葉 偉 李文強 汪 玥 胡 馨 王 林 丁 見

皖南醫(yī)學院 1 臨床醫(yī)學院 2 基礎醫(yī)學院，安徽省蕪湖市 241002

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是由于腦中血管發(fā)生病變，引起腦血液供應不足，進而表現(xiàn)出認知功能障礙[1]。隨著社會的發(fā)展和人口老齡化進程的加速，腦血管病發(fā)病率逐年增加，因此VD 的發(fā)病率也在不斷上升，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)VD的發(fā)生與炎癥反應、缺氧和低灌注引起的氧化應激以及發(fā)生的神經(jīng)元凋亡有著密切的關系[2]。慢性腦缺血狀態(tài)下大鼠的線粒體功能發(fā)生紊亂，引起氧化應激，損傷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，最終發(fā)生神經(jīng)退行性改變，認知功能下降[3]。

VD的主要疾病特點為學習、記憶等認知功能的減退，大腦海馬CA1區(qū)是學習、記憶、情緒等相關的重要腦區(qū)。沉默信息調節(jié)因子1(Silent information regulator 1,STRT1)在海馬體CA1中有豐富的神經(jīng)元表達，參與重要的生理學過程，如細胞的氧化應激和細胞凋亡，其機制是去乙酰化調控下游分子[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1-α)在許多認知功能發(fā)生障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，激活的PGC1-α能夠消除自由基，誘導細胞抗氧化酶的表達，提髙組織的抗氧化能力[5]。研究證實針灸對于改善血管性癡呆患者的癥狀，延緩VD進程方面有確切的效果。趙建新等[6]使用電針干預百會穴后，明顯改善了血管性癡呆在認知功能方面的障礙。本實驗通過電針干預，探究電針治療改善VD大鼠學習記憶能力的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:成年健康雄性SD大鼠24只，體重(250±20)g，購自浙江省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20190003。(2)主要試劑:SIRT1(bs-2257R)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；PGC1-α(bs-7535R)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；兔IgG-免疫組化試劑盒(SA2002 1/4KIT,博士德生物工程有限公司)；Nissl staining溶液(北京索萊寶科技有限公司)。(3)主要儀器:輪轉式石蠟切片機(德國Leica公司)，華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)，BX51顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組。置于室溫(23±2)℃，相對濕度(60±5)%的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為對照組、模型組和電針組，每組8只。

1.2.2 模型制備。VD模型通過2VO的方法進行復制：大鼠造模前禁食不禁水12h后稱重，麻醉使用1%戊巴比妥鈉(0.3ml/100g)腹腔注射，將大鼠以仰臥位固定在手術臺上，消毒、備皮沿頸正中切口切開，逐層剝離至充分暴露雙側頸總動脈后將其用手術縫線結扎，將分離的組織復位后縫合傷口。術后3d內，每天注射0.5ml青霉素預防后續(xù)感染，放回籠中，保溫飼養(yǎng)，控制大鼠的直腸溫度在37℃左右。對照組進行同樣手術操作，但雙側頸總動脈不做結扎處理。

1.2.3 治療方法。對電針組的大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉后將大鼠側臥位放置，用頻率2Hz、強度3V、波寬1ms的疏密波電針治療“百會”穴和“足三里”穴，百會穴位于頂骨與頂間骨之間正中凹陷處 (即兩耳郭前緣根部連線中點)；足三里在后肢前外側, 犢鼻下約6mm, 脛骨前緣旁開約2mm。連續(xù)4周，1次/d，30min/次，對照組和模型組用同樣方法麻醉但不電針。

1.2.4 Morris水迷宮實驗。定位航行實驗：在第2～4天，將每組大鼠沿壁從固定象限排列放置在水中。如果大鼠在90s內找到平臺，則將大鼠找到平臺所耗費的時間記錄下來，并使其停留在平臺上20s；如果大鼠在90s內未找到平臺，則將大鼠引到平臺，并同樣在平臺上停留20s的時間，并記錄90s作為此大鼠逃避潛伏期的時間。每天除了平臺所位于水中的象限外，其他三個象限所測定出來的結果依次記錄下來，將平均值作為每天的逃避潛伏期的時間。

空間探索試驗：在第5天，將平臺移開，將進水點選為平臺象限的對立象限，將大鼠沿壁放進水中，并記錄了其在平臺所在象限內所活動的時間。

1.2.5 樣品收集。腹腔注射1%戊巴比妥(0.3ml/100g)，暴露心臟，并通過左心室升主動脈灌注4℃4%多聚甲醛緩沖液固定。根據(jù)George Baxinos的《大鼠大腦定位立體圖》取出所需要的腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，最后將其包埋在石蠟中。

1.2.6 尼氏染色。取上述處理好的組織切片放入焦油紫染色液中，避光，然后在56℃恒溫箱中1h后用去離子水洗滌，接著將其放入尼氏液中分化至在顯微鏡下背景接近無色，然后脫水，透明，封片。

1.2.7 免疫組化檢測。取各組大鼠腦組織石蠟切塊進行切片，厚5μm。經(jīng)脫蠟至水，3%過氧化氫去離子水消除內源性過氧化物酶活性、抗原熱修復，山羊血清封閉，用多克隆抗體在 4℃以 1∶150 稀釋，一抗孵育18h。用山羊抗兔IgG抗體后滴加SABC檢測的表達。用DAB顯色液顯色后，封片。通過顯微鏡觀察、結合大鼠腦立體定位圖譜確定所在位置、最后使用圖像分析系統(tǒng)對檢測大鼠海馬CA1區(qū)的SIRT1和PGC1-α的免疫陽性細胞進行拍照，用來計數(shù)和測灰度值，統(tǒng)計出陽性細胞數(shù)量和平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，其中組間比較使用單因素方差分析，結果以均數(shù)±標準差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學實驗結果 由實驗數(shù)據(jù)可得，模型組大鼠在第5天時平均逃避潛伏期時間較對照組大鼠高(P<0.05)，且其平臺象限活動時間比例低于對照組大鼠(P<0.05)；電針組大鼠在第5天時平均逃避潛伏期時間低于模型組(P<0.05)，且其原平臺象限活動時間比例相對于模型組要高(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期(s)和平臺象限滯留百分比(%)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 尼氏染色觀察各組大鼠神經(jīng)元的形態(tài) 對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)結構完整，細胞核多為圓形或橢圓形且呈淡紫色，核仁清晰可見，尼氏顆粒豐富散布在細胞質中。對于模型組大鼠來說，其細胞形態(tài)多呈空泡狀，神經(jīng)元核仁固縮或消失，尼氏顆粒不明顯。與模型組相比，電針組海馬CA1區(qū)的異常形態(tài)學變化明顯減輕，數(shù)目減少明顯較少。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結果 a.對照組 b.模型組 c.電針組

2.3 SIRT1和PGC1-α在各組大鼠海馬CA1區(qū)表達量的比較 由光學顯微鏡觀察正常大鼠海馬的CA1區(qū)可發(fā)現(xiàn)，其中含有大量的以胞膜呈棕黃色為特征的SIRT1陽性神經(jīng)元與PGC1-α陽性神經(jīng)元。對于SIRT1陽性神經(jīng)元，觀察模型組，其SIRT1陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯少于對照組(P<0.05)，表現(xiàn)為細胞染色變淺，計算其灰度值均數(shù)與對照組相比也

有明顯的提高(P<0.05)；而觀察治療后的電針組，其SIRT1陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯多于模型組(P<0.05)，免疫組化的染色效果也有一定程度的加深，其平均灰度值較模型組顯著降低(P<0.05)，對于PGC1-α陽性神經(jīng)元也有相同的數(shù)量、染色效果及平均灰度值的改變。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)SIRT1和PGC1-α的表達(免疫組織化學染色法，×400)與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

3 討論

血管性癡呆(VD)的發(fā)生比例在逐年上升，慢性腦低灌注被認為是VD的重要危險因素[7]。腦卒中后慢性低灌注會導致腦血流量的下降，導致缺氧后的氧化應激使血管內皮細胞神經(jīng)細胞等受損，使腦血流量下降進一步加重，這些腦血管病理變化將會導致VD[8]。海馬CA1區(qū)是人類學習和記憶的重要功能區(qū)，慢性腦低灌注時活性氧在腦中積累，導致神經(jīng)元遭受破壞和中樞膽堿能功能的障礙，從而減少神經(jīng)元的數(shù)量，海馬CA1區(qū)的功能發(fā)生障礙，導致VD患者的學習記憶等認知功能發(fā)生障礙[9]。在造模完成后，通過Morris水迷宮行為學測試并統(tǒng)計結果后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的平均逃避潛伏期顯著高于對照組，且在撤去平臺后，模型組的原平臺象限滯留時間百分比遠低于對照組。

目前VD的主要治療方法是西醫(yī)治療，通過降低血糖、血壓、血脂，保護腦細胞和腦循環(huán)等藥物進行治療，并同時戒酒、戒煙，但上述治療的方法效果均不明顯[10]。針療法是指以毫針刺入腧穴部，使針刺部位產(chǎn)生一定的經(jīng)氣感應后，將強度近似于人體生物電的微量脈沖電流接通在針上，通過針刺與電感雙重刺激穴位，使機體的脈絡氣息得以激發(fā)并調整，達到治療或預防疾病目的的一種方法。百會位于巔頂，是百脈聚會之處，具有醒腦開竅、補腦益智之效；足三里屬多氣多血之胃經(jīng)，即可行氣血，又可補氣血；二穴合用，可行其氣，活其血，通督脈，調神志[11]。通過尼氏染色檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷情況顯示，與對照組相較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元陽性細胞數(shù)量減少，細胞多呈空泡狀，神經(jīng)元核仁明顯固縮甚至消失，尼氏顆粒不明顯。而與模型組相較，電針組大鼠海馬神經(jīng)元陽性細胞顯著提高，細胞空泡狀況有所改善，固縮的核仁減少，尼氏顆粒較明顯。該結果進一步證實了上述預測的結果。

膽堿能傳導通路的受損、炎性因子的過量表達、脂類代謝紊亂、遺傳基因表達異常、氧化應激損害等多種機制都可以導致海馬CA1區(qū)組織的損傷，進而引發(fā)VD[12]，Sirt1在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內的表達是其參與認知功能調節(jié)的物質基礎，同時也參與調節(jié)神經(jīng)元的分化功能， PGC1-α是在對抗氧化應激中起到關鍵作用的轉錄調節(jié)因子，能夠起到消除自由基，提髙組織抗氧化能力的作用。SIRT1起到類似于一種屏障作用，它將PGC1-α去乙?；螅行ё柚沽说鞍酌阁w降解PGC1-α，并使靶基因持續(xù)產(chǎn)生激活。由此可推斷PGC1-α和Sirt1組成一調節(jié)系統(tǒng)，用于調節(jié)氧化應激導致的損傷反應，在VD恢復的生物學效應中起積極作用。本實驗中，通過免疫組化的結果可以發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組SIRT1和PGC1-α陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯下降(P<0.05)，通過分析發(fā)現(xiàn)，細胞的染色變淺，其平均灰度值與對照組相比也有明顯的提高(P<0.05)，這與SIRT1通過去乙酰化促進PGC1-α水平這個觀點相一致。

VD大鼠海馬CA1區(qū)SIRT1的表達在電針的作用下可以上調，進而上調其下游的PGC1-α的表達，充分提高腦組織對氧化應激的抵抗反應，阻止血管性癡呆大鼠腦組織被破壞。根據(jù)電針組大鼠的免疫組化實驗結果，與模型組相比，PGC1-α陽性神經(jīng)元的數(shù)量有所增加(P<0.05)，同時可以分析出細胞染色變深，其平均灰度值也有明顯的降低(P<0.05)，而其SIRT1陽性神經(jīng)元的數(shù)量也多于模型組(P<0.05)，細胞染色深，其平均灰度值與模型組相比有明顯的降低(P<0.05)這些結果顯示通過電針干預療法可以增加大鼠海馬CA1區(qū)中SIRT1的表達水平，進而促進了PGC1-α的表達水平，通過以上結果可以推測，通過電針法刺激穴位等一系列效果，使腦組織的抗氧化應激能力得到一定程度的增強，且可以修復由缺血而損傷的神經(jīng)元。且由實驗數(shù)據(jù)可以表明，電針法的修復作用是由于促進SIRT1的表達效果，進一步增強PGC1-α的表達效應，改善了VD大鼠的學習認知能力及記憶功能，但就其具體通路機制而言，還需進一步研究。