高曉威 韋思平 王 欽

（西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，瀘州 646000）

蛋白質(zhì)參與包括細(xì)胞骨架、生物催化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)仍趦?nèi)的所有生物學(xué)過(guò)程，其幾乎全部由20 種天然氨基酸（canonical amino acids，cAAs）組成［1］。蛋白質(zhì)功能的多樣性由20種cAAs的排列組合及側(cè)鏈間的相互作用共同決定。在自然界中通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾（如甲基化、乙?；?、磷酸化、糖基化等），可向蛋白質(zhì)中引入新的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)一步豐富蛋白質(zhì)的功能；同時(shí)，一些蛋白質(zhì)只有在輔酶存在或者結(jié)合金屬離子的情況下才能發(fā)揮正常的生物學(xué)功能［2］，這表明20種cAAs提供的有限化學(xué)基團(tuán)在某些情況下并不能夠完全滿足蛋白質(zhì)功能的需求，而引入新的化學(xué)基團(tuán)有望豐富蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。

非天然氨基酸（noncanonical amino acids，ncAAs）種類繁多，其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的多樣性遠(yuǎn)超cAAs。通過(guò)插入ncAAs 來(lái)提高蛋白質(zhì)或者多肽的生物化學(xué)特性已見(jiàn)諸許多報(bào)道［3］。鑒于ncAAs 在蛋白質(zhì)研究和應(yīng)用中的巨大潛力，研究人員目前已開(kāi)發(fā)出多種向蛋白質(zhì)或多肽中插入ncAAs 的技術(shù)。其中固相肽合成（solid?phase peptide synthesis）可用于合成不超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基的含ncAAs多肽；通過(guò)內(nèi)含肽（intein）技術(shù)將合成的短肽共價(jià)相連可獲得較大分子質(zhì)量的含ncAAs 蛋白質(zhì)［4］。無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)（cell?free translation systems）亦可用來(lái)合成含ncAAs 的蛋白質(zhì)，該技術(shù)的關(guān)鍵在于首先要在體外制備能被核糖體識(shí)別的裝載有ncAAs的氨酰tRNA［5］。研究表明，有些與cAAs 結(jié)構(gòu)類似的ncAAs能夠在胞內(nèi)被相應(yīng)的氨酰tRNA合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，aaRS）識(shí)別并裝載到特定tRNA上［6］。在某種cAA營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)基中加入該cAA 的結(jié)構(gòu)類似物（ncAA），菌體內(nèi)的翻譯系統(tǒng)可將其錯(cuò)誤地插入到整個(gè)蛋白質(zhì)組中［7］。該方法有可能擾亂菌體內(nèi)一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能，存在細(xì)胞毒性，降低目標(biāo)蛋白產(chǎn)量。上述方法盡管均可有效制備含ncAAs 的蛋白質(zhì)或多肽，但都具有各自的局限性，比如非位點(diǎn)特異性、不可持續(xù)且生產(chǎn)成本高、只能應(yīng)用于cAAs 結(jié)構(gòu)類似物等。遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)（genetic code expansion）能夠有效克服上述局限性，實(shí)現(xiàn)在生物體內(nèi)向蛋白質(zhì)或多肽中位點(diǎn)特異性插入各種ncAAs［2］。

遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)首次由美國(guó)Scripps 研究所Peter G Schultz 教授領(lǐng)導(dǎo)的研究組建立起來(lái)［8］。研究人員目前已可利用該技術(shù)將200多種含有不同功能側(cè)鏈基團(tuán)的ncAAs位點(diǎn)特異性地插入到各類蛋白質(zhì)中［2］。遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、蛋白質(zhì)工程、合成生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等諸多生物學(xué)領(lǐng)域，為一些重大生命科學(xué)問(wèn)題的研究與解決提供了極大便利。本文將重點(diǎn)關(guān)注遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的前沿進(jìn)展及其在各類抗體、細(xì)胞因子以及抗菌肽等蛋白質(zhì)及多肽類藥物中的應(yīng)用，同時(shí)也對(duì)其衍生的新型生物治療手段進(jìn)行簡(jiǎn)單闡述。

1 遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)

1.1 原理

遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)是指通過(guò)在生物體內(nèi)引入外源正交aaRS/tRNA 對(duì)，借助特殊密碼子（如UAG、UAGA 等）向目的蛋白中位點(diǎn)特異性插入ncAAs（圖1）［8］。目前應(yīng)用較為廣泛的外源aaRS/tRNA 對(duì)包括來(lái)源于古生菌詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）的酪氨酰aaRS/tRNA對(duì)（MjTyrRS/tRNA）、巴氏甲烷八疊球菌（Methanosarcina barkeri）的吡咯賴氨酰aaRS/tRNA 對(duì)（MbPylRS/tRNA），以及來(lái)源于大腸桿菌（E.coli）的酪氨酰aaRS/tRNA對(duì)（EcTyrRS/tRNA）和亮氨酰aaRS/tRNA 對(duì)（EcLeuRS/tRNA）（表1）［9］。其中MjTyrRS/tRNA 對(duì)可在原核生物中應(yīng)用，EcTyrRS/tRNA 對(duì)和EcLeuRS/tRNA 對(duì)可在真核生物中應(yīng)用，而MbPylRS/tRNA對(duì)在原核生物和真核生物中均可應(yīng)用。以野生型外源aaRS/tRNA對(duì)為基礎(chǔ)，通過(guò)構(gòu)建突變體庫(kù)并在宿主細(xì)胞中進(jìn)行基于特定ncAAs 的正負(fù)篩選，獲得與內(nèi)源性aaRS/tRNA 對(duì)和cAAs 不存在交叉反應(yīng)且能特異性識(shí)別ncAAs 的突變體是遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的關(guān)鍵所在［8］。遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)首次在E.coli中獲得成功，目前其應(yīng)用已實(shí)現(xiàn)從單細(xì)胞到多細(xì)胞、從低等到高等物種的跨越［10］。研究人員已經(jīng)能夠利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在乳酸乳球菌、結(jié)核分支桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人造血干細(xì)胞、線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥、小鼠等物種中定點(diǎn)插入ncAAs（表1）。盡管遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用潛力巨大，但其自身仍有多方面的局限性需要突破才能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。

Fig.1 Principles of genetic code expansion and its applications in protein and peptide related drugs圖1 遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)原理及其在蛋白質(zhì)、多肽相關(guān)藥物中的應(yīng)用

Table 1 Orthogonal tRNA/synthetase pairs used in different hosts表1 不同物種中使用的外源正交aaRS/tRNA對(duì)

1.2 提高ncAAs整合效率

目前在遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)中使用頻率最高的密碼子為琥珀密碼子（UAG），該密碼子在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中被釋放因子1（release factor 1，RF1）所識(shí)別，介導(dǎo)新生多肽鏈的翻譯終止［41］。正交aaRS/tRNA對(duì)需要在蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)程中與RF1競(jìng)爭(zhēng)性識(shí)別mRNA 上的UAG 密碼子才能獲得含ncAAs的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，因此含ncAAs蛋白質(zhì)的表達(dá)量一般只有野生型的10%～20%［10］。為了解決這一問(wèn)題，研究人員嘗試了采用不同的方法敲除RF1基因，避免RF1 對(duì)UAG 密碼子識(shí)別導(dǎo)致翻譯提前終止。通過(guò)將E.coli中7 個(gè)必需基因（coaD、had、hemA、mreC、murF、lolA和lpxK）的終止密碼子UAG 替換為UAA，Sakamoto 課題組［42］成功敲除了RF1基因。通過(guò)將框內(nèi)UAG 自調(diào)節(jié)元件（in?frame UAG autoregulation element）失活并將RF2中的T246 突變?yōu)锳，Wang 課題組［43］同樣也成功敲除了RF1基因。利用RF1 敲除菌株作為表達(dá)宿主，含ncAAs 蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，尤其是多位點(diǎn)插入ncAAs蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，得到了顯著提高。但值得注意的是，這兩種RF1敲除菌株的生長(zhǎng)速率都明顯下降。利用多元自動(dòng)化基因組編輯技術(shù)（multiplex automated genome engineering）和基因組接合組裝技術(shù)（conjugative assembly genome engineering），Isaacs 課題組［44］將E.coliMG1655 中所有已知UAG密碼子全部替換成了UAA并將RF1基因進(jìn)行了敲除，成功構(gòu)建了菌株E.coliC321.ΔA。在菌株E.coliC321.ΔA 中，UAG 已不再作為終止密碼子發(fā)揮功能而是成為了一個(gè)空白密碼子。以E.coliC321.ΔA作為表達(dá)宿主，可將含ncAAs蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高至與野生型相當(dāng)。我們近期從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析了UAG 密碼子重排對(duì)E.coli生理特性的影響，并通過(guò)向基因組中整合T7 RNA聚合酶系統(tǒng)進(jìn)一步提高了E.coliC321.ΔA 菌株含ncAAs蛋白質(zhì)的表達(dá)能力［45］。

由于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)使用的正交aaRS/tRNA 對(duì)均為外源性的，其在宿主細(xì)胞中的活性往往偏低。通過(guò)增加正交aaRS/tRNA對(duì)在細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)和調(diào)整啟動(dòng)子強(qiáng)度，提高正交aaRS/tRNA對(duì)的表達(dá)量，可在一定程度上提高含ncAAs蛋白質(zhì)的產(chǎn)量［46］。Isaacs 課題組［47］在E.coli中利用多元自動(dòng)化基因組編輯技術(shù)對(duì)正交aaRSs進(jìn)行了定向進(jìn)化，顯著提高了酶活性和特異性，將含ncAAs蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高了25 倍。他們利用進(jìn)化后的aaRS/tRNA 對(duì)獲得了最多含有30 個(gè)ncAAs 插入的蛋白質(zhì)。Liu 課題組［48］利用噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化技術(shù)（phage assisted continuous evolution）分別對(duì)PylRS 和TyrRS 進(jìn)行定向進(jìn)化，顯著提高了酶的催化效率和底物特異性。類似地，S?ll 課題組［49］利用噬菌體輔助的非連續(xù)進(jìn)化技術(shù)（phage assisted noncontinuous evolution）對(duì)PylRS 進(jìn)行了定向改造，獲得了活性和特異性顯著提高的突變體。通過(guò)不同策略提高ncAAs在宿主細(xì)胞內(nèi)的濃度（如過(guò)表達(dá)宿主細(xì)胞的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶、將ncAAs以二肽的形式添加至培養(yǎng)基等），亦可增加含ncAAs 蛋白質(zhì)的產(chǎn)量［50］。氨酰化的ncAA?tRNA 需要延伸因子（elongation factor thermo?unstable，Ef?tu）輔助才能進(jìn)入核糖體參與蛋白質(zhì)的合成。然而ncAA?tRNA并不是Ef?tu的天然底物，這導(dǎo)致二者的識(shí)別和結(jié)合效率偏低。通過(guò)對(duì)Ef?tu 進(jìn)行工程化改造提高其對(duì)非天然底物的親和力可有效提高含ncAAs蛋白質(zhì)的產(chǎn)量［51］。

1.3 同一多肽鏈中整合不同ncAAs

遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)一般只能向蛋白質(zhì)中插入單種ncAA，這主要是由兩方面的原因造成的：a.缺乏相互正交的外源aaRS/tRNA對(duì)；b.缺乏介導(dǎo)不同ncAAs 插入的密碼子。前期研究表明，MjTyrRS/tRNA對(duì)與PylRS/tRNA對(duì)相互正交，可用于向同一多肽鏈中插入兩種不同ncAAs［18］。Chatterjee 課題組［52］和Chin 課題組［53］分別采用不同的方法獲得了三重正交aaRS/tRNA對(duì)，實(shí)現(xiàn)了向同一多肽鏈中插入3種不同ncAAs。從頭設(shè)計(jì)產(chǎn)生多重相互正交的aaRS/tRNA 對(duì)亦獲得了一定突破［54］。最近，Lin 課題組［55］通過(guò)蛋白質(zhì)工程將MbPylRS/tRNA對(duì)中賦予其正交性的結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)移至E.coliHisRS/tRNA 對(duì)中，獲得了新的正交嵌合aaRS/tRNA對(duì)，為正交aaRS/tRNA對(duì)的構(gòu)建提供了新的思路。要想實(shí)現(xiàn)向同一多肽鏈中插入多種ncAAs，除需要多重相互正交的aaRS/tRNA 對(duì)之外，還需要更多介導(dǎo)ncAAs插入的密碼子。受菌株E.coliC321.ΔA的啟發(fā)，目前多個(gè)研究小組正通過(guò)不同的基因組工程技術(shù)將E.coli基因組中編碼特定cAAs的密碼子進(jìn)行同義替換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)64個(gè)三堿基密碼子進(jìn)行壓縮和重排，產(chǎn)生更多的空白密碼子用于ncAAs的插入［56?57］。截止目前，在E.coli基因組中已有7個(gè)三堿基密碼子實(shí)現(xiàn)了同義替換，并被用于介導(dǎo)ncAAs 的插入［58］。通過(guò)設(shè)計(jì)四堿基密碼子介導(dǎo)ncAAs的插入亦見(jiàn)諸多報(bào)道，將四堿基密碼子廣泛應(yīng)用于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)可有效解決介導(dǎo)ncAAs插入密碼子數(shù)量不足的問(wèn)題，然而宿主細(xì)胞中的翻譯系統(tǒng)對(duì)四堿基密碼子的識(shí)別效率較低且無(wú)法避免對(duì)四堿基密碼子中前三個(gè)堿基的錯(cuò)誤識(shí)別。Chin課題組［59］通過(guò)對(duì)核糖體進(jìn)行工程化改造獲得了正交核糖體Ribo?Q，顯著提高了含ncAAs蛋白的產(chǎn)量，同時(shí)也為工程化改造獲得有效解碼四堿基密碼子的正交核糖體提供了研究思路。通過(guò)向E.coli基因組中引入非天然堿基（X，Y）獲得自然界中不存在的密碼子，并將其用于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)介導(dǎo)ncAAs的插入同樣也獲得了成功［60］。

1.4 原位合成ncAAs

現(xiàn)階段遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)主要依賴于人為外源添加ncAAs 才能獲得含相應(yīng)ncAAs 的蛋白質(zhì)。若某些ncAAs 價(jià)格昂貴則勢(shì)必會(huì)增加含ncAAs 蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本。通過(guò)蛋白質(zhì)工程（protein engineering）或代謝通路工程（metabolic pathway engineering）改造宿主細(xì)胞原位合成ncAAs，并將其直接用于蛋白質(zhì)合成可有效解決這一問(wèn)題。Xiao課題組［61］通過(guò)引入來(lái)源于委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）的代謝通路實(shí)現(xiàn)了在E.coli中有效合成對(duì)氨基苯丙氨酸（p?amino?phenylalanine，pAF），利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將其插入到單鏈抗體中與熒光探針偶聯(lián)可用于細(xì)胞成像。該課題組還通過(guò)引入來(lái)源于野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）的苯丙氨酸4?羥基化酶（phenylalanine 4?hydroxylase）和輔酶再生系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了在E.coli中合成5? 羥基色氨酸（5?hydroxytryptophan，5?HTP）［62］。Liu 課題組［63］通過(guò)工程化改造E.coli中Cys合成路徑并向培養(yǎng)基中補(bǔ)加各種廉價(jià)芳香硫醇，實(shí)現(xiàn)了合成50 種ncAAs。同樣地，L?磷酸蘇氨酸（O?phospho?L?threonine）、L?二羥基苯丙氨酸（3,4?dihydroxy?L?phenylalanine）和S?烯丙基L?半胱氨酸（S?allyl?L?cysteine）等ncAAs 均實(shí)現(xiàn)了在E.coli中生物合成并直接用于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)生產(chǎn)含ncAAs 的蛋白質(zhì)［64?66］。隨著越來(lái)越多的新穎酶分子以及代謝通路被發(fā)掘，更多的ncAAs 將能夠被生物合成并直接用于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)。隨著遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在上述各個(gè)環(huán)節(jié)的瓶頸問(wèn)題得以突破，該技術(shù)的應(yīng)用也日趨多樣化，有望為下一代蛋白質(zhì)及多肽類藥物的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

2 在蛋白質(zhì)及多肽類藥物中的應(yīng)用

2.1 抗體偶聯(lián)藥物

抗體是體內(nèi)獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分，對(duì)抗原具有優(yōu)異的識(shí)別特異性和親和力。將抗體與其他毒性小分子或者治療性藥物通過(guò)一定方式連接到一起，制備成抗體偶聯(lián)藥物（antibody?drug conjugates，ADCs），可有效提高藥物的靶向性，實(shí)現(xiàn)向腫瘤等病灶組織精確遞藥，降低藥物毒副作用（圖1）。目前有超過(guò)175種ADCs正在開(kāi)展臨床試驗(yàn)，超過(guò)10 種ADCs 已成功上市［67?68］。盡管ADCs在包括癌癥等人類重大疾病的治療中表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，但是其安全性和有效性一直受到制備技術(shù)的制約。傳統(tǒng)ADCs主要依賴于抗體分子中的Cys 或Lys 殘基與親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)藥物分子的裝載。由于抗體分子中Cys和Lys殘基數(shù)量較多，往往無(wú)法與配體基團(tuán)形成均一的化學(xué)修飾，造成藥物與抗體的偶聯(lián)比率（drug?to?antibody ratios，DAR）和偶聯(lián)位點(diǎn)不均一、不固定。通過(guò)還原抗體分子內(nèi)部的二硫鍵暴露Cys殘基進(jìn)行化學(xué)修飾則會(huì)影響抗體分子的穩(wěn)定性［69］。因此傳統(tǒng)方法制備的ADCs是不穩(wěn)定的混合物，其可能同時(shí)含有未裝載藥物的抗體以及過(guò)量裝載藥物的抗體。未裝載藥物的抗體會(huì)與裝載藥物的抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合目標(biāo)抗原，減弱ADCs的療效，而過(guò)量裝載藥物的抗體則會(huì)導(dǎo)致ADCs 發(fā)生沉淀、毒性增加、血清穩(wěn)定性降低等［70］。傳統(tǒng)方法制備的ADCs在體內(nèi)的有效性、安全性、免疫原性、半衰期、親和力、藥物動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)可能會(huì)受到不同生產(chǎn)批次的影響。實(shí)現(xiàn)抗體和藥物定點(diǎn)偶聯(lián)，制備均一的ADCs有望解決這一問(wèn)題。Mallet課題組［71］通過(guò)定點(diǎn)突變引入反應(yīng)性Cys 并減少抗體分子中非必需Cys 殘基的數(shù)量（the engineered thio monoclonal antibody，THIOMAB）首次制備出了均一的ADCs。該 ADCs（THIOMAB antibody?drug conjugates）與非均一ADCs 相比顯示出了更高的劑量耐受性和血清穩(wěn)定性，有效提高了藥物的治療窗濃度范圍。然而抗體中引入的Cys會(huì)與其他含巰基物質(zhì)或者抗體分子間形成二硫鍵從而影響偶聯(lián)，同時(shí)許多基于Cys形成的加合物在生理?xiàng)l件下并不穩(wěn)定，這限制了THIOMAB 技術(shù)在ADCs 中的應(yīng)用。通過(guò)蛋白質(zhì)標(biāo)簽（protein tagging）和酶催化等技術(shù)同樣也實(shí)現(xiàn)了均一化ADCs的制備，但考慮到抗體上偶聯(lián)位點(diǎn)的選擇對(duì)ADCs的有效性和安全性具有重要影響，而這些方法對(duì)抗體上的修飾位點(diǎn)選擇性有限，可能會(huì)影響對(duì)ADCs 的進(jìn)一步優(yōu)化［72］。

利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)位點(diǎn)特異性插入ncAAs制備均一化ADCs具有以下明顯優(yōu)勢(shì)：a.遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在抗體分子中任意一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)插入ncAAs，實(shí)現(xiàn)藥物偶聯(lián)位點(diǎn)的自由選擇；b.借助ncAA側(cè)鏈上的生物正交化學(xué)官能團(tuán)（如疊氮基、炔基、酮基、鹵代基等）不僅可以建立起抗體與藥物分子之間穩(wěn)定、高效、高特異性的定點(diǎn)偶聯(lián)，而且還可以使偶聯(lián)反應(yīng)多樣化，允許更多不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物用于ADCs 的制備（圖2）［73］。Schultz 研究組［74］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向曲妥珠單抗（trastuzumab）中引入L乙?；奖彼幔??acetyl?L?phenylalanine，pAcF），使其與烷氧基胺修飾的藥物auristatin F形成肟鍵制備成功了DAR 為2 的均一化ADCs。與非均一化ADCs 相比，該ADCs在小鼠腫瘤移植模型中具有消除Her2陽(yáng)性腫瘤的能力，并且展現(xiàn)出了偶聯(lián)效率高、安全性能好、血清清除率低等優(yōu)點(diǎn)。隨后該方法被成功用于制備治療前列腺癌、腎癌以及癌癥轉(zhuǎn)移等疾病的均一化ADCs。Chin 課題組［75］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將含有環(huán)丙烯基團(tuán)的Lys 衍生物CypK 插入到曲妥珠單抗中，隨后通過(guò)Diels?Alder反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了與藥物auristatin E的定點(diǎn)偶聯(lián)，顯著提高了偶聯(lián)反應(yīng)的速率，提高了均一化ADCs 的產(chǎn)量。Sapra研究組［76］將正交EcTyrRS/tRNA 對(duì)基因整合到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO）基因組中，構(gòu)建了穩(wěn)定的重組細(xì)胞系4E2，將含ncAAs 抗體產(chǎn)量提升至1 g/L，為均一化ADC 的大規(guī)模生產(chǎn)提供了極大便利。

憑借ncAAs結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)的多樣性，遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)ADCs 的均一化制備，而且還可以極大豐富ADCs的種類與功能。隨著眾多含有不同生物正交化學(xué)官能團(tuán)的ncAAs被用于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)，越來(lái)越多在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的偶聯(lián)反應(yīng)，如疊氮?炔環(huán)加成（azide?alkyne cycloaddition）、點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry）等被用于制備均一化ADCs［77］。通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)引入兩種不同的ncAAs既可以實(shí)現(xiàn)在單個(gè)抗體分子中裝載兩種具有協(xié)同作用的藥物提高ADCs的效力，又可以在單個(gè)抗體中實(shí)現(xiàn)同時(shí)裝載藥物分子和熒光探針用于ADCs 在組織細(xì)胞中的熒光成像。Schultz研究組［78］通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)分別將pAcF 和疊氮化賴氨酸類似物（azido?lysine analog，pAzK）插入到anti?Her2 IgG抗體的重鏈和輕鏈上，成功制備了能同時(shí)偶聯(lián)毒性藥物分子和熒光探針的均一化ADCs。該課題組還通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將pAcF 位點(diǎn)特異性插入到anti?Her2 IgG 抗體中與小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）偶聯(lián)，成功制備出了能夠沉默腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的ADCs 藥物，并且他們發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)位點(diǎn)對(duì)該ADC分子的活性影響較大［79］。Guo課題組［80］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將含疊氮基團(tuán)ncAA定點(diǎn)引入到利妥昔單抗（rituximab）中，通過(guò)與雙功能臂DIBO?DOTA 發(fā)生click 反應(yīng)成功制備出了有放射性核素64Cu 標(biāo)記的ADCs，其具有腫瘤成像和放射性免疫治療的應(yīng)用前景。除了用于抗擊腫瘤外，目前由遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)制備的均一化ADCs還被用于其他疾病的治療。Schultz研究組［81］通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將免疫抑制劑——達(dá)沙替尼（dasatinib）定點(diǎn)偶聯(lián)到能夠與造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells）表面抗原CXCR4高效結(jié)合的人源化抗體HLCX上，制備的ADCs能夠有效避免達(dá)沙替尼靶向性不足而產(chǎn)生的毒副作用，可用于治療T細(xì)胞活化引起的免疫紊亂。利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將甲狀腺激素受體激動(dòng)劑與靶向肝臟的抗體進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)可用于非酒精性脂肪肝炎的治療［82］。此外，相關(guān)ADCs 還被應(yīng)用于治療其他炎癥及代謝性疾病［2］。目前基于ncAAs 偶聯(lián)構(gòu)建的ADCs數(shù)量約占臨床試驗(yàn)ADCs的4%，我們認(rèn)為憑借遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的優(yōu)勢(shì)未來(lái)將有更多基于ncAAs的ADCs被應(yīng)用［67］。

2.2 雙特異性抗體

雙特異性抗體（bispecific antibody）是基因工程抗體的一種，具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，可發(fā)揮類似于免疫突觸（immunological synapse）的功能。雙特異性抗體能夠同時(shí)結(jié)合靶細(xì)胞（通常為腫瘤細(xì)胞）和功能細(xì)胞（通常為T 細(xì)胞），增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞尤其是免疫原性較低的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用（圖2）。雙特異性抗體結(jié)構(gòu)獨(dú)特、功能多樣，已被用于病毒性傳染病的酶聯(lián)免疫檢測(cè)、體內(nèi)組織細(xì)胞成像、腫瘤免疫治療以及穿透血腦屏障治療神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域［82］。目前大量雙特異性抗體藥物仍處于臨床試驗(yàn)階段，至少有3種雙特異性抗體藥物已獲批上市。2009 年由歐盟批準(zhǔn)上市的雙特異性抗體——卡妥索單抗（catumaxomab）可用于治療EpCAM 陽(yáng)性腫瘤導(dǎo)致的惡性腹水［83］。2014 年由美國(guó)批準(zhǔn)上市的博納吐單抗（blinatumomab）是首個(gè)具有雙特異性T 細(xì)胞接合器（bispecific T cell engager）結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體，可同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞的CD3受體和淋巴癌細(xì)胞的CD19受體，用于治療前體B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。?4］。該抗體藥物于2015 年在歐盟批準(zhǔn)上市。由羅氏公司（Roche）開(kāi)發(fā)的雙特異性抗體——艾美賽珠單抗（emicizumab）于2017 年在美國(guó)批準(zhǔn)上市，并于2018 年獲得FDA 認(rèn)證。該抗體藥物是首個(gè)非凝血因子類血友病藥物，可用于預(yù)防體內(nèi)不含VIII因子抑制物的血友病頻繁出血，為血友病的治療提供了新的解決方案［85］。雖然與普通抗體相比，雙特異性抗體表現(xiàn)出了優(yōu)異的靈敏度、特異性以及多靶點(diǎn)靶向能力，但其面臨著表達(dá)量低、容易聚集、血清半衰期短、副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)［85］。

Fig.2 Applications of genetic code expansion in antibody-related drugs圖2 遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在抗體類相關(guān)藥物中的應(yīng)用

傳統(tǒng)雙特異性抗體的構(gòu)建方法主要依賴于將兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的編碼基因進(jìn)行融合表達(dá)，然而這將限制二者的空間排列并可能對(duì)穩(wěn)定性、有效性、選擇性產(chǎn)生影響［86］。利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)中引入ncAAs，通過(guò)正交反應(yīng)與不同長(zhǎng)度的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）連接臂相連可對(duì)二者在空間位置和距離上進(jìn)行調(diào)控。Schultz 研究組［87］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將pAcF 定點(diǎn)插入到anti?CD3 和anti?Her2 抗體的Fab區(qū)，隨后與一端為氨氧基、另一端為疊氮或環(huán)辛烷基團(tuán)的PEG 連接臂通過(guò)兩步反應(yīng)進(jìn)行共價(jià)連接，成功制備了anti?HER2/anti?CD3 Fab雙特異性抗體。只需皮摩爾級(jí)濃度的anti?HER2/anti?CD3 Fab 即可引導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)Her2+陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇性殺傷，該抗體同樣對(duì)低表達(dá)Her2+的腫瘤細(xì)胞顯示出了較強(qiáng)的抑制作用。利用相同的策略，Schultz 研究組［88］還成功制備出了雙特異性抗體anti?CLL1/anti?CD3，用于急性髓系白血病的治療。Young 研究組［89］向anti?BCMA 和anti?CD3 抗體Fab 區(qū)中定點(diǎn)引入pAcF 并利用Diels?Alder 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了二者之間的高效交聯(lián)，成功制備的雙特異性抗體BiFab?BCMA，能夠介導(dǎo)T細(xì)胞識(shí)別成熟B細(xì)胞抗原，特異性殺傷惡性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，為多發(fā)性骨髓瘤的耐藥性問(wèn)題提供了新的治療手段。

鑒于Watson?Crick 堿基配對(duì)具有高度特異性，利用寡核苷酸鏈作為連接臂進(jìn)行雙特異性抗體的快速構(gòu)建同樣取得了成功。Smider研究組［90］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將pAcF 位點(diǎn)特異性地插入到anti?Her2 或anti?CD20 抗體片段的Fab 區(qū)并與一端經(jīng)過(guò)氨氧基修飾的寡核苷酸鏈或者肽核苷酸鏈進(jìn)行正交反應(yīng)，隨后與攜帶有anti?CD3 Fab區(qū)的反義寡核苷酸鏈或肽核苷酸鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)形成完整連接臂，成功制備的雙特異性抗體分別用于乳腺癌和淋巴癌的治療。利用該策略可以快速制備雙特異性抗體，甚至可以制備出異源多價(jià)特異性抗體用于提高抗體藥物的有效性。

基于ncAAs 的正交反應(yīng)可以突破通過(guò)傳統(tǒng)基因融合方式產(chǎn)生雙特異性抗體的限制，將具有靶向作用的小分子與抗體片段Fab連接到一起，制備成均一的小分子/Fab 雙特異性抗體（small?molecule?antibody conjugate，SMAC）（圖2）。Zn2+依賴金屬蛋白酶PSMA在前列腺癌細(xì)胞表面大量表達(dá)而在正常組織中的表達(dá)水平極低，是理想的前列腺癌分子標(biāo)志物。DUPA（2?［3?（1,3?dicarboxy propyl）?ureido］pentanedioic）是PSMA 的高效抑制劑，通過(guò)與PSMA 結(jié)合抑制其酶活性［91］。Schultz 研究組［92］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將pAcF 定點(diǎn)引入到anti?CD3 抗體片段Fab 中并將其與DUPA 通過(guò)連接臂相連，制備成了DUPA/anti?CD3 雙特異性抗體。DUPA/anti?CD3不僅在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞展現(xiàn)出了高效地選擇性殺傷作用，而且在小鼠腫瘤移植模型中也顯現(xiàn)出了良好的安全性和延長(zhǎng)的血清半衰期。葉酸受體（folate receptor）在許多炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞（如卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌等）表面過(guò)度表達(dá)，其對(duì)葉酸具有極強(qiáng)的親和力。該研究組采用相同的策略成功制備了葉酸分子/anti?CD3 Fab雙特異性抗體并將其用于靶向葉酸受體高表達(dá)的癌癥治療，同樣獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［93］。

2.3 基于蛋白質(zhì)開(kāi)關(guān)控制的細(xì)胞治療

與傳統(tǒng)的放化療相比，免疫細(xì)胞療法具有靶向性好、毒副作用小等特點(diǎn)。嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T?cell immune?therapy，CAR?T）在癌癥治療中表現(xiàn)出了巨大潛力，工程化T細(xì)胞表面的scFv抗體能夠靶向識(shí)別體內(nèi)腫瘤組織，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。目前該療法已被FDA 批準(zhǔn)用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療［94］。然而工程化T細(xì)胞在體內(nèi)的不可控性可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果，包括引起細(xì)胞因子釋放綜合癥（cytokine release syndrome）以及長(zhǎng)效B細(xì)胞發(fā)育不全等［95］。為了解決這一問(wèn)題，Young 課題組［96］和Cao 課題組［97］設(shè)計(jì)了一種基于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的蛋白質(zhì)“開(kāi)關(guān)分子”，實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)對(duì)工程化T 細(xì)胞活性的調(diào)控。該“開(kāi)關(guān)分子”由異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和靶向腫瘤細(xì)胞的小抗體分子組成，二者通過(guò)基于ncAAs的正交反應(yīng)共價(jià)相連（圖2）。工程化T細(xì)胞在體內(nèi)不再直接靶向腫瘤細(xì)胞，而是特異性識(shí)別蛋白質(zhì)“開(kāi)關(guān)分子”中的FITC，隨后由蛋白質(zhì)“開(kāi)關(guān)分子”介導(dǎo)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。該方法能夠使人們通過(guò)控制蛋白質(zhì)“開(kāi)關(guān)分子”在體內(nèi)的濃度來(lái)精細(xì)調(diào)控工程化T 細(xì)胞的活性，避免了CAR?T 在體內(nèi)的不可控性。同時(shí)只需對(duì)“開(kāi)關(guān)分子”中的小分子抗體進(jìn)行簡(jiǎn)單替換，即可實(shí)現(xiàn)將工程化T細(xì)胞靶向不同腫瘤細(xì)胞，避免了對(duì)工程化T 細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)改造。

通過(guò)誘導(dǎo)劑控制治療性蛋白質(zhì)的表達(dá)可用于多種疾病的治療。目前研究人員主要通過(guò)誘導(dǎo)劑控制轉(zhuǎn)錄水平的應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)治療性蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控。這種調(diào)控方式響應(yīng)速度慢，并不能夠完全滿足對(duì)疾病治療的需求。Liu 課題組［98］近期開(kāi)發(fā)出了一種基于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的治療開(kāi)關(guān)系統(tǒng)（ncAA triggered therapeutic switch，NATS），實(shí)現(xiàn)了在翻譯水平上對(duì)治療性蛋白質(zhì)表達(dá)的控制，并成功將其用于小鼠糖尿病的治療。他們將遺傳密碼子擴(kuò)展系統(tǒng)以及含有UAG 終止密碼子的胰島素基因同時(shí)整合進(jìn)工程化細(xì)胞中，隨后將該工程化細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，通過(guò)飼喂含有相應(yīng)ncAA的飼料實(shí)現(xiàn)了對(duì)工程化細(xì)胞中胰島素表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，有效降低了小鼠的血糖水平。

2.4 具有共價(jià)交聯(lián)活性的蛋白質(zhì)藥物

與靶點(diǎn)存在共價(jià)交聯(lián)機(jī)制的藥物一般具有選擇性高、藥效持久、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，因此共價(jià)交聯(lián)藥物的開(kāi)發(fā)一直備受關(guān)注。由于小分子化合物藥物易于通過(guò)化學(xué)合成或修飾添加各種反應(yīng)官能團(tuán)，一段時(shí)間以來(lái)共價(jià)交聯(lián)藥物的研發(fā)主要聚焦于一些小分子化合物。一般小分子共價(jià)交聯(lián)藥物會(huì)與靶點(diǎn)蛋白的口袋或活性中心特異性結(jié)合并與其中的Lys 或Cys 殘基側(cè)鏈發(fā)生交聯(lián)形成共價(jià)鍵［99］。值得注意的是，小分子共價(jià)交聯(lián)藥物并不適合用于干擾蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用（protein?protein interactions，PPIs），這是因?yàn)镻PIs 往往發(fā)生在面積高達(dá)數(shù)百埃的界面上，遠(yuǎn)超小分子共價(jià)交聯(lián)藥物的作用能力。PPIs 與諸多生命過(guò)程密切相關(guān)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化調(diào)控以及大分子合成等。PPIs 紊亂會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［100］。以干擾PPIs為目標(biāo)設(shè)計(jì)藥物已被證實(shí)是治療一些炎癥疾病的有效手段。受抗原?抗體特異性相互作用啟發(fā)，研究人員認(rèn)為以同為大分子的多肽或蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)藥物有望成為干擾PPIs，治療相關(guān)疾病的有效手段。

與小分子共價(jià)交聯(lián)藥物類似，若蛋白質(zhì)或多肽類藥物能夠與其靶點(diǎn)共價(jià)連接，有望提高藥物的選擇性并增強(qiáng)藥效。然而20 種cAAs 僅Cys 能夠在沒(méi)有酶催化的情況下形成二硫鍵。二硫鍵在生理?xiàng)l件下易受還原勢(shì)的影響，不適合用于共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物的開(kāi)發(fā)［101］。通過(guò)向蛋白質(zhì)或多肽中引入含有正交反應(yīng)官能團(tuán)的ncAAs 有望解決這一問(wèn)題。Pellecchia研究組［102］利用固相肽合成將Lys?丙烯酰胺插入到靶向E3 泛素連接酶Siah 的短肽BI?107D1中，發(fā)現(xiàn)具有共價(jià)交聯(lián)活性的BI?107D1 肽能夠更好地抑制Siah 的活性，有望用于由Siah 誘發(fā)的癌癥的治療。采用相同的策略，BIM肽被設(shè)計(jì)成為共價(jià)交聯(lián)肽靶向致癌蛋白Bcl2A1，表現(xiàn)出了極好的位點(diǎn)選擇性［103］。在人類癌癥中腫瘤蛋白Mdm2 和Mdm4 會(huì)與腫瘤抑制蛋白p53 發(fā)生相互作用導(dǎo)致其失活。Wang 課題組［104］將含芳基磺酰氟的氨基酸（aryl sulfonyl fluoride，Ar?SO2F）插入到靶向腫瘤蛋白Mdm2 和Mdm4 的短肽SAHp53?8 中制成了共價(jià)交聯(lián)肽，成功干擾了p53 與Mdm2/4 之間的相互作用。他們還發(fā)現(xiàn)該共價(jià)肽對(duì)Mdm4的選擇性明顯高于Mdm2，而野生型SAHp53?8 對(duì)二者的親和力是相同的。隨后又有靶向不同PPIs 的共價(jià)交聯(lián)肽被設(shè)計(jì)合成出來(lái)，其優(yōu)點(diǎn)也得到越來(lái)越多的驗(yàn)證。

由于固相肽合成只能用于合成相對(duì)較短的多肽，這導(dǎo)致該方法不能夠用于大分子共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物的開(kāi)發(fā)，而遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)有望解決這一問(wèn)題。為避免共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物中ncAAs 與胞內(nèi)其他蛋白質(zhì)組分發(fā)生無(wú)區(qū)別的交聯(lián)反應(yīng)干擾細(xì)胞功能，Wang 課題組［105?108］率先提出了鄰近觸發(fā)化學(xué)共價(jià)交聯(lián)（proximity?triggered chemical crosslinking）的概念并合成了一系列新型ncAAs，包括含鹵代烷烴的EB3、含全氟苯的F?PSCaa、含氟乙酰胺的FAcK 以及含芳基氨基甲酸酯的FPheK等。這些ncAAs 在生理?xiàng)l件下不會(huì)與胞內(nèi)低濃度游離的cAAs 或蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，只有含ncAAs 的共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物與靶蛋白成功建立起穩(wěn)定的相互作用，ncAA以適當(dāng)方向接近其靶點(diǎn)cAA時(shí)才會(huì)激發(fā)共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。該課題組最近利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)開(kāi)發(fā)出了第一種共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物用于癌癥的治療［109］。人程序性死亡蛋白?1（PD?1）是位于T 細(xì)胞膜表面可調(diào)控T 細(xì)胞活性的轉(zhuǎn)膜受體。PD?L1 可與PD?1 發(fā)生相互作用抑制T 細(xì)胞增殖活化，導(dǎo)致腫瘤特異性T細(xì)胞衰竭和凋亡，其往往在不同腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)（圖3）。使用外源PD?1競(jìng)爭(zhēng)性阻斷體內(nèi)T細(xì)胞上PD?1分子與腫瘤細(xì)胞上PD?L1分子間的相互作用可用于癌癥免疫治療。Wang 課題組將氟磺酸?L?酪氨酸（4?flourosulfate?L?tyrosine，F(xiàn)SY）通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)定點(diǎn)引入到PD?1 中制備成了可發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的蛋白藥物PD?1（FSY）。FSY 可在PD?1（FSY）與PD?L1 發(fā)生相互作用時(shí)與PD?L1 上特定的His殘基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)（圖3）。他們發(fā)現(xiàn)，不管是體內(nèi)還是體外，PD?1（FSY）都比野生型PD?1表現(xiàn)出了更好的抗腫瘤活性［109］。利用蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis?targeting chimera methodology，PROTAC）降解腫瘤源性蛋白可用于癌癥的治療。Chen 課題組［110］通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向anti?PD?L1納米抗體中引入FYS，構(gòu)建了能夠與PD?L1 形成共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物GlueTAC。GlueTAC能夠與腫瘤細(xì)胞表面的PD?L1形成共價(jià)交聯(lián)，促進(jìn)PD?L1的內(nèi)吞和在溶酶體中的降解，有效緩解PD?L1造成的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。共價(jià)交聯(lián)蛋白藥物概念的提出以及遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的應(yīng)用將蛋白藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提升到了新的高度。

Fig.3 The mechanisms of PD-1（FSY）in cancer treatment圖3 共價(jià)蛋白藥物PD-1（FSY）治療腫瘤的原理示意圖

2.5 治療性蛋白疫苗

遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)為治療性疫苗和預(yù)防性疫苗的開(kāi)發(fā)提供了開(kāi)創(chuàng)性解決方案，有望在疫苗領(lǐng)域引起一場(chǎng)新的技術(shù)革命。一般人體內(nèi)免疫系統(tǒng)不會(huì)對(duì)自身蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的現(xiàn)象稱之為免疫耐受，自身免疫耐受可有效防止自免疫疾病的發(fā)生［111］。然而在某些情況下打破自身免疫耐受，引導(dǎo)免疫系統(tǒng)靶向自身蛋白質(zhì)有助于包括癌癥、慢性炎癥以及骨質(zhì)疏松等多種疾病的治療［112?113］。通過(guò)向自身蛋白質(zhì)中引入新的抗原表位或者進(jìn)行大量化學(xué)修飾可在一定程度上打破自身免疫耐受激活體內(nèi)免疫應(yīng)答，但同時(shí)有可能對(duì)目標(biāo)蛋白的折疊產(chǎn)生影響［114］。機(jī)體在受到病毒感染以及發(fā)生炎癥時(shí)會(huì)通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)自身某些蛋白質(zhì)中的Tyr殘基發(fā)生翻譯后修飾形成硝基酪氨酸（nitrotyrosine）和磺基酪氨酸（sulfotyrosine），目前這一過(guò)程被證實(shí)與機(jī)體打破免疫耐受，誘發(fā)自身免疫疾病相關(guān)。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)硝基和磺基在體內(nèi)具有較強(qiáng)免疫原性，是打破自身免疫耐受的關(guān)鍵所在。因此，一些含硝基或者磺基的ncAAs，包括p?nitro?L?phenylalanine（pNO2F）、3?nitro?L?tyrosine（3?NO2Y）和p?sulfo?L?phenylalanine（pSO3F）被認(rèn)為可用于治療性蛋白疫苗的開(kāi)發(fā)（圖4）［115?116］。

腫瘤壞死因子?α（TNF?α）是在機(jī)體炎癥發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色的多功能細(xì)胞因子，被認(rèn)為與多種炎癥疾病相關(guān)，包括克羅恩病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。以TNF?α為靶點(diǎn)，打破其自身免疫耐受，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和TNF?α抗體被認(rèn)為可用于多種炎癥疾病的治療。Smider課題組［117?118］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將小鼠mTNF?α中第11位Lys或第86位Tyr 殘基定點(diǎn)突變成pNO2Phe 后，mTNF?α 產(chǎn)生了新的抗原決定簇，有效打破了自身免疫耐受，產(chǎn)生了能夠同時(shí)識(shí)別突變體及野生型mTNF?α的高效價(jià)抗體。他們發(fā)現(xiàn)pNO2Phe在mTNF?α中的突變位置對(duì)能否打破自身免疫耐受至關(guān)重要。為了明確pNO2Phe86?mTNF?α 的作用，他們分別將接種了野生型mTNF?α 和突變體pNO2Phe86?mTNF?α 的小鼠進(jìn)行脂多糖（LPS）處理，發(fā)現(xiàn)免疫接種pNO2Phe86?mTNF?α 后可有效降低小鼠的死亡率。RANKL是TNF家族中的細(xì)胞因子，其與能夠分解骨骼組織的噬骨細(xì)胞激活有關(guān)，是治療骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的潛在靶點(diǎn)［119］。Tao 課題組［120］通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將RANKL 中第234位和第240位的Tyr殘基突變?yōu)閜NO2Phe后，有效打破了其自身免疫耐受，產(chǎn)生了能夠同時(shí)特異性識(shí)別野生型和突變體RANKL且在體內(nèi)持留時(shí)間長(zhǎng)的高效價(jià)抗體。他們隨后還明確了免疫接種pNO2Phe234?mRANKL 后，小鼠的骨質(zhì)疏松和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀明顯減輕。其他自身蛋白質(zhì)如補(bǔ)體系統(tǒng)組分5α、蛋白前體轉(zhuǎn)化酶subtilisin/kexin 9 等同樣可以通過(guò)類似的策略打破自身免疫耐受［117］。通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)插入免疫原性強(qiáng)的ncAAs不僅可以用于打破自身免疫耐受，同時(shí)還有望提高一些外源蛋白的免疫原性，用于一些感染性疾病的預(yù)防和治療。

2.6 預(yù)防性衰減疫苗

目前人們主要通過(guò)接種滅活或者減毒疫苗來(lái)預(yù)防一些傳染病。滅活疫苗中的病原體在體內(nèi)無(wú)法復(fù)制繁殖，往往需要多次免疫接種才能達(dá)到理想的預(yù)防效果；而減毒活疫苗在體內(nèi)能夠正常復(fù)制繁殖，只需接種一次就可以獲得較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，但存在減毒病原體通過(guò)回復(fù)突變重新獲得致病性的使用安全問(wèn)題。將病原微生物中關(guān)鍵蛋白進(jìn)行基于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的ncAAs 突變，可構(gòu)建出嚴(yán)格依賴ncAAs生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。這些突變株由于ncAAs的缺乏而不能在人體內(nèi)正常復(fù)制繁殖，會(huì)逐漸消亡（圖4）［67］。將該技術(shù)用于疫苗領(lǐng)域具有諸多優(yōu)勢(shì)：a.突變株與野生型病原體的結(jié)構(gòu)完全一致，具有與野生型一樣的免疫原性，能夠激發(fā)宿主發(fā)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答；b.在病原微生物必需基因中插入多個(gè)ncAAs可有效降低發(fā)生回復(fù)突變重新獲得致病性的概率，提高安全性；c.與獲得減毒突變株的傳統(tǒng)方法相比，ncAAs營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株構(gòu)建方法簡(jiǎn)單且適用范圍較廣。

目前遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)已被應(yīng)用于病毒衰減疫苗的研發(fā)。ncAAs營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變病毒株只能夠在相應(yīng)ncAAs 存在的情況下，在含有正交aaRS/tRNA 對(duì)的細(xì)胞系中生長(zhǎng)繁殖，在人體正常細(xì)胞中則不能復(fù)制繁殖（圖4）。Guo課題組［121］率先將遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)用于HIV?1 ncAA 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的構(gòu)建。他們向HIV?1 不同基因中引入U(xiǎn)AG突變，隨后利用含有正交aaRS/tRNA對(duì)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系對(duì)HIV?1病毒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以期能獲得具有感染活性的ncAA營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。通過(guò)一系列篩選，他們發(fā)現(xiàn)將HIV?1蛋白酶第59位Tyr殘基或?qū)ag 蛋白第36 位Trp 殘基和第127 位Gln 殘基突變?yōu)閜AzPhe 可保留病毒的自組裝能力和感染性。然而UAG 回復(fù)突變?yōu)槠渌辛x密碼子的風(fēng)險(xiǎn)限制了該ncAAs營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的進(jìn)一步應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題，該課題組將四堿基密碼子（UAGA）替換了UAG密碼子用于介導(dǎo)ncAAs的插入，大幅降低了ncAAs營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)生回復(fù)突變的頻率［122］。除此之外，他們還將編碼正交aaRS/tRNA對(duì)的基因整合到HIV?1基因組中，其可在感染過(guò)程中與病毒基因組一起插入到機(jī)體正常細(xì)胞中，隨后可通過(guò)控制ncAAs的有無(wú)來(lái)調(diào)控HIV?1在體內(nèi)的傳代次數(shù)，達(dá)到增強(qiáng)免疫的效果［123］。Zhou 課題組［124］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向流感病毒（influenza virus）NP蛋白中引入多個(gè)UAG突變，成功構(gòu)建了低逃逸率的流感病毒ncAAs 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。通過(guò)多種動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)獲得的流感病毒ncAAs 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株與商品化的疫苗相比具有更強(qiáng)的免疫原性，可激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生更強(qiáng)、更廣泛的免疫應(yīng)答。

利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)構(gòu)建嚴(yán)格依賴ncAAs生長(zhǎng)的致病菌同樣獲得了成功。與病毒相比，由于病原菌具有獨(dú)立的大分子合成系統(tǒng)，其逃逸頻率，即發(fā)生回復(fù)突變的頻率相對(duì)更高。目前研究人員已采用多種策略有效解決了這一問(wèn)題。Isaacs 課題組［125］通過(guò)向E.coli22個(gè)必需基因中同時(shí)引入多個(gè)UAG 突變，大幅降低了逃逸頻率。Church 課題組［126］通過(guò)計(jì)算生物學(xué)和基于ncAAs的篩選，獲得了代謝過(guò)程嚴(yán)格依賴ncAAs的E.coli菌株，有效避免了由基因突變或者水平基因轉(zhuǎn)移造成的逃逸。Schultz課題組［127?129］通過(guò)利用定點(diǎn)突變建立起嚴(yán)格依賴ncAAs 的關(guān)鍵酶活性位點(diǎn)、關(guān)鍵蛋白質(zhì)間相互作用以及關(guān)鍵蛋白質(zhì)修飾/去修飾的方式同樣大幅降低了逃逸效率。目前嚴(yán)格依賴ncAAs 的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）已被成功構(gòu)建，其作為活體疫苗預(yù)防肺結(jié)核的研究也正在進(jìn)行當(dāng)中［24］。

Fig.4 Applications of genetic code expansion in the vaccine development圖4 遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在疫苗中的應(yīng)用

2.7 治療性細(xì)胞因子的長(zhǎng)效化

蛋白質(zhì)類藥物一般都具有分子質(zhì)量高、半衰期短、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)蛋白藥物進(jìn)行共價(jià)聚乙二醇修飾（PEGylation）可有效提高蛋白藥物的穩(wěn)定性以及在體內(nèi)的半衰期［130］。過(guò)去一般采用對(duì)蛋白質(zhì)N 端氨基、C 端羧基、Lys 的ε?氨基或者Cys的巰基進(jìn)行修飾。然而對(duì)蛋白質(zhì)末端修飾可能會(huì)影響其活性，對(duì)內(nèi)部的Lys 和Cys 殘基進(jìn)行不加選擇地修飾會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物不均一，無(wú)法獲得藥效穩(wěn)定的產(chǎn)物并可能影響蛋白藥物的免疫原性［131］。通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)定點(diǎn)引入ncAAs不僅可以獲得均一的PEG 修飾產(chǎn)物，還可以明確不同修飾位點(diǎn)對(duì)治療性蛋白性質(zhì)的影響從而獲得藥效更加優(yōu)良的修飾蛋白。Kimmel 研究組［132］率先利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向人生長(zhǎng)激素（human growth hormone，hGH）不同位點(diǎn)引入pAcF，通過(guò)與含氨氧基修飾的PEG 分子形成肟鍵構(gòu)建了一系列在不同位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)均一化PEG 修飾的hGH，并對(duì)它們的性質(zhì)進(jìn)行了比較分析。其中Y35pAcF?hGH 在大鼠模型中與野生型hGH 活性相當(dāng)并且具有更優(yōu)良的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，極大提高了hGH 在體內(nèi)的半衰期。隨后Y35pAcF?hGH 被命名為ARX201，用于成人生長(zhǎng)激素缺乏癥（AGHD）的臨床治療并取得了理想效果，有助于大幅降低hGH 的給藥頻率。Zhou 研究組［133］在上述研究的基礎(chǔ)上利用相同的策略對(duì)hGH 進(jìn)行了多位點(diǎn)PEG 修飾，獲得的最終突變體Y35/G131/K145?NEAK 與Y35pAcF 相比具有更低的免疫原性和更優(yōu)良的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。目前人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（FGF21）、牛粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）、干擾素α2b（IFN?α2b）、生長(zhǎng)激素受體拮抗劑（GHR antagonists）、白介素?4（interleukin?4，IL?4）等均采用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)進(jìn)行了定點(diǎn)PEG 修飾，在保留了其生物學(xué)功能的同時(shí)大幅提高了血清半衰期［72］。PEG 雖然能夠有效延長(zhǎng)治療性蛋白在體內(nèi)的半衰期，但研究表明PEG黏附脂質(zhì)體會(huì)激活體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生中和PEG抗體，導(dǎo)致二次給藥時(shí)PEG 修飾蛋白的血清半衰期縮短，因此有必要尋找性質(zhì)更加優(yōu)良并可用于蛋白質(zhì)修飾的聚合物［134］。Meinel 研究組［135］通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向IL?4中定點(diǎn)引入含炔丙基的賴氨酸類似物（propargyl?L?lysine，Plk）并將其用于聚2?惡唑啉（poly 2?oxazoline，Pox）聚合物修飾，結(jié)果表明修飾后的IL?4生物學(xué)功能、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均未受到影響。

將生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及其他調(diào)控因子固定到病灶周圍可在保證治療疾病的同時(shí)有效緩解這些治療性蛋白存在的全身毒副作用。利用蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的Lys 或Cys 殘基固定到介質(zhì)表面會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物不均一、空間排列混亂，影響其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及免疫原性［136］。通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將治療性蛋白位點(diǎn)特異性地固定到載體上，可制備空間排列單一的均一化產(chǎn)物。Meinel研究組［137］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將Plk位點(diǎn)特異性插入到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）中，通過(guò)銅催化的疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)將其連接到瓊脂糖顆粒上，制備的固定化Plk?FGF?2可高效促進(jìn)其周圍人骨肉瘤細(xì)胞的增殖。他們采用相同的策略將IL?4 固定到瓊脂糖顆粒上，發(fā)現(xiàn)固定后的IL?4仍具有生物學(xué)功能，可有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化［138］。該研究組還通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將Plk 定點(diǎn)插入到胰島素樣生長(zhǎng)因子I（IGF?1）中并將其固定到瓊脂糖顆粒上，他們發(fā)現(xiàn)固定化plk?IGF?I比游離IGF?1更能有效促進(jìn)C2C12細(xì)胞肌管形成［139］。Nickel 課題組［140］利用基于ncAAs 的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）固定到含有活化疊氮基的瓊脂糖微珠上，發(fā)現(xiàn)BMP2?K3Plk具有促進(jìn)其周圍細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化的潛力。上述研究表明利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)制備固定化蛋白因子有望用于傷口愈合、骨缺陷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及動(dòng)脈硬化癥等疾病的治療。

2.8 抗菌肽

隨著抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，開(kāi)發(fā)下一代高效廣譜抗菌藥物已迫在眉睫?？咕模╝ntimicrobial peptide）是一類具有抑菌殺菌功能、帶正電荷的兩親性小分子肽，通常由11～50個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛存在于微生物以及動(dòng)植物體內(nèi)，是宿主天然免疫的重要組成部分?？咕姆N類和數(shù)量繁多，目前已發(fā)現(xiàn)有3 000 多種，被認(rèn)為是抗生素藥物的理想替代品［141］。一般在生理?xiàng)l件下，抗菌肽的穩(wěn)定性及可溶性較差，易受蛋白酶水解，這限制了其在生物醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用。已有大量研究表明，通過(guò)蛋白質(zhì)工程可有效改良抗菌肽的性質(zhì)，提高其應(yīng)用價(jià)值［142］。一些抗菌肽以前體的形式被核糖體翻譯出來(lái)，隨后通過(guò)翻譯后加工修飾形成有活性的形態(tài)，翻譯后修飾的過(guò)程往往涉及一些ncAAs的形成。受此啟發(fā)，研究人員認(rèn)為對(duì)抗菌肽進(jìn)行基于ncAAs 的改造有望獲得穩(wěn)定性、特異性、半衰期、抗菌譜等性質(zhì)顯著提高的突變體［143］。

目前有關(guān)利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)對(duì)抗菌肽進(jìn)行基于ncAAs 改良的研究才剛剛起步。Donk 課題組［144］通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向抗菌肽lacticin 481和nukacin ISK?1核心區(qū)與前導(dǎo)肽之間定點(diǎn)引入α?羥基酸（alpha hydroxy acid），實(shí)現(xiàn)了利用酸堿處理去除前導(dǎo)肽，避免了特異性蛋白酶的使用。Schultz研究組［145］將含有α氯乙酰胺的ncAAs通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)插入乳鏈菌肽A（nisin A）中形成了由硫醚鍵組成的新型環(huán)狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Link研究組［146］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將4 種ncAAs引入抗菌肽MccJ25 結(jié)構(gòu)中，豐富了該抗菌肽的化學(xué)多樣性。Süssmuth研究組［147］同樣通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將5 種ncAAs 插入抗菌肽capistruin 中，利用Hoveyda?Grubbs 催化劑修飾ncAAs 的側(cè)鏈基團(tuán)成功引入了新的化學(xué)結(jié)構(gòu)。Young 課題組［25］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向抗菌肽thiocillin中引入了一些含有生物物理探針（熒光探針、光交聯(lián)基團(tuán)）的ncAAs，在提高thiocillin化學(xué)多樣性的同時(shí)為探測(cè)其抗菌機(jī)理提供了便利。Donk 課題組［148］將多種ncAAs定點(diǎn)引入到抗菌肽lacticin 481中獲得了抑菌活性顯著提高的突變體。盡管多項(xiàng)研究表明插入ncAAs可能會(huì)導(dǎo)致抗菌肽的生物學(xué)活性下降，但該領(lǐng)域的先驅(qū)們普遍認(rèn)為向抗菌肽分子內(nèi)部引入ncAAs必將豐富抗菌肽的化學(xué)多樣性，有望開(kāi)發(fā)出針對(duì)新型病原體的殺傷能力。

2.9 病毒載體外殼蛋白修飾

腺病毒（adeno?associated virus，AAV）隸屬于細(xì)小病毒科，其基因組為線狀DNA 分子。AAV無(wú)明顯致病性，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，是基因治療中常用的病毒載體。然而其在體內(nèi)靶向性差，免疫原性強(qiáng)，血清半衰期短等特點(diǎn)限制了其應(yīng)用［149］。相關(guān)學(xué)者通過(guò)基于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的多種策略在一定程度上解決了上述問(wèn)題。Zhou 課題組［150］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將Nε?2?azideoethyloxycarbonyl?L?lysine（NAEK）定點(diǎn)插入到衣殼蛋白VP1 中，構(gòu)建了一系列含有定點(diǎn)PEG 修飾的AAV 突變體并從中獲得了血清穩(wěn)定性提高了2.4 倍的修飾病毒顆粒。Chatterjee 課題組［151］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將靶向整合素的環(huán)肽RGD（cyclic?RGD peptide）定點(diǎn)錨定到AAV衣殼蛋白上，顯著提高了AAV對(duì)高表達(dá)αvβ3整合素受體細(xì)胞的識(shí)別和轉(zhuǎn)染。Zhou課題組［152］通過(guò)遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)將熒光探針連接到病毒載體上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒顆粒感染細(xì)胞及在胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)目梢暬O(jiān)測(cè)。最近，Chatterjee 課題組［153］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)AAV 載體感染性的光調(diào)控，為未來(lái)在使用過(guò)程中對(duì)AAV 載體的時(shí)空調(diào)控打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。他們將AAV2衣殼蛋白VP1 中參與宿主細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基（R585，R588）進(jìn)行了ncAAs 突變，新引入的賴氨酸衍生物NBK 由于正電荷屏蔽作用及空間位阻效應(yīng)可干擾VP1與HSPG的結(jié)合，從而抑制AAV2 的感染性。通過(guò)紫外光照射可使NBK脫去保護(hù)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)ys，使AAV2恢復(fù)感染活性。

3 其他應(yīng)用

環(huán)肽一般結(jié)構(gòu)緊密，與靶點(diǎn)結(jié)合親和力高并能耐受蛋白酶的降解，其在蛋白質(zhì)抑制劑開(kāi)發(fā)方面具有重要應(yīng)用。Schultz研究組［154］將遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)用于HIV?1蛋白酶抑制劑環(huán)肽的開(kāi)發(fā)，通過(guò)多輪進(jìn)化篩選，他們發(fā)現(xiàn)將對(duì)苯甲酰苯丙氨酸（4?benzoyl?L?phenylalanine，pBzF）定點(diǎn)引入到環(huán)肽G12 中，可誘使G12 與HIV 蛋白酶發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，顯著抑制其活性。Kawakamide 研究組［155］同樣借助于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)獲得了能夠抑制TNF?α功能的環(huán)肽分子。Smider研究組［156］利用噬菌體展示技術(shù)和遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)獲得了對(duì)HIV gp120蛋白親和力顯著提高的抗體分子，并且發(fā)現(xiàn)ncAAs 在其中扮演的角色具有不可替代性。目前CRISPR/Cas 已被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域，在未來(lái)有望用于人類一些重大遺傳病以及癌癥的治療，然而其潛在的脫靶效應(yīng)仍待解決。Deiters 研究組［157］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)向Cas9 中定點(diǎn)插入光保護(hù)的賴氨酸（PCK）抑制其活性，隨后通過(guò)紫外光照使PCK脫去光保護(hù)基團(tuán)形成Lys恢復(fù)活性，實(shí)現(xiàn)了在時(shí)間和空間上對(duì)Cas9 活性的調(diào)控。Liu 課題組［158］通過(guò)將 4?（2?azidoethoxy）?l?phenylalanine（AeF）定點(diǎn)插入到Cas12 蛋白中并與相應(yīng)含有二苯并環(huán)辛炔修飾的crRNA 形成共價(jià)復(fù)合物，顯著提高了Cas12?crRNA 的基因編輯能力，并成功將其用于CAR?T 細(xì)胞的制備。此外，遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于一些病原微生物致病機(jī)理的研究。Chen 課題組［159］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在一些腸道致病菌中（如E.coli，Shigella，Salmonella）引入一系列光交聯(lián)（photo crosslinking）ncAAs，研究了這些致病菌在感染人體過(guò)程中抵御胃酸及分泌毒素的分子機(jī)制。Müller課題組［160］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)以及熒光手段研究了HIV包膜糖蛋白在病毒出芽過(guò)程中的作用。Shin課題組［161］利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)對(duì)β?N?乙酰己糖氨基酶進(jìn)行甘露糖?6?磷酸鹽（M6Ps）修飾并將其靶向細(xì)胞內(nèi)的溶酶體，成功用于缺乏內(nèi)源性β?N?乙酰己糖氨基酶細(xì)胞疾病的治療。

4 總結(jié)與展望

本文綜述了遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)近幾年來(lái)的研究進(jìn)展及其在蛋白質(zhì)及多肽等生物技術(shù)藥物中的應(yīng)用。雖然研究人員目前已經(jīng)能夠通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將200多種ncAAs位點(diǎn)特異性插入到蛋白質(zhì)中，但是這些ncAAs 在結(jié)構(gòu)上大多是對(duì)Tyr 或Lys結(jié)構(gòu)的延伸，將更多不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的ncAAs用于遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)有望擴(kuò)展該技術(shù)的能力。由于真核生物基因組龐大且復(fù)雜，現(xiàn)階段通過(guò)密碼子重分配提高遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)在真核生物中的ncAA整合效率、增加含ncAAs蛋白質(zhì)的產(chǎn)量仍無(wú)法獲得突破。由于密碼子和相互正交RS/tRNA對(duì)的匱乏，向除E.coli之外的物種中同時(shí)插入兩個(gè)以上不同的ncAAs依然具有困難。將遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用于更多物種，包括一些特殊致病菌以及高等多細(xì)胞生物等仍面臨巨大挑戰(zhàn)。然而隨著合成生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分子生物學(xué)以及生物化學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展與積累并指導(dǎo)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的改良與突破，人類最終有望能夠在細(xì)胞中從頭合成全部由ncAAs 組成的非天然聚合物（non?canonical polymers）。隨著計(jì)算化學(xué)以及計(jì)算生物學(xué)技術(shù)的興起，通過(guò)計(jì)算模擬輔助遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)用于蛋白質(zhì)及多肽藥物的設(shè)計(jì)將大大提高成功率并有效節(jié)約生產(chǎn)成本。隨著遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)不斷成熟與發(fā)展，未來(lái)其將為諸多生物學(xué)問(wèn)題提供開(kāi)創(chuàng)性解決方案。