郝秀萍 武林芝

（太原學(xué)院材料與化學(xué)工程系，太原 030032）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是癡呆癥的主要類型，是一種漸進性腦部疾病，它逐漸破壞人的記憶和思維能力，最終導(dǎo)致日常行為能力的喪失。在影響病人生活質(zhì)量的同時，還帶來源源不斷的社會問題，是目前最受關(guān)注的神經(jīng)和精神疾病之一［1］。AD 的兩大病理特征包括由tau 蛋白形成的細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和由β 淀粉樣蛋白（Aβ）形成的細胞外老年斑［2?3］。人們認為Aβ的錯誤積累在AD 的病理學(xué)中起著核心作用［4］。以Aβ為靶標的療法主要針對的是單體或寡聚體的Aβ40和Aβ42，但以Aβ40 和Aβ42 為靶標的臨床治療結(jié)果并不理想，人們對此進行了分析并提出了多靶標策略［5］。淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的水解加工過程會產(chǎn)生一系列不同長度的截短Aβ種類。此外，Aβ肽還會受到廣泛的翻譯后修飾。雖然大多數(shù)AD病例是散發(fā)性的，但已經(jīng)確定了許多家族性阿爾茨海默?。╢amilial AD）和相關(guān)的腦淀粉樣血管病會導(dǎo)致AD 的早發(fā)和嚴重程度的增加，許多FAD的Aβ會發(fā)生單個氨基酸突變。大量的研究表明，這些突變Aβ、截短Aβ、被修飾的Aβ會加快聚集動力學(xué)，改變聚集體構(gòu)象，并具有更高的細胞毒性。這些Aβ 種類可能破壞了腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)并加速了AD神經(jīng)變性。我們調(diào)查了大量的文獻，對這些Aβ 種類的聚集特性及在AD發(fā)展過程中可能產(chǎn)生的影響進行分類總結(jié)，并評述了檢測分析這些Aβ種類的方法。

1 Aβ變體

大多數(shù)AD 病例是散發(fā)的，但一小部分稱為FAD 的AD 病例與早老素1、早老素2 或APP 的突變有關(guān)。根據(jù)這些FAD 首次發(fā)現(xiàn)的地域，分別命名為英國型（English，H6R）、日本鳥取型（Tottori，D7N）、佛蘭德型（Flemish，A21G）、大阪型（Osaka，E22Δ）、荷蘭型（Dutch，E22Q）、意大利型（Italian，E22K）、北極型（Arctic，E22G）、愛荷華型（Iowa，D23N）、皮爾蒙特型（Piedmont，L34V）等。位于淀粉樣蛋白序列內(nèi)部的APP 突變會導(dǎo)致多種疾病表型，包括早發(fā)性癡呆、腦淀粉樣血管病、出血性中風(fēng)等。這些氨基酸取代改變了Aβ 的產(chǎn)生量，增加了Aβ42 與Aβ40 的比率，改變了突變Aβ 變體的聚集潛力，有的還促進了有毒聚集體的形成。表1 列出了不同Aβ 突變體肽的聚集特性及其影響。

1.1 突變Aβ肽的影響及相應(yīng)臨床表現(xiàn)

A2T突變是一種保護性的突變，A2T突變能減少β 分泌酶1（BACE1）對APP的裂解。體外研究表明，它使淀粉樣蛋白聚集物的形成減少約40%，可以預(yù)防AD 和老年人的認知能力下降［6］，但Aβ 42A2T 肽的體外細胞毒性高于野生型Aβ42，并且在聚集的早期與模型膜相互作用［7］。A2V 變異在純合子個體中是致病的，雜合子的親屬沒有受到影響，隱性A2V 突變能增加Aβ 的產(chǎn)生［8］，A2V Aβ的沉積物很大，主要存在血管周圍，在影響小腦的同時會減少新紋狀體［9］。English（H6R）Aβ 的細胞毒性更強［10］，H6R 突變導(dǎo)致His6 結(jié)構(gòu)域不能參與鋅離子的鰲合，而由（EVHH14）?E?11 片段配位的鋅離子能促進其形成穩(wěn)定的二聚體［11］。

人們在一個可能患AD的日本家系中，發(fā)現(xiàn)了D7N錯義突變［12］。Aβ D7N突變增強了寡聚體的細胞毒性［10］。Chen等［13］在一個具有早發(fā)性AD的臺灣家庭中，鑒別出了位于Aβ 序列內(nèi)的新型APP 突變——D7H，這種突變增加了Aβ 的產(chǎn)生，提高了Aβ42/Aβ40 的比率，具有更高的神經(jīng)毒性。由于D7H 突變型Aβ 具有一個額外的金屬離子配位殘基組氨酸，它與Zn2+/Cu2+具有更高的親和力，這可能促使Aβ D7H 具有高致病性。BACE1 酶是Aβ 產(chǎn)生過程中一種非常重要的切割酶，它有兩個切割位點，β 位點（1 號位點）和β′位點（11 號位點），E11K 突變使得BACE1 切割位點移向了β 位，導(dǎo)致Aβ40 和Aβ42 的水平含量增加了2～3 倍，Aβ42/Aβ 40的比率也略微升高。

APP 687 位的賴氨酸?天冬酰胺取代（根據(jù)Aβ編號稱為K16N），導(dǎo)致早期具有常染色體顯性遺傳模式的癡呆。K16N突變位于α分泌酶切割位點，使得APP 的分泌受到影響，產(chǎn)生了更多的Aβ 肽。帶有K16N 突變的Aβ 肽的獨特之處在于該肽本身對神經(jīng)元細胞無害，然而野生型和突變體肽的等摩爾混合物則顯示出很強的毒性。此外，Aβ42 K16N抑制野生型Aβ42 原纖維的形成。Aβ42 K16N 不易被主要的Aβ降解酶腦啡肽酶清除［14］。

Flemish（AβA21G）AD 是在一個具有早老性癡呆和腦淀粉樣血管病引起的腦出血家族中發(fā)現(xiàn)的遺傳突變類型［15］。與其他以腦Aβ42為主的FAD病例相反，F(xiàn)lemish AD 病人主要沉積Aβ40，而且大腦中的老年斑主要集中在血管上。Yagi?Utsumi 和Dobson［16］的研究表明，A21G突變改變了Aβ40形成淀粉樣蛋白原纖維的初始成核過程，從而影響了Aβ 的膜結(jié)合特性。Aβ A21G 肽被腦啡肽酶降解的速度明顯比野生型Aβ 或任何其他突變體肽慢［17］。Aβ42 A21G 和Aβ42 野生型都能誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡，特別是N 端截短肽毒性更強［18］，但Wang等［19］對Aβ42 A21G的體外細胞實驗表明，從細胞形態(tài)、生存力或細胞增殖來判斷，Aβ A21G 和Aβ野生型對兩種類型的平滑肌細胞均未引起明顯的毒性。

在一個患有癡呆癥及AD的日本家系中確定了Aβ E22?，即缺少22 號谷氨酸的變體Aβ［20］。該突變顯著降低了總Aβ的分泌，但變體Aβ對蛋白質(zhì)水解的抵抗力更高，并且比野生型Aβ 更有效地抑制大鼠海馬長時程增強。與無毒Aβ40 野生型相比，Aβ40 E22Δ在大鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中具有神經(jīng)毒性，而Aβ42 E22Δ 的毒性低于Aβ42 野生型，但在神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中，每個細胞的神經(jīng)突生長明顯減少［21］。E22G 是在患有AD 的瑞典家庭中發(fā)現(xiàn)的突變類型，這種突變的攜帶者顯示血漿中Aβ42 和Aβ40水平降低［22］，聚集過程早期形成的中間物會從神經(jīng)突開始引發(fā)細胞功能障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，并引起中度的神經(jīng)膠質(zhì)和炎癥組織反應(yīng)［23?24］。Aβ E22G 突變使其對腦啡肽酶具有抵抗力，因此，Aβ E22G 不僅可以通過促進原纖維形成，而且可以通過延長Aβ 在大腦中的半衰期來致?。?5］。Bugiani 等［26］對患有淀粉樣變性與Aβ E22K 突變相關(guān)的遺傳性腦出血患者的臨床研究顯示，受影響的個體表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的頭痛和多發(fā)性中風(fēng)，大多數(shù)患者隨后出現(xiàn)癲癇和認知能力下降。Aβ E22K 突變使其對腦啡肽酶也具有抵抗力［25］。在患有淀粉樣變性的遺傳性腦出血的荷蘭患者，即淀粉樣變性?荷蘭型（HCHWA?D）中，Aβ 22 位的氨基酸發(fā)生谷氨酰胺（Q）取代谷氨酸（E），導(dǎo)致了Aβ 在這些患者的腦血管壁中沉積，從而導(dǎo)致腦出血和過早死亡［27］。Aβ E22Q 對腦啡肽酶也具有抵抗力［25］，Aβ40 E22Q 會在培養(yǎng)的人腦血管平滑肌細胞中誘導(dǎo)強大的病理反應(yīng)，包括提高APP 水平和細胞死亡［28］。在APP Dutch小鼠和HCHWA?D人腦中，Aβ40與Aβ42的比率顯著高于APP野生型小鼠或AD 人腦中的比率［29］。野生型Aβ 容易從腦中轉(zhuǎn)運到血漿中，但荷蘭型突變體Aβ 不容易清除出去，這可能導(dǎo)致其在腦血管系統(tǒng)中的大量積累［30］。另外，Aβ E22Q 刺激基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP?2）的表達和激活，而MMP?2 的表達和激活增加可能會導(dǎo)致人腦血管平滑肌（HCSM）細胞因致病性Aβ而死亡［31］。

Grabowski 等［32］報告了愛荷華州三代家庭中APP 的一個新突變位點，694 位（對應(yīng)于Aβ 的23號）天冬氨酸被天冬酰胺取代（D23N），是常染色體顯性癡呆?；颊甙橛羞M行性失語性癡呆，白質(zhì)腦病和枕骨鈣化，神經(jīng)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)嚴重的腦淀粉樣血管病，廣泛的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和斑塊中Aβ40的異常分布。研究表明，D23N突變顯著增加了神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞的肽毒性［33］。

Obici等［34］報道了一個常染色體顯性遺傳、復(fù)發(fā)性腦出血的家庭中Aβ 序列內(nèi)的新型突變（L34V），病理檢查發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致了嚴重的腦淀粉樣血管病，但沒有實質(zhì)性淀粉樣斑塊或神經(jīng)原纖維纏結(jié)。L34V Aβ形成的寡聚體或原纖維能誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞凋亡［35］。

Table 1 A compilation of aggregation characteristics and effects of amyloid β mutant peptides表1 β淀粉樣蛋白突變體肽的聚集特性及其影響

1.2 突變Aβ肽的聚集特性

A2T 突變是一種保護性的突變，能夠延遲Aβ肽的聚集［36］，顯著改變β 發(fā)夾的量并打破其轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌Y(jié)構(gòu)的平衡［7］，而A2V突變會加速Aβ肽的聚集，使其更快地演變?yōu)棣?折疊構(gòu)象［7，36］。H6R突變能在淀粉樣原纖維形成的延伸階段促進原纖維的形成［37］，H6R突變Aβ加快了聚集動力學(xué)，使得Aβ 的二級結(jié)構(gòu)更快地由無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)，并生成尺寸更大的寡聚體，這些寡聚體具有有效的成核能力。D7N 突變體能在淀粉樣原纖維形成的延伸階段促進原纖維的形成［37］，并且具有更高的成核效率［38］。E11K Aβ與野生型Aβ的聚集動力學(xué)、聚集體形態(tài)及細胞毒性未見明顯差異［39］。

A21G 突變可以增加Aβ 的分泌，并改變其結(jié)構(gòu)［40］，促進富含β 折疊的淀粉樣蛋白原纖維形成過程中各種二級結(jié)構(gòu)之間的相互轉(zhuǎn)化［41］。Betts等［17］的研究表明，A21G 突變降低了原纖維的延伸速率。E22?Aβ表現(xiàn)出增強的寡聚特性但沒有原纖維化的聚集特性［20］，Inayathullah 和Teplow［42］對E22Δ Aβ40和E22Δ Aβ42的研究結(jié)果闡明了這些突變體肽的構(gòu)象動力學(xué)、原纖維形成動力學(xué)、原纖維形態(tài)和原纖維穩(wěn)定性，表明兩種E22Δ Aβ肽均具有異常的β折疊形成傾向，能更快地形成寡聚體和原纖維，并且原纖維的穩(wěn)定性有所增加。此外，E22Δ Aβ42 低聚物似乎與野生型Aβ42 低聚物的大小、形狀均不同［43］。E22Δ Aβ40 具有成核能力，誘導(dǎo)野生型Aβ40 形成原纖維，這些原纖維比同源接種的Aβ40 原纖維的穩(wěn)定性差，但是，E22Δ Aβ 42 對野生型Aβ 具有很弱的成核能力［44?45］。E22G Aβ 形成原纖維的速率和數(shù)量都比野生型Aβ 高得多［22］。體外聚集實驗表明，野生型和E22K Aβ 均形成了以交叉β結(jié)構(gòu)為特征的原纖維，但具有明顯不同的β折疊結(jié)構(gòu)，與野生型原纖維的平行β折疊結(jié)構(gòu)相比，E22K Aβ42低聚物和原纖維均顯示出反向平行的β 折疊結(jié)構(gòu)［47］。分子動力學(xué)模擬研究表明，E22Q Aβ 比野生型Aβ 聚集更快［46］。D23N Aβ 40 形成原纖維的速度比野生型快得多，電子顯微鏡顯示，D23N Aβ40 形成具有多種形態(tài)的原纖維，并且大多數(shù)原纖維呈反平行β折疊結(jié)構(gòu)［48?49］。

2 Aβ修飾肽

根據(jù)淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，Aβ 的聚集在AD的發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。在FAD患者中，Aβ 的聚集是由遺傳突變引起的，但是大約90%的AD患者是散發(fā)性的，什么原因?qū)е铝松l(fā)性AD患者中Aβ 的聚集，目前還不明確。對老年斑組成的分析表明，聚集的Aβ 以不同的方式被修飾，主要是通過Aβ 的截短和后修飾，其中，截短肽包括從氨基酸殘基A2 和焦谷氨?；疎3、F4、R5、H6、焦谷氨酰化E11 開始的N 端截短肽，以及長度為16、24、34、37～43的C端截短肽。我們之前的研究總結(jié)了Aβ 截短肽的生理和病理特性［50］。Aβ 的修飾主要包括焦谷氨酸化、天冬氨酸異構(gòu)化、氧化、磷酸化、硝化、瓜氨酸化等。過多的修飾表現(xiàn)出致病特征，如聚集增加、神經(jīng)毒性增加、抑制海馬體長時程增強的能力等。表2 列出了不同Aβ 修飾肽的聚集特性及其影響。

2.1 Aβ修飾肽的產(chǎn)生與鑒定

從3 號或11 號谷氨酸開頭的N 端截短Aβ 肽容易發(fā)生焦谷氨酸化。從AD患者的神經(jīng)斑和腦血管壁中，純化并定量了以焦谷氨?；ˋβ pE3）形式從E3 殘基開始的Aβ 肽，N 端截短的Aβ pE3 占神經(jīng)斑塊中Aβ 的51%［51?52］。Sullivan 等［53］使用特異性抗體在老年癡呆癥大腦皮層的老年斑中識別到了Aβ pE3和Aβ pE11，并且Aβ pE11是最內(nèi)層核心的主要形式。蛋白質(zhì)或肽中天冬氨酸和天冬酰胺的異構(gòu)化通過在生理條件下經(jīng)由琥珀酰亞胺作為中間體的非酶促反應(yīng)產(chǎn)生L?異天冬氨酸。已經(jīng)在體內(nèi)多種胞內(nèi)蛋白以及神經(jīng)退行性腦組織中病理沉積的蛋白中鑒定出了異天冬氨酸［54?55］。在7 位或23 位異構(gòu)化的Aβ 肽差異性地沉積在AD 大腦的老年斑和血管淀粉樣蛋白中。氧化應(yīng)激和淀粉樣斑塊的形成是AD 的兩個關(guān)鍵標志。Aβ 中35 位的一部分甲硫氨酸（Met）在AD 大腦斑塊中被氧化成甲硫氨酸亞砜（Met（OX））。在AD 大腦中發(fā)現(xiàn)了磷酸化淀粉樣蛋白，使用反義肽方法，確定了人類細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK?1）負責(zé)Aβ 的磷酸化［56］。細胞外的Aβ在細胞表面和人腦的腦脊液中被蛋白激酶磷酸化。Kumar 等［57］開發(fā)了新的抗體來根據(jù)S26 的磷酸化狀態(tài)特異性區(qū)分Aβ 肽，利用新抗體，在神經(jīng)元內(nèi)和腦血管中發(fā)現(xiàn)大量的磷酸化Aβ。AD 的部分炎癥反應(yīng)是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶NOS 的上調(diào)，導(dǎo)致NO 產(chǎn)生增加，NO 通過誘導(dǎo)翻譯后蛋白質(zhì)修飾促進細胞信號傳導(dǎo)。在病理條件下，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧亞硝酸鹽和二氧化氮等副產(chǎn)物形成蛋白質(zhì)酪氨酸硝化作用。Aβ 是NO靶標之一，其在Y10 處被硝化［58］。瓜氨酸化和脫酰胺是衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在中性pH值下會增加Aβ 上的負電荷數(shù)量［59］。在AD 大腦所有已識別的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型中，乙酰化僅影響總修飾肽的約10%，但乙酰化的Aβ和tau聚集體水平增加最高［60］。Aβ 肽有兩個潛在的乙酰化位點，K16和K28。

2.2 Aβ修飾肽的聚集特性

含焦谷氨酰的肽比相應(yīng)的全長Aβ 肽更容易形成β折疊結(jié)構(gòu)，并且更穩(wěn)定，聚集傾向更高，誘導(dǎo)的細胞毒性更強［61?62］。體外實驗表明，23 位的異構(gòu)化修飾大大增強了Aβ的聚集。23位的自發(fā)異構(gòu)化誘導(dǎo)Aβ發(fā)生構(gòu)象變化形成β轉(zhuǎn)角，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在Aβ 肽的聚集和神經(jīng)毒性中起著至關(guān)重要的作用［63?64］。Met35側(cè)鏈氧化成Met35（OX）顯著阻礙了生理pH下Aβ42的原纖維形成的速率，減少了兩種主要形式的Aβ 產(chǎn)生的纖維總量，Met35（OX）還可以改變Aβ原纖維的形態(tài)并阻止原纖維的形成。甲硫氨酸氧化的Aβ40和Aβ42的纖維形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，纖維長度明顯減少［65］。也有研究顯示Met（OX）的存在減少了Aβ40 纖維形成的滯后時間，但延長了Aβ42 的滯后時間［66］。8 號絲氨酸殘基的磷酸化促進了寡聚Aβ 組裝體的形成［67］。Jamasbi 等［68］研究了磷酸化Aβ42 合成肽的二級結(jié)構(gòu)、聚集特性以及與初級皮層神經(jīng)元質(zhì)膜的相互作用，結(jié)果表明在合成脂質(zhì)環(huán)境中，磷酸化Aβ42 增加了β 折疊形成，能快速形成聚集體。Aβ 的硝化加速了其聚集，并在APP/PS1 小鼠和AD 大腦的Aβ 斑塊核心中檢測到硝化Aβ［58］。也有研究表明，酪氨酸硝化顯著降低了Aβ40的聚集［69］。這種積極作用可能是由于在生理pH 值下硝化引起帶負電荷的Y10 與E11 和H6 或H13 之間的鹽橋相互作用并阻斷Y10 周圍的扭結(jié)，從而防止Aβ 纖維化和聚集［70］。Osaki等［59］研究了瓜氨酸化和脫酰胺對Aβ纖維化特性的影響，結(jié)果表明Aβ40 的R5→Cit 修飾不影響原纖維化率，并形成與Aβ40 原纖維不同的β折疊結(jié)構(gòu)。Aβ40的N27→D修飾阻礙了原纖維化并誘導(dǎo)了反平行β 折疊聚集體的形成。具有R5→Cit修飾的Aβ42在水性介質(zhì)中的溶解度增加，其原纖維形成速度比Aβ42 慢，但沒有改變原纖維的平行β折疊結(jié)構(gòu)。帶有N27→D修飾的Aβ42部分形成了包含平行β折疊結(jié)構(gòu)的原纖維。K28的乙?；↘28Ac）減慢了Aβ42原纖維化速率但不影響原纖維形態(tài)。另一方面，K16 殘基的乙?；↘16Ac）大大降低了Aβ42 肽的原纖維化特性，也影響了其毒性［71］。

2.3 Aβ修飾肽的影響

Aβ pE3 的存在具有重要的結(jié)構(gòu)意義，因為它比其他形式的Aβ更具疏水性，因此增加了Aβ的不溶性。此外，Aβ pE3 的N 端受普通氨基肽酶作用的阻斷，可能導(dǎo)致Aβ 在AD 的神經(jīng)斑塊中大量積累。Aβ pE3的細胞毒性更強，AβpE3?42對Aβ42原纖維的形成具有抑制作用，與其已知的更大感染力相一致［72］。Youssef 等［73］進行的小鼠實驗表明，Aβ pE3?42 可以介導(dǎo)在臨床前AD 階段發(fā)生的神經(jīng)退行性過程和隨后的認知改變。Met35的氧化態(tài)會影響先前存在的淀粉樣蛋白原纖維和噬斑的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細絲、原纖維和成熟原纖維的形態(tài)發(fā)生變化［74］。與未氧化肽的神經(jīng)毒性相反，氧化的Aβ在皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)物中完全缺乏神經(jīng)毒性作用［75］，這可能是由于氧化態(tài)的Aβ 增強了甲硫氨酸亞砜還原酶A 型（MsrA）基因的表達和功能來減少活性氧ROS 的生成［76］。磷酸化的Aβ 肽顯示出增加的神經(jīng)毒性和降低的形成剛果紅陽性原纖維的能力［55］。在轉(zhuǎn)基因小鼠和AD 患者大腦中檢測到磷酸化Aβ，在果蠅模型中，磷酸化Aβ顯示出更高的毒性［67］。Aβ 的磷酸化可以在Aβ 代謝中發(fā)揮雙重作用，一方面它降低了其蛋白水解清除率，另一方面促進了其聚集［77］。細胞毒性實驗證實野生型Aβ 40比Aβ40Y10（3N）T更具細胞毒性［69］。對Aβ42的研究也表明Y10 的硝化可能會阻止Aβ42 的π?π堆積相互作用，從而抑制其聚集和神經(jīng)毒性［78］。Zhao 等［79］還研究了Aβ42 硝化與有毒Cu（II）的相互作用，結(jié)果表明盡管硝化沒有改變Aβ42與Cu（II）的結(jié)合或Aβ42?Cu（II）復(fù)合物的過氧化活性，但硝化改善了Cu（II）誘導(dǎo)的Aβ42 聚集和神經(jīng)毒性。與單獨的野生型或K28Ac肽聚集體相比，K16Ac 和雙乙?；↘KAc）肽聚集體顯示出更高的細胞毒性。然而，野生型和乙?；疉β42 肽聚集體的異質(zhì)混合物表現(xiàn)出更高的自由基形成和細胞毒性［71］。

3 Aβ變體的檢測

近年來，關(guān)于Aβ 的分析檢測方法研究取得了諸多進展，研究者從不同的角度對其進行了評述［80?82］。由于Aβ40 和Aβ42 是人體內(nèi)Aβ 的主要存在形式，目前建立發(fā)展的檢測分析方法主要針對單體狀態(tài)或聚集狀態(tài)下的Aβ40 和Aβ42，關(guān)于Aβ 變體的檢測方法報道的比較少。隨著人們對AD病理特征的深入研究，發(fā)現(xiàn)了越來越多的Aβ 變體起著重要作用，可作為AD 的生物標志物。針對這些Aβ 變體，開發(fā)出了一些分析檢測方法，包括常見的質(zhì)譜法、免疫學(xué)法和電化學(xué)法等。

3.1 質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法因其準確度和精密度而成為一種可靠的檢測Aβ 方式。由于Aβ 的疏水性、高分子質(zhì)量（>4 ku）和低豐度，使用傳統(tǒng)MS 方法（尤其是在血漿中）對Aβ 進行定量仍然是一個挑戰(zhàn)，因此，對Aβ 的質(zhì)譜分析通常與其他分析處理方法如免疫沉淀（IP）法、固相萃?。⊿PE）法、毛細管等電聚焦（CIEF）法等結(jié)合使用。

Domingo 等［83］開發(fā)了一種基于固相萃取和電噴霧電離液相色譜質(zhì)譜（ESI?LC?MS）的無抗體方法，用于在人腦脊液（hCSF）中同時鑒定和定量19 種Aβ 亞型（Aβ1?42、1?40、1?38 和16 種Aβ N端截短和翻譯后修飾形式（包括焦谷氨酸形式）的肽。Portelius 等［84］描述了一種方法，它采用免疫沉淀結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜來確定腦脊液中C 端截短的Aβ 肽的模式，使用與磁珠偶聯(lián)的抗體，在腦脊液中檢測到18個C端和2個N 端截短的Aβ 肽，其中3 個最強的峰對應(yīng)于Aβ1?40、Aβ1?17 和Aβ1?38。Murayama 等［85］生成了一種新的單克隆抗體，該抗體對Aβ5?40/42 的N端具有特異性。蛋白質(zhì)印跡證實該抗體識別Aβ5?40 但不識別Aβ1?40。用抗體進行免疫沉淀，然后進行質(zhì)譜分析，進一步檢測到來自表達半胱天冬酶切割的APP 的神經(jīng)母細胞瘤細胞的條件培養(yǎng)基中的Aβ5?40。Kaneko 等［86］通過串聯(lián)質(zhì)譜法（基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜）對人血漿中進行鑒定，檢測到22 種Aβ 相關(guān)肽，開發(fā)了Aβ相關(guān)肽的定量分析，并證明了血漿稀釋線性和定量所需的精確度。Hau?mann 等［87］提出了一種通過毛細管等電聚焦免疫測定、分離和檢測Aβ N 端截短肽的新方法。CIEF 免疫測定和免疫沉淀質(zhì)譜分析確定，從殘基R5 開始的肽是在細胞培養(yǎng)模型中存在BACE1 抑制劑的情況下產(chǎn)生的主要氨基末端Aβ變體。Pannee等［88］開發(fā)了一種基于免疫沉淀的方法，用于從人血漿中富集Aβ 肽。使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間/飛行時間質(zhì)譜法分析肽段以進行Aβ 分析和選擇反應(yīng)監(jiān)測，進行Aβ1?38、Aβ1?40 和Aβ1?42 的MS 定量。在Sargaeva［89］的研究中，電子捕獲解離（ECD）傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR MS）被應(yīng)用于檢測Aβ 肽中的天冬氨酸的異構(gòu)化.

3.2 免疫學(xué)方法

基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫檢測方法是定性、定量分析Aβ 肽的最常用、可靠和靈敏的方法之一。酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法、免疫組織化學(xué)法、免疫熒光標記、免疫染色法也常用來鑒別和檢測Aβ變體。

針對不同的Aβ 變體，人們獲得了不同的抗體（表3）。Caillava 等［90］獲得了針對人Aβ34 C 端最后14 個氨基酸的兔多克隆抗體（稱為α34）。蛋白質(zhì)印跡實驗表明，α34 血清的整個純化IgG 片段僅識別Aβ34，而不識別其全長對應(yīng)物Aβ40。ELISA證實了α34 對Aβ34 的特異性，并且具有高靈敏度（檢測下限約為1μg/L）。Sullivan等［91］生成了兩種針對Aβ pE物種的多克隆抗體，并使用它們來觀察人淀粉樣斑塊的Aβ pE譜。通過蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)對這些抗體的評估表明，它們在低濃度下（5μg/L）與靶標特異性結(jié)合。Albertini等［92］設(shè)計了一種免疫蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法，該檢測在預(yù)活化表面的芯片陣列上使用單克隆抗體混合物（6E10+4G8），然后使用表面增強激光解吸電離?飛行時間質(zhì)譜（SELDI?TOF MS）分析檢測到15 個Aβ亞型。Acero等［93］生成并表征了一種抗Aβ pE3小鼠單克隆抗體（3B8），可識別AD患者腦組織和3xTg?AD 轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的淀粉樣蛋白聚集體。針對不同Aβ 片段的ELISA分析結(jié)果表明，無論焦谷氨酸修飾如何，都可以識別AβpE3 和Aβ3?42中存在的兩個構(gòu)象表位。在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，Aβ4?x 先于Aβ pE（3?x）在神經(jīng)元內(nèi)積累。新型Aβ4?x免疫反應(yīng)性抗體NT4X?167［94］可以檢測到來自截短Aβ 物種的高分子質(zhì)量聚集體，并且與其他常見神經(jīng)退行性疾病典型的聚集體沒有交叉反應(yīng)。Liu 等［95］使用與辣根過氧化物酶連接的抗體（P82，M11），利用ELISA在血管淀粉樣沉積物中檢測到未修飾的游離Aβ11?40和焦谷氨酸修飾的Aβ11?40。Mehta 等［96］生成和部分表征了針對AβpE3 的兔單克隆抗體（Rab mAb），發(fā)現(xiàn)生成的Rab mAb 對AβpE3 具有特異性，因為它與Aβ16、Aβ40、Aβ42、Aβ3?11 和Aβ pE（11?17）在ELISA中沒有反應(yīng)性。在蛋白質(zhì)印跡中，AβpE3的最佳檢測條件是抗體濃度為0.5 mg/L，該抗體的靈敏度足以在夾心ELISA 中檢測10 ng/L 的AβpE3。Mohamadi 等［97］提出了一種用于檢測Aβ 肽的集成微流控芯片，該設(shè)備利用免疫捕獲和微芯片電泳分析不同截短的Aβ 肽（1?37、1?39、1?40 和1?42），并且能夠檢測低至25 ng的加在未稀釋的腦脊液中的合成Aβ 肽。Klafki 等［98］對針對Aβ（?3?x）N 端的兩種抗體進行了表征，開發(fā)了用于測量Aβ（?3?40）的夾心免疫測定方法，并通過毛細管等電聚焦免疫測定、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)評估了抗體選擇性。兩種單克隆抗體都檢測到Aβ（?3?40），與Aβ1?40或N端截短的Aβ變體沒有明顯的交叉反應(yīng)。免疫測定對Aβ（?3?40）顯示出高選擇性，定量測定范圍為22 ng/L～7.5μg/L。除了針對Aβ截短肽的抗體外，研究者還開發(fā)了針對Aβ 修飾肽的抗體，如針對磷酸化的S8（pS8 Aβ）的特異性抗體1E4E11［99］，針對磷酸化的S26（pS26 Aβ）的單克隆抗體5H11C10［100］，針對硝化的Y10（3NTyr10Aβ）的3NTyr10Aβ 抗血清［101］，針對焦谷氨酸化的E3（pE3Aβ）的抗體337.48及針對異天冬氨酸化的IsoD?Aβ的抗體22C8［102］。

3.3 電化學(xué)法

電化學(xué)方法通常采用生物傳感器將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭啥康奈锢?化學(xué)信號，由于其高效性、成本低、高特異性和快速性，成為目前最廣泛使用的技術(shù)之一?；诶野彼峄蚪z氨酸的磷酸化和酪氨酸的硝化對肽分子電化學(xué)活性的影響，Suprun等［103］在碳絲網(wǎng)印刷電極上記錄了帶有未修飾殘基、O?磷酸化Y10 或S8、3?硝化Y10 的Aβ16 的氧化和還原的方波伏安圖，結(jié)果表明這些氨基酸殘基的磷酸化和硝化都顯著改變了Aβ16 肽的電化學(xué)行為，利用電化學(xué)方法可以直接檢測Aβ 中的翻譯后修飾。Lu 等［104］通過TiO2納米刷（TiO2NB）基于溶液的水熱生長來構(gòu)建光電化學(xué)（PEC）傳感器用于檢測Aβ1?28，表現(xiàn)出極大靈敏度，檢測限為26.3μg/L，促進了一種簡單、無標記、快速、靈敏和無創(chuàng)的方法，以克服用于AD 診斷的常規(guī)技術(shù)的局限性。表面修飾、蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)作為新興的生物納米技術(shù)平臺，為構(gòu)建生物傳感器提供了強大的工具［105］，基于該平臺的電化學(xué)檢測方法將為Aβ 變體的檢測提供更多的可能。

4 結(jié)論與展望

位于Aβ序列內(nèi)的FAD突變似乎具有不同的生化特性和病理效應(yīng)，并導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)和發(fā)展。除了A2T 是一種保護性突變外，其他大多數(shù)突變會增加向寡聚體或原纖維的聚集率，更具神經(jīng)毒性和病理性。FAD點突變會改變Aβ肽的聚集動力學(xué)，形成形態(tài)、構(gòu)象上不同的淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)，這可能解釋了與Aβ突變相關(guān)的疾病表型的異質(zhì)性。

除了FAD 中存在的Aβ 突變體外，散發(fā)性AD中還有大量的其他Aβ 種類，有些是在APP 加工過程中產(chǎn)生的，有些是經(jīng)過翻譯后修飾產(chǎn)生的，或者是在某些細胞或細胞外區(qū)室中發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生的。Aβ的特定區(qū)域顯然對其生理特性有不同的貢獻，如Aβ的N端區(qū)域及某些氨基酸是翻譯后修飾的熱點。Aβ 后修飾是一個廣闊的但并未深入研究的領(lǐng)域，有可能對理解AD的發(fā)病機制做出重大貢獻。酶切和修飾過程導(dǎo)致致病性Aβ 種類的形成，其水平可能隨著年齡增加而增加，并和遺傳因素相關(guān)。這些Aβ 的酶切和修飾可能是散發(fā)性AD的主要貢獻者，靶向這些肽或相關(guān)的酶可以作為一種新的治療機制或提供一種新的診斷方法。目前已經(jīng)成功開發(fā)了多種檢測Aβ 變體的方法，但沒有一個黃金標準，為了實現(xiàn)對Aβ及Aβ變體的臨床檢測，還需要做大量的工作來開發(fā)簡單、可靠、準確和便宜的技術(shù)。這些方法與用于生物傳感的新納米材料或探針的進一步整合將有助于獲得高靈敏度和高選擇性的Aβ 檢測。對全長Aβ 的檢測不足以獲得關(guān)于AD 進展的明確診斷結(jié)論，通過高通量分析可以方便地對不同標志物進行多重檢測。隨著對AD發(fā)病機理的深入認識和納米技術(shù)、設(shè)備制造方法的進步，應(yīng)該會找到一種早期診斷AD的方法。