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        基于單菌多次級代謝產(chǎn)物策略的深海來源放線菌Streptomyces sp.SCSIO 15079化學多樣性研究*

        2022-02-09 12:52:00付春鈺蘇子淇陶華明李云秋
        廣西科學 2022年6期

        付春鈺,蘇子淇,鐘 瑩,陶華明,3,李云秋

        (1.桂林醫(yī)學院,廣西桂林 541199;2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院,廣東廣州 510515;3.廣東省中藥制劑重點實驗室,廣東廣州 510515)

        海洋放線菌因其特殊的生存環(huán)境,蘊藏著豐富、結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次生代謝產(chǎn)物資源,開發(fā)潛力巨大,其中超過50%的抗生素來自海洋放線菌[1]。在過去的幾十年里,海洋放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物是抗生素、抗腫瘤劑、驅(qū)蟲藥和抗真菌劑的豐富來源[2]。然而,由于取樣難和培養(yǎng)技術的限制,對深海放線菌及其代謝物的研究非常有限,遠遠低于淺水和陸地來源放線菌的研究[3]。目前研究中可利用的海洋放線菌活性菌株資源依然有限,且利用率較低,如何深入、有效地挖掘現(xiàn)有深海放線菌化學多樣性是其可持續(xù)利用的關鍵。

        最近的研究發(fā)現(xiàn),在放線菌基因組中有大量生物合成基因簇,這些基因簇在標準的實驗室培養(yǎng)條件下似乎沒有表達[4]。激活這些神秘的基因簇有望增加發(fā)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物的機會。因此,需要新手段、新方法去激活基因簇的表達,以發(fā)現(xiàn)更多結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物。

        放線菌具有復雜的形態(tài)劃分機制和代謝調(diào)控網(wǎng)絡,能產(chǎn)生較多次級代謝產(chǎn)物,而大部分生物合成基因簇在標準的培養(yǎng)條件下處于休眠狀態(tài)[5]。單菌多次級代謝產(chǎn)物(OSMAC)策略[6]已被證明是一種簡單而強大的工具,其通過改變培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法等手段,可以激活微生物中的許多沉默生物遺傳基因簇,從而獲得大量具有活性的代謝產(chǎn)物和天然產(chǎn)物。例如,Abdelmohsen等[7]分別使用4種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)紅海海綿放線菌Actinokineosoporasp.EG49,并從肉湯培養(yǎng)基的發(fā)酵液中分離出兩種新化合物Actinosporins A和Actinosporins B,其中Actinosporins A對布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的半抑制濃度(IC50)為15 μmol/L。Sproule等[8]分別采用14種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)從愛德華島沉積物中分離得到的放線菌Streptomycessp.RKND004,在細菌種子培養(yǎng)基(BSM)的發(fā)酵液中分離得到兩種多環(huán)聚醚離子載體Terrosamycins A和Terrosamycins B,這兩種載體對革蘭氏陽性菌均有較好的抗生素活性,對兩種乳腺癌細胞均有抑制活性。Wu等[9]分別用7種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)深海放線菌Streptomycessp.YB104,并從ACM液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液中得到濃度為25 mg/L的新天然產(chǎn)物Thinomycin B。此外,據(jù)文獻報道,海洋細菌TM104在搖床發(fā)酵和靜態(tài)發(fā)酵兩種條件下產(chǎn)生不同的含硫抗生素(Tropodithietic acid TDA),表明TDA表達受環(huán)境和培養(yǎng)條件的影響[10]。

        Streptomycessp.SCSIO 15079是一株分離自印度洋深海-3 386 m沉積物的放線菌,前期通過小規(guī)模發(fā)酵罐發(fā)酵研究,從該菌株代謝產(chǎn)物浸膏中分離得到6個新的芳香酸類化合物和3個新的亮氨酸衍生物,這些化合物均有較好的降血脂活性[11]。為了深入研究Streptomycessp. SCSIO 15079的化學和生物多樣性,本研究運用OSMCA策略,考察海鹽濃度、pH值及發(fā)酵方式對其次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響,并對發(fā)酵產(chǎn)物的差異部分進行分離和化學結(jié)構(gòu)鑒定,以期進一步豐富放線菌的次級代謝產(chǎn)物研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        放線菌Streptomycessp.SCSIO 15079于2013年分離自印度洋深海沉積物樣品(10.00371667°N,88.72803333°E,-3 386 m),經(jīng)16S rRNA基因測序及形態(tài)學分析,鑒定為鏈霉菌屬(Streptomycessp.),編號為SCSIO 15079,該菌株保存在南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中藥化學實驗室。

        A液體培養(yǎng)基:酵母提取粉1 g/L,甘油20 g/L,葡萄糖10 g/L,玉米粉5 g/L,大豆粉10 g/L,牛肉膏20 g/L,MgSO40.1 g/L,CaCO31 g/L,蒸餾水1 L,pH值為7.2。

        儀器和試劑:AVANCEⅢTMHD-600 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司),中壓色譜儀(瑞士Buchi公司),Agilent1200/1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),半制備色譜柱(YMC-packODS-A,10 mm×250 mm,5 μm,日本YMC公司),硅膠柱色譜和薄層硅膠板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司),葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (美國Amersham公司),EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司),CDCl3、CD3OD、DMSO-d6等氘代溶劑(美國CIL公司),提取分離所用試劑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等均為分析純(天津市津東天正精細化工試劑廠),液相乙腈、甲醇等均為色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?。

        1.2 方法

        1.2.1 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

        菌株Streptomycessp.SCSIO 15079經(jīng)過活化后,接種到裝有100 mL A液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,在28℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d即獲得種子培養(yǎng)液。

        將種子培養(yǎng)液以3%的接種量轉(zhuǎn)移至裝有300 mL A液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,以A液體培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基,控制pH值在7.2左右,于28℃的搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d 后對海鹽的濃度(0%、3%、5%)進行考察;取確定的海鹽濃度并按原來的培養(yǎng)條件對pH值(4.0,5.0,7.2,8.0,10.0)進行考察;取確定的海鹽濃度和pH值并按原來的培養(yǎng)條件考察發(fā)酵時長(5 d、6 d、7 d)。每個條件設3個平行樣,觀察并記錄菌株的生長狀況。采用高速離心的方法將菌絲體和菌液分開,分別用500 mL乙酸乙酯萃取3次,再分別合并菌體和發(fā)酵液的萃取液,濃縮,得到發(fā)酵液乙酸乙酯相浸膏。通過建立指紋圖譜分析比對紫外吸收,找出產(chǎn)物最豐富的發(fā)酵條件。

        1.2.2 發(fā)酵方式對菌株次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響

        成熟期:畢業(yè)生心態(tài)平和,具有合作精神和相當?shù)墓ぷ骷寄?,技能穩(wěn)步增長,并逐步在團隊內(nèi)部顯示出其人格魅力,得到其他人員的認可,更加注重工作的成就感和人生價值的實現(xiàn)。因此,用人單位一方面要為他們提供干事創(chuàng)業(yè)、實現(xiàn)發(fā)展的平臺,讓他們充分發(fā)揮聰明才干;另一方面要及時把優(yōu)秀人才選拔到更高的職位上來,讓他們發(fā)揮更大的作用。

        在1.2.1節(jié)確定的發(fā)酵條件下,將種子液以3%的比例接種到裝有300 mL A液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,發(fā)酵體積28 L,28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7 d得到搖床發(fā)酵液。發(fā)酵罐發(fā)酵則是將3%的種子液接入到裝有40 L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中,通過發(fā)酵罐里面溶解氧(DO)水平來確定發(fā)酵終止時間,最終發(fā)酵時間為80 h。通過指紋圖譜對比紫外吸收分析不同發(fā)酵方式對Streptomycessp.SCSIO 15079次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響。

        1.2.3 化合物提取分離與純化

        搖床發(fā)酵結(jié)束后,得到的發(fā)酵液通過超速離心機將菌絲體和菌液分離,分別向菌絲體和菌液中加入雙倍乙酸乙酯,37℃超聲30 min,浸泡過夜,抽濾后收集上清液。在38℃下進行減壓蒸餾除去上清液中的乙酸乙酯,剩下菌絲體及菌液中再加入回收的乙酸乙酯,重復浸泡提取3次,最終合并菌液和菌絲體的乙酸乙酯萃取物,得粗浸膏為50.0 g。

        浸膏采用正相硅膠柱色譜、十八烷基硅烷(Octadecyl Silane,ODS)反相柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜、半制備高效液相色譜等方法對搖床發(fā)酵產(chǎn)物中與發(fā)酵罐發(fā)酵具有差異的化學成分進行導向分離和純化,并根據(jù)核磁共振方法和文獻對比鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

        所得浸膏經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn),隨著海鹽濃度的增加,菌株次級代謝產(chǎn)物減少;在pH值為7時,菌株的代謝產(chǎn)物比偏酸性和偏堿性條件的代謝產(chǎn)物更豐富;發(fā)酵時間為7 d時,指紋圖譜中小極性吸收峰有所增加。因此,最后確定的最佳發(fā)酵條件:不添加海鹽、pH值為7.2的A液體培養(yǎng)基,搖床發(fā)酵時長為7 d。

        2.2 化合物的提取與分離結(jié)果

        浸膏用硅膠拌樣,用正相硅膠色譜柱進行梯度洗脫(石油醚-乙酸乙酯0-100%、乙酸乙酯-甲醇0-100%,流速50 mL/min),經(jīng)薄層色譜法合并為10個餾分Fr.1-10。Fr.10經(jīng)ODS反相中壓梯度洗脫、半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=75∶25)純化得到化合物6(3.2 mg)。Fr.4經(jīng)ODS反相中壓梯度分離成3小段,F(xiàn)r.4-3經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜分離合并后,采用半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=80∶20)純化得到化合物1(5.5 mg),采用半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=55∶45)純化得到化合物2(3.3 mg)。Fr.6經(jīng)ODS反相中壓柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜分析合并得到10個組分,F(xiàn)r.6-10采用半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=35∶65)純化得到化合物4(4.2 mg)和化合物3(6.1 mg),F(xiàn)r.6-5再次經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜、半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=60∶40)純化分別得到化合物5、化合物7、化合物8和化合物9(2-5 mg)。

        2.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

        化合物1:白色片狀晶體。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:9.90(1H,s,H-10),8.11(1H,s,H-2),8.17(1H,d,J=7.7 Hz,H-5),7.49(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),7.23-7.30(2H,m,H-7,H-8);13C-NMR(151 MHz,CD3OD)δ:187.1(C-10)139.4(C-2),125.4(C-3)為138.6(C-9),124.7(C-6),123.3(C-7),122.1(C-5),119.8(C-4),112.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的吲哚甲醛一致,確認化合物1為吲哚甲醛。

        化合物2:白色晶體。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.16(1H,s,H-2),7.54(1H,d,J=7.9 Hz,H-5),7.34(1H,d,J=8.1 Hz,H-6),7.09(1H,m,H-7),7.01(1H,m,H-8);13C-NMR(151 MHz,CD3OD)δ:138.0(C-3),124.5(C-2),128.7(C-9),124.6(C-6),122.4(C-7),119.8(C-5),109.1(C-4),112.2(C-8)。通過對比文獻[12],確認化合物2為3-羥基吲哚。

        化合物3:白色粉末。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:0.95(1H,brs,NH),10.61(H,brs,NH),7.32(1H,s,H-6),1.70(3H,s,H-7);13C-NMR(151 MHz,DMSO-d6)δ:165.0(C-4),151.5(C-2),137.8(C-6),107.7(C-5),11.8(C-7)。通過對比文獻[13],確定化合物3為胸腺嘧啶。

        化合物4:白色粉末。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:10.93(2H,brs,2NH),7.37(1H,d,J=7.5 Hz,H-5),5.42(1H,d,J=7.5 Hz,H-6);13C-NMR(151 MHz,DMSO-d6)δ:164.4(C-2),151.6(C-4),142.3(C-6),100.2(C-5)。通過對比文獻[13],確定化合物4為尿嘧啶。

        化合物5:黃色固體。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.22-7.37(5H,m,H2′-6′),4.27(1H,dd,J=3.0,10.7 Hz,H-9),4.08(1H,t,J=7.6 Hz,H-6),3.67(1H,m,Ha-10),3.60(2H,m,H-3),2.78(1H,m,Hb-10),2.33(1H,m,Ha-5),2.02(2H,m,H-4),1.91(1H,m,Hb-5);13C-NMR(151 MHz,CDCl3)169.5(C-1),165.2(C-7),136.0(C-1′),129.5(C-2′),129.2(C-3′),129.5(C-6′),129.2(C-5′),127.7(C-4′),59.3(C-6),56.3(C-9),45.6(C-3),36.9(C-10),28.5(C-5),22.7(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致,故鑒定化合物5為環(huán)-(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽。

        化合物6:白色無定型結(jié)晶,易溶于氯仿。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:4.01(1H,d,J=10.0 Hz,H-3),3.90(1H,m,H-6),2.41(1H,m,H-11),1.89(1H,m,H-8),1.79(1H,m,Ha-7),1.67(1H,m,Hb-7),1.05(3H,d,J=7.14 Hz,H-12),0.99(3H,d,J=6.54 Hz,H-12),0.95(6H,d,J=6.42 Hz,H-9,10);13C-NMR(151 MHz,CDCl3)δ:169.1(C-2),167.5(C-5),60.3(C-3),53.2(C-6),31.6(C-11),24.3(C-8),43.8(C-7),23.4(C-9),21.1(C-10),28.9(C-12),16.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致,故鑒定化合物6為環(huán)-(亮氨酸-纈氨酸)二肽。

        化合物7:黃棕色固體。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:4.12(1H,m,H-6),3.86(1H,m,H-3),2.11(1H,m,H-7), 1.50(3H,d,J=7.0 Hz,H-10),1.05(3H,d,J=7.1 Hz,H-8),0.97(3H,d,J=6.84 Hz,H-9);13C-NMR(151 MHz,CDCl3)δ:169.4(C-5),168.0(C-2),61.2(C-3),50.3(C-6),32.7(C-7),19.8(C-10),18.8(C-8),16.5(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致,故鑒定化合物7為環(huán)-(丙氨酸-纈氨酸)二肽。

        化合物8:白色固體。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:4.03(1H,m,H-3),3.90(1H,s,H-6),1.87-2.00(1H,m,H-8),1.51(1H,m,H-9a),1.43(3H,d,J=7.1 Hz,H-7),1.20-1.29(1H,m,H-9b),1.01(3H,d,J=7.1 Hz,H-11),0.94(3H,t,J=7.4 Hz,H-10);13C-NMR(151 MHz,CD3OD)δ:171.3(C-2),169.2(C-5),60.9(C-6),51.6(C-3),40.3(C-8),25.6(C-9),20.9(C-7),15.5(C-11),12.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致,故鑒定化合物8為環(huán)-(丙氨酸-異亮氨酸)。

        化合物9:白色固體。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.86(1H,brs,H-8),4.08(1H,dd,J=10.0,6.4 Hz,H-6),3.83-3.61(2H,m,H-5),3.51(1H,m,H-9),2.50-2.14(2H,m,H-3),2.12-1.69(2H,m,H-4),1.03(3H,d,J=6.9 Hz,H-11),0.98(3H,d,J=6.8 Hz,H-12);13C-NMR(151 MHz,DMSO-d6)δ:168.7(C-1),165.0(C-7),62.6(C-9),57.6(C-6),45.1(C-3),32.4(C-10),29.0(C-5),21.5(C-4),19.0(C-11),18.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致,故鑒定化合物9為環(huán)-(纈氨酸-脯氨酸)。

        化合物1-9結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

        圖1 化合物1-9結(jié)構(gòu)式

        3 討論

        為了激活菌種中不同的合成基因簇,獲得更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物,前人采用OSMAC策略開展菌種次級代謝產(chǎn)物多樣性研究,目前該類研究大多數(shù)采用改變培養(yǎng)基成分而發(fā)酵方式不變的方式,改變發(fā)酵方式而培養(yǎng)基成分不變的方式研究較少,因此相關實驗機制尚不確定。本研究基于OSMAC策略,在相同培養(yǎng)基條件下,采用單因素實驗研究發(fā)酵條件和發(fā)酵方式對深海來源放線菌Streptomycessp.SCSIO 15079次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響。研究結(jié)果表明,Streptomycessp.SCSIO 15079在不添加海鹽、pH值為7.2的A液體培養(yǎng)基中搖床發(fā)酵7 d,可產(chǎn)生更多具有活性的次級代謝產(chǎn)物。經(jīng)指紋圖譜比對發(fā)現(xiàn),使用搖床和發(fā)酵罐兩種不同發(fā)酵方式獲得的發(fā)酵產(chǎn)物,其色譜峰紫外吸收差異較大。進一步對比研究發(fā)現(xiàn),從搖床發(fā)酵產(chǎn)物中分離出9個與發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)物不一樣的化合物,經(jīng)鑒定均為含氮類化合物,包括2個吲哚類化合物,吲哚甲醛(1H-indole-3-carbaldehyde,1)、3-羥基吲哚(3-Hydroxy-1H-indole,2);2個嘧啶類化合物,胸腺嘧啶(Thymine,3)、尿嘧啶(Uiracil,4);5個環(huán)二肽類氨基酸,環(huán)-(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽[Cyclo(Phe-Pro),5]、環(huán)-(亮氨酸-纈氨酸)二肽[Cyclo(Leu-Val),6]、環(huán)-(丙氨酸-纈氨酸)二肽[Cyclo(Ala-Val),7]、環(huán)-(丙氨酸-異亮氨酸)二肽[Cyclo(Ile-Ala),8]、環(huán)-(纈氨酸-脯氨酸)二肽[Cyclo(Val-Pro),9]。前期研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵罐發(fā)酵得到11個化合物,其中有9個新化合物,且均有較好的降血脂活性[11],而搖床發(fā)酵得到的化合物大多數(shù)為含氮類生物堿,說明不同發(fā)酵方式同樣也能影響菌株基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,調(diào)控不同的代謝途徑,這也是對OSMAC策略的一種補充。推測其原因:一是兩者培養(yǎng)基滅菌方式不同,搖瓶是通過外流蒸汽靜態(tài)加熱,發(fā)酵罐是培養(yǎng)基直接與蒸汽混合加熱,因此影響了培養(yǎng)基的質(zhì)量;二是兩者在發(fā)酵過程中溶解氧含量不同,搖瓶發(fā)酵處于密封缺氧狀態(tài),發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中通入無菌氣體并攪拌,具體因素有待進一步研究。本研究結(jié)果進一步豐富了放線菌的次級代謝產(chǎn)物研究,并為深海來源創(chuàng)新藥物研發(fā)提供了重要物質(zhì)基礎和科學依據(jù)。

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