張可玟 胡 泓 陳 剛

（1）中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，青島 266100；2）中國海洋大學海洋生命科學學院，青島 266003）

消毒劑是一類可用于物體表面以及空氣、水等傳播介質(zhì)中抑制或殺死微生物的化學物質(zhì)，科學合理使用消毒劑能有效切斷病原微生物傳播途徑［1］。消毒劑不僅應(yīng)用在醫(yī)療、衛(wèi)生防疫方面［2?3］，同時也廣泛應(yīng)用于食品加工［4?5］、水處理［6］、環(huán)境［7］、工業(yè)［8］、農(nóng)牧漁業(yè)［9?10］等各行業(yè)，在維護公共衛(wèi)生、保障食品安全、保護生態(tài)健康等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近來，嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 引起的全球新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）疫情大流行［2］，消毒劑的使用量激增，消毒劑使用不規(guī)范的現(xiàn)象頻發(fā)［11］。雖然目前有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與微生物對抗生素的抗性類似，長期不合理使用消毒劑，也會造成微生物對消毒劑產(chǎn)生抗性［12?13］，但抗性基因這種新型基因污染物的產(chǎn)生機制和傳播風險仍亟待闡釋和解決。本文對微生物消毒劑抗性機制、抗性基因的產(chǎn)生及傳播等相關(guān)研究進行了闡述和歸納，為進一步研究提供參考。

1 消毒劑種類

根據(jù)消毒劑的化學成分，常用的消毒劑主要可分為以下幾大類，即含氯消毒劑、過氧化物類消毒劑、醛類消毒劑、醇類消毒劑、酚類消毒劑、含碘消毒劑、環(huán)氧乙烷、雙胍類消毒劑、季銨鹽類消毒劑、重金屬鹽類消毒劑等。消毒劑的作用機制包括多種物理作用和化學反應(yīng)，不同消毒劑有不同的使用范圍。常見的消毒劑種類、具體舉例、作用機制和主要應(yīng)用詳見表1。

Table 1 Types，action mechanism and main applications of disinfectants［2，14］表1 消毒劑的種類及其作用機制和主要應(yīng)用［2，14］

根據(jù)殺菌水平，消毒劑可分為高效消毒劑、中效消毒劑和低效消毒劑，對不同微生物的殺滅作用也有差異［14］。例如次氯酸鹽和酒精是針對COVID?19 防控的常用高效消毒劑，而氯己定、苯扎氯銨對冠狀病毒殺滅效果較差［15］。消毒劑的消毒效果與有效成分相關(guān)，另外pH、溫度、鹽度、有機物等環(huán)境條件都會影響消毒劑的使用效果［16］。使用消毒劑時，應(yīng)根據(jù)消毒劑種類合理選擇使用方式，根據(jù)清潔和污染程度配制有效成分濃度、控制消毒作用時間［14］。

2 微生物對消毒劑的抗性機制

微生物對消毒劑的抗性是指微生物個體或種群，在標準化的定量殺滅試驗中，表現(xiàn)出比標準試驗菌株和群體明顯更低的微生物減少量［17］。一般可采用最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定、定性懸液試驗、定量懸液試驗和載體試驗等方法評價消毒劑的殺菌效果［18］。如果清潔方式不規(guī)范、濃度或劑量不足、處理時間不夠或長期使用一種消毒劑，會給微生物創(chuàng)造良好的適應(yīng)條件［19］。另外，消毒劑由于長期或過量使用，經(jīng)稀釋殘留進入環(huán)境，可能對環(huán)境微生物生態(tài)多樣性產(chǎn)生影響。微生物會通過表型適應(yīng)、基因突變和水平基因轉(zhuǎn)移等方式提高對消毒劑的耐受性或產(chǎn)生抗性基因。例如，Kampf［20］發(fā)現(xiàn)在低濃度苯扎氯銨暴露下，多種微生物適應(yīng)后MIC值增加4 倍，鼠傷寒沙門氏菌達3 000 mg/L、銅綠假單胞菌達2 500 mg/L、腸桿菌屬達1 500 mg/L、大腸桿菌屬達1 000 mg/L，并且這種抗性能夠穩(wěn)定遺傳［20］。一些消毒劑的副產(chǎn)物也會誘導微生物產(chǎn)生抗性，比如具有誘變活性的二溴乙酸、二氯乙腈、溴酸鉀和3?氯?4?（二氯甲基）?5?羥基?2（5H）?呋喃酮（MX）等典型消毒副產(chǎn)物可誘導抗生素抗性，甚至產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象［6］。

根據(jù)目前研究，微生物消毒劑抗性機制基本可分為形成生物膜、降低細胞膜通透性、借助外排泵系統(tǒng)、產(chǎn)生相關(guān)特異性酶、改變靶點等幾種策略（圖1）。在一定環(huán)境和選擇壓力下，消毒劑抗性微生物的抗性基因可通過垂直和水平轉(zhuǎn)移迅速傳播，一方面會降低消毒劑的消毒效率；另一方面，這種基因污染物可能對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴重威脅。在實際環(huán)境中，微生物可能會利用多種策略抵抗消毒劑作用。

Fig.1 The schematic diagram of disinfectant resistance mechanism圖1 消毒劑抗性機理示意圖

2.1 形成生物膜

微生物可通過生物膜的形成產(chǎn)生消毒劑抗性。生物膜是微生物及其分泌物積累形成的聚集體，主要由多糖包被分泌物和胞外聚合物組成。生物膜最早發(fā)現(xiàn)于17世紀，Van Leeuwenhoek通過改進的顯微鏡觀察到牙齒上的菌斑，而相關(guān)理論直到1978年才發(fā)展起來［21］。生物膜是相關(guān)細胞群落被封閉在含有開放通道的聚合物基質(zhì)中形成的復雜表面，細胞通常不可逆轉(zhuǎn)地附著在載體界面或彼此之間，嵌在胞外高分子物質(zhì)基質(zhì)中，其生長速度和基因轉(zhuǎn)錄等方面可以隨生物膜外部環(huán)境改變而有相應(yīng)的變化［21］。

消毒劑處理可刺激某些微生物形成生物膜。單核細胞增生李斯特菌在過氧乙酸處理后，容易形成靜態(tài)和連續(xù)流動生物膜，并對氯苯扎和過氧乙酸消毒劑的抗性增高，分析發(fā)現(xiàn)消毒劑處理促使與形成生物膜和抗性相關(guān)的熱激響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子hrcA和分子伴侶dnaK表達增加［22］。在對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的研究中，經(jīng)乙醇和異丙醇消毒劑處理時比未經(jīng)處理的對照組呈現(xiàn)出更高的生物膜水平，且消毒劑濃度越高，生物膜的形成率越高［23］。另一研究用乙醇處理金黃色葡萄球菌后，與生物膜形成相關(guān)的基因icaA和icaD轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，這些基因的表達有助于細胞間多糖黏附素生成而形成生物膜，同時分析還發(fā)現(xiàn)一些與抗生素抗性相關(guān)的基因表達也增高了［24］。

研究表明，生物膜強弱與抗性高低呈正相關(guān)。含氯消毒劑常用于水處理工藝，反滲透膜中的嗜酸桿菌、沙單胞菌和假單胞菌等耐氯細菌能通過建立穩(wěn)定的生物膜抵抗氯氣的威脅，導致含氯消毒劑處理的反滲透膜生物污染加重，進一步通過宏基因組學關(guān)聯(lián)分析顯示，消毒劑抗性與生物膜菌群的群體感應(yīng)基因、胞外多糖合成基因和氨基酸合成基因表達高度關(guān)聯(lián)［25］。Ribic等［8］在對常規(guī)消毒處理的超凈間內(nèi)微生物進行生物膜、消毒劑抗性及相關(guān)基因的調(diào)查中，采用實時定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，95%的葡萄球菌具有生物膜相關(guān)基因icaA、aap、bhp，它們是對季銨鹽消毒劑產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ)；而剛果紅瓊脂法檢測出40%的菌株形成生物膜，結(jié)晶紫染色法確定16%的菌株形成強生物膜。分析表明，形成強生物膜有助于菌株增加對氯化雙癸基二甲基銨（DDAC）的抗性。

形成生物膜能顯著提高微生物消毒劑抗性。首先，生物膜的胞外多糖和蛋白質(zhì)等聚合基質(zhì)結(jié)構(gòu)可形成阻力，延遲消毒劑等物質(zhì)的生物膜基質(zhì)滲透。與游離細胞相比，生物膜降低了消毒劑對黏附在載體上的大腸桿菌的可及性［26］，對消毒劑的敏感性降至游離細胞的1%～4%而表現(xiàn)出抗性的提高［27?29］。生物膜的結(jié)構(gòu)成分可以與一些消毒劑發(fā)生反應(yīng)或催化氧化還原過程，使消毒劑部分消耗，一些氧化類消毒劑的功效會受多糖、蛋白質(zhì)和核酸等生物膜基質(zhì)成分影響而降低殺菌效果［30?31］。

另外，有些微生物可通過降低生物膜內(nèi)細胞生長速度的策略來抵抗消毒劑的作用而增加抗性。生物膜內(nèi)細胞的生長速度明顯慢于游離微生物細胞，這種較低的代謝水平使一些消毒劑難以發(fā)揮作用［21］。Legner等［32］利用恒化器模型測定生物膜生長速率，發(fā)現(xiàn)生物膜的形成越強，微生物生長速度越慢，消毒劑的吸收率與滅活率也越低。另一項研究也發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞在生物膜中生長緩慢，同時表現(xiàn)出對頭孢三胺的高抗性［33］。

此外，生物膜中的革蘭氏陰性菌可通過合成調(diào)節(jié)因子對環(huán)境壓力作出反應(yīng)。惡臭假單胞菌的胞外功能σ 因子ECF?10 有助于生物膜形成和藥物外排［34］，新月柄桿菌的胞外功能σ 因子σF 調(diào)控重金屬的應(yīng)激反應(yīng)［35］，銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌可誘導磷酸鹽降解、脂質(zhì)生物合成和多胺生物合成的調(diào)節(jié)因子，有助于提高生物膜的抵抗力和恢復力，產(chǎn)生對戊二醛的抗性［36］。

一些研究發(fā)現(xiàn)，某些種類的病原性微生物能耐受一定劑量的消毒劑而存活，且傳染性和致病性提高，可能是長期低水平的消毒處理與微生物的生物膜產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)［19］。一方面，生物膜的細胞和胞外聚合物是一個復雜而緊湊的多層結(jié)構(gòu)，一系列物理化學作用會引發(fā)運輸限制，使消毒劑很難穿透并到達內(nèi)層，進而影響消毒功效［37］；而另一方面，病原性微生物生物膜的形成，可能更利于病原菌分泌內(nèi)毒素、分散至宿主體內(nèi)、增強對宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力，這種消毒劑刺激促進生物膜的形成為病原菌提供侵染所需的生態(tài)位，可能導致其更易引發(fā)疾病，應(yīng)該引起關(guān)注［21］。

2.2 降低細胞膜通透性

細胞膜是限制物質(zhì)進入細胞的屏障，一些微生物可通過降低細胞膜通透性的策略，減少或阻止消毒劑進入微生物細胞內(nèi)，提高對消毒劑的抗性。該類微生物的消毒劑抗性主要取決于細胞外膜［38?39］。具有選擇透過性的以磷脂雙分子層為骨架的細胞膜結(jié)構(gòu)組分中，蛋白質(zhì)、磷脂、脂多糖及脂肪酸的結(jié)構(gòu)和組成改變都可能改變細胞膜通透性，進而會影響消毒劑的殺菌效果［16］。

膜蛋白在參與維持細胞膜完整性和選擇透過性方面起到重要作用。在消毒劑作用下，其變化可促進微生物存活并增強消毒劑耐受性［38，40］。一方面，增加與細胞膜穩(wěn)定性和完整性相關(guān)的膜蛋白、脂蛋白、結(jié)合蛋白等可減少消毒劑的破壞。在戊二醛誘導下，熒光假單胞菌secA、secB、secE、secG、secY、yaiC、yidC、lspA等基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，Sec 易位酶的增加有利于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)穩(wěn)定運轉(zhuǎn)；groEL/groES和dnaK的提高可增加伴侶蛋白GroES/GroEL表達，確保蛋白質(zhì)適當折疊來維持細胞膜穩(wěn)定性；編碼Tol?Pal 系統(tǒng)的folQ、tolA上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平，維持細胞外膜完整性，從而保障細胞膜的選擇透過性，阻止消毒劑進入［41］。在含氯消毒劑作用下，結(jié)合細菌形態(tài)、細胞膜破壞、細胞疏水性等分析發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌細胞膜損傷較輕、膜蛋白疏水性較高，從而產(chǎn)生耐氯性［42］。另一方面，一些膜蛋白功能的缺陷可以降低微生物對消毒劑的敏感性。長期消毒可能導致恥垢分枝桿菌和龜分枝桿菌Msp孔蛋白活性缺陷，對戊二醛和鄰苯二甲醛的敏感性降低［43?44］。Chiu 等［45?46］發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌Imp/OstA蛋白的破壞會降低細胞膜通透性，使其對有機消毒劑的敏感性下降。Machado 等［38］采用蛋白質(zhì)組學方法研究銅綠假單胞菌對苯扎溴銨氯化物的適應(yīng)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)抗性作用源于孔蛋白OprF和OprG、脂蛋白OprL 和OprI的表達減少，無法正常維持細胞形狀和細胞膜流動性，這種功能缺陷會減少細胞與外界物質(zhì)交換的通道，可能同時存在適應(yīng)性和獲得性兩種抗性。

磷脂、脂多糖等結(jié)構(gòu)和組成也可降低細胞膜通透性，阻擋消毒劑入侵。疏水性消毒劑可由外膜蛋白清除，而親水性消毒劑可通過膜孔蛋白擴散方式進入微生物細胞膜，但會被脂多糖和磷脂層截留，尤其不易侵入外膜具有不對稱脂多糖結(jié)構(gòu)的革蘭氏陰性菌［1］。此外，在鼠傷寒桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，內(nèi)膜蛋白YejM 依賴鎂離子而具有磷酸酶活性，可以調(diào)節(jié)外膜中甘油磷脂（PL）和脂多糖（LPS）的平衡，從而改變外膜通透性來抵抗消毒劑［47］。

2.3 外排泵系統(tǒng)

與限制消毒劑進入細胞不同，一些抗性微生物面對消毒劑的威脅時，通過外排泵外排策略快速、有效地減少細胞內(nèi)的消毒劑劑量，從而實現(xiàn)抗性［48］。外排泵是存在于微生物細胞膜上的一類蛋白質(zhì)，可分為多個膜蛋白家族，包括主要促進因子超家族（MFS）、多藥及有毒化合物排出家族（MATE）、小多藥耐藥家族（SMR）、以質(zhì)子動力為轉(zhuǎn)運底物的抗性?結(jié)瘤?細胞分裂超家族（RND）和利用ATP 結(jié)合能和水解來運輸?shù)孜锏腁TP 結(jié)合盒超家族（ABC）［49］。研究腸桿菌選擇性TolC 非依賴外排泵時，還發(fā)現(xiàn)陽離子擴散促進因子家族（CDF）和蛋白質(zhì)細菌抗菌復合外流家族（PACE）［50］。外排泵系統(tǒng)的類型十分復雜，表2 列舉了不同家族的結(jié)構(gòu)特征和具體種類。

Table 2 Characteristics and types of efflux pump system family［49-53］表2 外排泵系統(tǒng)家族特征及種類［49-53］

外排泵通常由多個系統(tǒng)協(xié)同工作，其過度表達可以單獨或與其他抗性機制共同作用抵抗消毒劑，避免損傷［1］。根據(jù)底物特異性和DNA序列同源性，依賴于質(zhì)子動力的轉(zhuǎn)運蛋白分為qacA/B和qacC編碼的兩個家族［54］。常規(guī)消毒條件下，一些工業(yè)潔凈室的表面葡萄球菌具有對二癸基二甲基氯化銨的耐藥性，其中超過95%檢測出同時具有qacA/B和qacC［8］。對于單獨或組合攜帶norA、qacA和qacC的金黃色葡萄球菌菌株，研究發(fā)現(xiàn)攜帶多個外排泵的菌株抗性更強，預先暴露于苯扎氯銨的菌株會對氯己定有更高的耐受性［55］。

隨著研究深入，確定的外排泵相關(guān)基因也逐漸完善，基因檢測等分子手段常用于抗性機制的研究。Moretro 等［4］發(fā)現(xiàn)，qacH和bcrABC賦予單核細胞增生李斯特菌對季銨鹽消毒劑的抗性，是編碼外排泵系統(tǒng)的決定因子。Meier 等［56］在瑞士和芬蘭的大多數(shù)苯扎氯銨抗性單核細胞增生李斯特菌中檢測到qacH，部分檢測到bcrABC。Labreck 等［55］通過對抗性金黃色葡萄球菌的轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)暴露于苯扎氯銨可以顯著誘導qacA和norA的表達，從而增加氯己定耐受性。Hassan等［52］發(fā)現(xiàn)編碼外排系統(tǒng)相關(guān)蛋白AceI的基因可有效誘導鮑曼不動桿菌對氯己定的抗性，采用基因合成方法進行密碼子優(yōu)化，克隆至大腸桿菌的表達系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)包括AceI及其同系物在內(nèi)的24 個BTP 結(jié)構(gòu)域蛋白中，有87.5%用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測到表達，75%促成了大腸桿菌對一種或多種抗菌藥物的抗性。

利血平等外排泵抑制劑可以抑制耐藥細菌對藥物的外排，從而恢復其對抗生素的敏感性，可以用來確定抗性機制。Jiang等［5］研究零售食品中單核細胞增生菌由外排泵介導的對苯扎氯銨的抗性時，用利血平發(fā)現(xiàn)存在質(zhì)粒基因bcrABC介導和染色體介導的外排泵。Meier 等［56］針對14 株缺乏已知抗性基因的單核細胞增生李斯特菌，加入利血平分析細菌抗性，確定了其中10 株的耐藥性部分或完全依賴外排泵。

2.4 抗性相關(guān)特異性酶

微生物面對消毒劑的威脅，可通過特異性酶的作用減輕或消除傷害。一方面可能產(chǎn)生針對消毒劑的特異性降解酶，將消毒劑清除；另一方面可能產(chǎn)生具有特定功能的酶，調(diào)節(jié)自身，增強對消毒劑的耐受性。一些分子伴侶、調(diào)節(jié)蛋白、輔酶因子等也在其中起到重要作用。

一些種類的消毒劑具有強氧化性，可直接或間接通過活性氧或自由基破壞微生物細胞膜脂系統(tǒng)，使蛋白質(zhì)和核酸變性來殺死細胞，而微生物細胞的氧化還原系統(tǒng)可產(chǎn)生與之對抗的特異性酶而產(chǎn)生抗性。比如，在含氯消毒劑作用下，銅綠假單胞菌編碼烷基氫過氧化物酶AhpD 的rcsA高度表達［57］，假單胞菌的抗氧化酶、β 內(nèi)酰胺酶表達顯著上調(diào)［7］，分枝桿菌的超氧化物歧化酶（SOD）活性提高［42］，引發(fā)的代謝變化有利于降解次氯酸鹽消毒劑。對過氧化氫的抗性與過氧化氫酶?過氧化物酶有關(guān)，這種酶同時具有過氧化物酶活性和過氧化氫酶活性，能夠用外部還原劑還原過氧化氫或使其歧化為水和氧，其中KatG 在中性溶液中具有高催化活性［58］。低濃度過氧化氫處理釀酒酵母可促進過氧化氫酶活性的增加［59］，銅綠假單胞菌生物膜對氧化劑的抗性也與細胞外基質(zhì)中的過氧化氫酶等保護酶有關(guān)［26］，調(diào)節(jié)蛋白Yap1在此應(yīng)激效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［60］。Seaver等［61］通過測定總過氧化氫酶活性、過氧化氫酶活性和β?半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶突變體具有快速清除過氧化氫的能力，進一步分析發(fā)現(xiàn)保護作用是由烷基過氧化氫還原酶Ahp提供的。

還有一些特異性降解酶或轉(zhuǎn)化酶可增加微生物對多種消毒劑的抗性。比如，甲醛脫氫酶可催化醛的歧化反應(yīng)，大多依賴谷胱甘肽和輔酶發(fā)揮降解作用，可以協(xié)助惡臭假單胞菌降解甲醛、乙醛、丙醛等醛類消毒劑［62］。有機汞裂解酶基因merB和汞離子還原酶基因merA由質(zhì)粒/轉(zhuǎn)座子介導，可編碼降解無機和有機汞化合物的水解酶和還原酶，其過度表達可使微生物產(chǎn)生汞抗性［63］。依賴fad的十四烷基三甲基銨單加氧酶（TTABMO）能夠通過生理途徑氧化季銨鹽化合物，催化十四烷基三甲基溴化銨的分解，從而增加惡臭假單胞菌（ATCC 12633）對季銨鹽類消毒劑的抗性［64］。

此外，一些微生物會產(chǎn)生特異性酶改變自身特性，間接抵抗消毒劑入侵。一些革蘭氏陰性桿菌的特異性磷酸酶YejM 具有依賴于鎂離子和活性位點完整性的磷酸酶活性，可以調(diào)節(jié)外膜的物質(zhì)組成來誘導抗性［47］。熒光假單胞菌在戊二醛刺激下，可提高蛋白酶ClpB1、HslU的合成，保證受損蛋白質(zhì)的去除，而且菌株能量生產(chǎn)系統(tǒng)會加強，氧化磷酸化相關(guān)的NADH/泛醌氧化還原酶、琥珀酸/泛醌氧化還原酶、泛醌/鐵細胞色素c 氧化還原酶、氧/鐵細胞色素c氧化還原酶和ATP合成酶上調(diào)，三羧酸（TCA）循環(huán)相關(guān)的丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸脫氫酶、琥珀酰輔酶A連接酶、琥珀酸脫氫酶、富馬酸脫氫酶和鐵氧還蛋白也上調(diào)，能夠增加ATP生成，保障能量供給，增強抵抗消毒劑的能力［41］。

2.5 改變消毒劑作用靶點

微生物可以通過在結(jié)合位點或結(jié)合位點附近進行突變或酶修飾，使靶點發(fā)生物理改變，從而減少與消毒劑的結(jié)合。一般來說，消毒劑比抗生素具有更廣泛的活性，因為抗生素在細胞內(nèi)往往具有特定靶點，而消毒劑通常具有多個靶點［5，17］。因此，改變靶點的抗性機制通常存在于抗生素抗性機制中，在消毒劑的抗性機制中則較為少見。

三氯生是一種能夠緩慢、可逆、緊密結(jié)合大腸桿菌fabI的抑制劑。Sivaraman等［65］研究發(fā)現(xiàn)，由fab編碼的對三氯生的抗性屬于靶點變更，通過誘發(fā)突變和氫鍵檢測等手段，確定三氯生對突變體G93V、M159T 和F203L 的親和力顯著降低。Skovgaard 等［66］用DNA 序列分析驗證了此機制，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)菌株攜帶編碼烯醇?；d體蛋白還原酶亞型fabI的突變基因，可以增加三氯生的靶點fabI表達，減少三氯生?NAD+?fabI三元復合物的產(chǎn)生。

3 消毒劑抗性相關(guān)基因的獲得與傳播風險

抗性微生物及抗性基因的產(chǎn)生和傳播給環(huán)境保護、種養(yǎng)殖業(yè)、食品安全、衛(wèi)生防疫以及醫(yī)院抗感染治療帶來巨大的困難和挑戰(zhàn)。微生物的消毒劑抗性可分為固有抗性和獲得抗性（acquired resistance），其中獲得抗性包括自身突變和外源獲得兩種途徑。

微生物在自然生長及傳代過程中會不斷發(fā)生各種基因突變，在理化因素作用下可能更容易發(fā)生突變，但這些自發(fā)和誘變產(chǎn)生消毒劑抗性的頻率很低。研究發(fā)現(xiàn)，低于致死濃度的消毒劑或其消毒副產(chǎn)物可能誘導抗性基因的產(chǎn)生，并使獲得抗性相關(guān)基因的微生物得以富集。例如，三氯生可誘發(fā)大腸桿菌產(chǎn)生多種抗性響應(yīng)策略，氧化應(yīng)激可導致fabI、frdD、marR、acrR和soxR等抗性相關(guān)基因的突變［67］。當銅綠假單胞菌暴露于亞致死濃度的過氧乙酸時，可誘導產(chǎn)生細胞保護過程的相關(guān)基因而產(chǎn)生抗性［68］。金黃色葡萄球菌抗性菌株產(chǎn)生norA、norB、norC、mepA、mdeA、qacA/B等外排泵基因并過量表達［69］。Ortiz 等［70］用微生物全基因組測序（WGS）和電子多位點序列分型分析（MLST）確定了單核細胞增生菌的兩個主要抗性類型是prfA突變株S1（ST 31 型）及含抗性轉(zhuǎn)座子Tn6188 的菌株（ST 121型）。

微生物消毒劑性抗基因的獲得和轉(zhuǎn)移可由染色體介導，也可由質(zhì)粒介導。一般來說，染色體介導的抗性基因主要通過傳代過程垂直傳播或者同種間傳播，而質(zhì)粒介導的抗性更容易引發(fā)抗性基因在不同種屬間的水平轉(zhuǎn)移而增加抗性及抗性基因的傳播風險（圖2）。

3.1 染色體介導的消毒劑抗性

微生物染色體基因突變，以及染色體的缺失、插入和取代等染色體變異，都可能使微生物產(chǎn)生對消毒劑的抗性。在季銨鹽類消毒劑的壓力或誘導下，染色體編碼的基因突變可能會觸發(fā)控制外排泵表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)、導致外排泵過度表達、提高泵的外排效率等，使適應(yīng)微生物對季銨鹽類消毒劑和外排泵其他底物的耐受性增加2～8 倍［71］?；钚匝酰≧OS）介導的marR、rob、sdiA、cytR和crp的染色體突變等抗性關(guān)鍵決定因素，會導致編碼AcrAB?TolC 泵等多藥流出泵系統(tǒng)的基因調(diào)控發(fā)生變化，可能提高大腸桿菌對環(huán)己烷等一些高疏水性有機消毒劑的耐受性［72?73］。與之類似，過氧化氫能誘導recA控制的抗性，降低大腸桿菌WP2 細胞中醛類消毒劑的殺傷作用，產(chǎn)生交叉適應(yīng)性反應(yīng)［74］。另有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌基因組中的relA、marC、proQ、yfgO和rraA與氨基酸生物合成途徑、鐵離子穩(wěn)態(tài)和能量代謝相關(guān)，5種突變能增加對丙二醇的抗性［75］。單核細胞增生菌也具有染色體介導的外排泵，造成其對苯扎氯銨的抗性，可用外排泵抑制劑利血平證明［5］。

此外，可移動遺傳元件（mobile genetic elements，MGE）是微生物獲得和傳播消毒劑抗性的重要載體，包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列、細菌噬菌體和其他整合性接合元件（ICE）等［76］。MGE可能引起一系列遺傳學效應(yīng)，包括引起插入突變、染色體畸變、產(chǎn)生新的基因變異、調(diào)節(jié)基因活動等［77］。比如，Petty 等［78］在對一種全球擴散的多重耐藥性尿路病原體大腸桿菌分型ST131的研究發(fā)現(xiàn)，其每個亞系相關(guān)的大多數(shù)單核苷酸變異是MGE 相鄰區(qū)域的重組所致，證明了MGE 和重組在這一抗性病原體進化中的作用。銅綠假單胞菌有巨大的細菌基因組，并能夠通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得大量基因，Botelho 等［76］認為MGE是其產(chǎn)生抗性的重要驅(qū)動因素，微生物獲得并適應(yīng)MGE，在共同進化過程中還可能發(fā)生一些補償性突變。ICE可攜帶編碼多種表型的基因，包括對重金屬的抗性［79?80］和降解芳香化合物的能力［81］等，可能整合至微生物的染色體，賦予其相應(yīng)的抗性。

3.2 質(zhì)粒介導的消毒劑抗性

質(zhì)粒是微生物染色體外能夠自主復制的另一重要遺傳物質(zhì)，通常呈環(huán)狀閉合的雙鏈DNA。根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)和轉(zhuǎn)移特點，質(zhì)粒可分為接合型和非接合型兩類，其中接合型質(zhì)粒帶有轉(zhuǎn)移基因。接合性質(zhì)粒和ICE 具有接合轉(zhuǎn)移位點oriT、松弛酶（Mob）、IV 型伴侶蛋白（T4CP）和IV 型分泌系統(tǒng)（T4SS）4個轉(zhuǎn)移功能區(qū)，具有滾環(huán)復制和接合轉(zhuǎn)移等典型單鏈DNA自行轉(zhuǎn)移特性［82］。微生物對消毒劑抗性可能由質(zhì)粒介導，質(zhì)粒中消毒劑抗性基因的存在與菌體MIC 敏感性的降低呈相關(guān)性［83］。例如，Littlejohn 等［84］早在1991 年就通過測定2.4 kb 質(zhì)粒的pSK89全序列，在金黃色葡萄球菌消毒劑抗性株中發(fā)現(xiàn)外排泵基因qacC/qacD。Sasatsu 等［85］發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對溴化乙錠等消毒劑的抗性與質(zhì)粒中與qacC、qacD同源的ebr有關(guān)，測序發(fā)現(xiàn)高抗性菌株的質(zhì)粒pTZ22 攜帶的抗性基因ebr加倍，外排泵效率提高了1倍，進一步將此質(zhì)粒的抗性基因插入到pUC19 并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，大腸桿菌對戊二醛的抗性提高，MIC 由對照菌株的100 mg/L提高到1 600 mg/L。Leelaporn 等［86］通過DNA?DNA 雜交分析和表型耐藥性研究，檢測凝固酶陰性葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的多藥外排基因qacA和qacC都位于質(zhì)粒上，qacA位于>10 kb的質(zhì)粒上，qacC主要位于2～3 kb的質(zhì)粒上。

獲得性抗性基因常借助質(zhì)粒和ICE 等MGE，通過接合轉(zhuǎn)移等方式在微生物間水平轉(zhuǎn)移。SMR家族的季銨鹽類消毒劑專用多藥外排泵基因包括emrE、sugE、qacE、qacΔE、qacF、qacG、qacH、qacI、qacJ和qacZ等外排決定基因，這些外排蛋白基因主要位于轉(zhuǎn)座子、ICE、質(zhì)粒和整合子等流動遺傳元件中，可以在同一或不同屬的微生物之間水平轉(zhuǎn)移［71］。比如，在肺炎克雷伯菌發(fā)現(xiàn)的qacA、qacΔE、qacE、acrA與對戊二醛等消毒劑的抗性有關(guān)，可以使細菌對乙醇的MIC 增長為無抗性基因菌株的16 倍，存在于質(zhì)粒且能夠整合至染色體［87］。多數(shù)可移動質(zhì)粒是通過表達Mob 利用接合元件匹配孔的，Mob 作用于質(zhì)粒的同源oriT［88］。為深度解讀海量可移動基因組數(shù)據(jù)，Li等［89］開發(fā)了生物信息學軟件oriTfinder，用于快速識別質(zhì)粒和ICE 序列中的oriT、Mob、T4CP 和T4SS 等接合轉(zhuǎn)移功能模塊，構(gòu)建并提出接合轉(zhuǎn)移、非自主轉(zhuǎn)移和不可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒等歸類方法，可用于分析細菌全基因組序列及批量分析。此類技術(shù)的發(fā)展和完善將有助于微生物消毒劑抗性基因研究的深入，明確抗性基因的轉(zhuǎn)移方式和路徑。

3.3 獲得抗性和抗性基因的水平傳播

微生物對消毒劑的抗性基因常借助MGE 在微生物間水平轉(zhuǎn)移［90］，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合轉(zhuǎn)移等方式廣泛傳播并增加抗性［91?94］。一些研究證實，消毒劑能夠促進質(zhì)粒攜帶的抗性基因在不同微生物間轉(zhuǎn)移，而一些抗性基因不易被一般消毒方法除去，這將加劇全球使用消毒劑可能存在的風險［12］。Luprano 等［95］發(fā)現(xiàn)，過氧乙酸消毒無法消除環(huán)境中ampC、mecA、ermB、sul1、sul2、tetA、tetO、tetW、vanA等抗性基因。此外，細胞內(nèi)ROS 的形成、SOS反應(yīng)、細胞膜通透性的增加以及相關(guān)基因表達的改變可能增強接合轉(zhuǎn)移。Lu等［96］通過表型實驗、全基因組RNA 測序和蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)境濃度的三氯生暴露可誘導微生物細胞ROS產(chǎn)生量增長至原來的1.3～1.5倍，引起細胞膜損傷，上調(diào)外膜孔蛋白翻譯，增強一般分泌系統(tǒng)Sec 約1.4倍、雙精氨酸轉(zhuǎn)位系統(tǒng)Tat約1.2倍和IV型菌毛分泌系統(tǒng)約2.5 倍，有助于微生物通過菌毛捕獲和細胞膜通道的轉(zhuǎn)運等方式獲得外源基因，使攜帶精氨酸合成基因的質(zhì)粒向大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化提高1.4 倍。生物膜的形成會導致微生物群體中出現(xiàn)廣泛的遺傳多樣性，高細胞密度、基質(zhì)的存在、大量DNA 的釋放和生物膜內(nèi)的營養(yǎng)條件都可能促進接合和轉(zhuǎn)化過程［37］。基因的轉(zhuǎn)移賦予受體新的代謝能力，使之適應(yīng)新的生態(tài)位［91］。

一些消毒方式會對抗性基因的轉(zhuǎn)移有不同程度的影響。通常高劑量的消毒劑會取得更好的滅菌效果，而劑量不足則可能引發(fā)抗性擴散的不良后果。用0.2 mmol/L過氧化氫處理恥垢分枝桿菌后的轉(zhuǎn)錄分析表明，糖酵解、糖異生和脂肪酸代謝等代謝途徑可能參與抗性反應(yīng)；而7 mmol/L 過氧化氫處理時，編碼核糖體的基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，會影響蛋白質(zhì)合成裝置，減少蛋白質(zhì)合成，導致細菌生長減少［97］。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的紫外線或氯氣均可顯著抑制精氨酸轉(zhuǎn)移的頻率，而低劑量的紫外線消毒和氯化對接合轉(zhuǎn)移有不同影響，紫外線照射只減少細菌數(shù)量，不改變細胞通透性，因此影響很小，而氯胺刺激可提高細胞的通透性，細胞表面誘導出的菌毛是精氨酸轉(zhuǎn)移的途徑，于是低劑量氯消毒可提高接合轉(zhuǎn)移頻率2～5 倍［98］。與之類似，游離氯、氯胺和過氧化氫的亞抑制濃度（低于MIC）導致種內(nèi)接合轉(zhuǎn)移的頻率較對照組增加1.5～7.5 倍、屬間接合轉(zhuǎn)移頻率較對照組增加1.4～2.3 倍，而高于MIC的消毒劑顯著抑制接合轉(zhuǎn)移［99］。

4 消毒劑抗性與抗生素抗性的關(guān)聯(lián)

微生物對抗生素的耐藥性已構(gòu)成世界性危機，除醫(yī)療機構(gòu)外，更多的研究調(diào)查從污水處理廠、養(yǎng)殖場、土壤、水體等各種環(huán)境中發(fā)現(xiàn)廣泛存在的抗生素抗性基因（ARG）和抗生素抗性細菌（ARB）。這會加劇ARB 全球傳播的環(huán)境風險，目前ARG 已歸為新興污染物，引發(fā)了全球的關(guān)注［100］。消毒劑作為另一類殺滅微生物的物質(zhì)，微生物對其也會產(chǎn)生抗性，相關(guān)抗性基因的傳播機制及潛在危害也逐漸引起研究者的重視。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，消毒劑抗性與抗生素抗性之間具有一定的關(guān)聯(lián)性。Lyon 等［101］研究質(zhì)粒介導的消毒劑抗性基因時發(fā)現(xiàn)，當編碼多藥外排系統(tǒng)的基因位于含有青霉素、慶大霉素、甲氧芐啶和卡那霉素等抗生素耐藥基因的質(zhì)粒上，可以說明消毒劑抗性與抗生素抗性之間具有一定的相關(guān)性。Amsalu 等［102］研究銅綠假單胞菌在不同自然生態(tài)位中同時對多種抗生素和消毒劑產(chǎn)生耐藥性的能力，發(fā)現(xiàn)存在交叉耐藥性，其主要促成因素是調(diào)節(jié)基因mexR、nalC或nalD及相應(yīng)氨基酸突變導致的MexAB?OprM藥物外排泵的過度表達。

此外，消毒劑暴露下誘導出的抗性微生物往往也能抵抗一定濃度的抗生素，甚至可能促進微生物抗生素耐藥性的產(chǎn)生和傳播。比如，土壤中銅、鋅濃度與ARG和MGE基因豐度之間存在相關(guān)性［103］，垃圾填埋場中ARG與MGE的相對豐度與砷、鎘含量顯著相關(guān)，表明ARG 的出現(xiàn)主要受重金屬消毒劑和MGE 的影響，造成抗生素耐藥性傳播的風險［104］。飲用水氯消毒時，消毒劑的副產(chǎn)物能夠誘導抗生素抗性，導致群落抗生素耐藥性與抗生素水平不一致［6］。究其原因，氯化過程能夠通過自然轉(zhuǎn)化促進質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移，導致ARG 在屬間的交換和新型ARB 的出現(xiàn)，氯損傷還會使致病菌從非ARB 轉(zhuǎn)移到ARB，而且轉(zhuǎn)移元件很難通過消毒降解［100］?？傊喾N消毒劑可以通過誘導基因突變增強微生物的抗生素抗性，從而增加抗生素抗性基因在環(huán)境中傳播的潛在風險。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，微生物可通過形成生物膜、改變細胞膜滲透性、過量表達外排泵、產(chǎn)生消除或減弱消毒劑的特異性酶及改變作用靶點等策略產(chǎn)生針對消毒劑的抗性?？剐曰蚩捎扇旧w或質(zhì)粒介導，并且不合理使用消毒劑可能會誘導抗性并加劇抗性基因的傳播風險。大量環(huán)境調(diào)查和醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)的病原檢測發(fā)現(xiàn)微生物的消毒劑抗性與抗生素抗性存在一定關(guān)聯(lián)，消毒劑的不規(guī)范使用不僅能加劇消毒劑抗性基因污染，而且還會增加抗生素抗性基因傳播，對環(huán)境和醫(yī)療健康造成更大的風險。

目前國內(nèi)外缺乏對微生物消毒劑的抗性機理、抗性基因轉(zhuǎn)移，以及與微生物特性、消毒水平及環(huán)境條件等有關(guān)的研究［1］。消毒劑不規(guī)范使用及可能存在的環(huán)境風險已經(jīng)引起全球關(guān)注，其中歐盟已頒布評估消毒劑環(huán)境風險的法律條款，統(tǒng)一市場運作和管理，確保消毒劑不危害環(huán)境和人類健康［9］。并已提出減少長期使用單一消毒劑，選擇加熱、臭氧、UV等替代措施進行消毒。而針對生物膜結(jié)構(gòu)等抗性機制，應(yīng)用酶處理會提高消毒效率［37］，可以聯(lián)合使用多種處理方法協(xié)同作用來更徹底地消除有害微生物，避免消毒劑抗性的產(chǎn)生和傳播。另外值得注意的是，相對于抗生素抗性，微生物消毒劑抗性機制更復雜。今后應(yīng)加強針對不同消毒劑的抗性研究，尤其是作為抗性傳播重要載體的MGE 在抗性水平轉(zhuǎn)移方面的研究，利用轉(zhuǎn)座子突變體庫等分子生物學先進技術(shù)，聯(lián)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組學等多組學分析手段，開發(fā)相應(yīng)的消毒劑抗性基因數(shù)據(jù)庫和相應(yīng)生物信息學分析工具，廣泛開展微生物消毒劑抗性、抗性相關(guān)基因及產(chǎn)生機制的研究，深入探索微生物對消毒劑抗性的產(chǎn)生和傳播機理，為科學有效使用消毒劑、減少消毒劑抗性風險提供理論支持。