guān)的完整膜蛋白，參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。既往研究曾對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620及原位結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480外顯子蛋白譜進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)脂筏蛋白FLOT1在SW620中表達(dá)顯著升高[6]。最近，F(xiàn)LOT1在上皮源性癌中意外被發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等[7]。在肝癌細(xì)胞系中FLOT1在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平表達(dá)均升高。FLOT1的異位表達(dá)促進(jìn)了食管鱗癌細(xì)胞系的增殖，而在體外和體內(nèi)，沉默F(xiàn)LOT1可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和致瘤性[8]。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)LOT1在上皮起源的腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著主導(dǎo)的積極作用，但是否也在人類(lèi)結(jié)直腸癌中表達(dá)仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織FLOT1 mRNA水平、FLOT1高表達(dá)占比高于非癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明了結(jié)直腸癌患者存在FLOT1高表達(dá)的情況。進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素，結(jié)果顯示FLOT1是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)，表明了FLOT1的表達(dá)，與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，臨床需加強(qiáng)對(duì)FLOT1表達(dá)的檢測(cè)，以此為臨床提供理論指導(dǎo)。

綜上所述，F(xiàn)LOT1在結(jié)直腸癌組織中存在高表達(dá)的現(xiàn)象，且與患者的預(yù)后及生存有明顯的相關(guān)性，可作為未來(lái)腫瘤分子生物標(biāo)記物使用。