付春鈺，蘇子淇，鐘 瑩，陶華明,3，李云秋

(1.桂林醫(yī)學院，廣西桂林 541199；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州 510515；3.廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東廣州 510515)

海洋放線菌因其特殊的生存環(huán)境，蘊藏著豐富、結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次生代謝產(chǎn)物資源，開發(fā)潛力巨大，其中超過50%的抗生素來自海洋放線菌[1]。在過去的幾十年里，海洋放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物是抗生素、抗腫瘤劑、驅(qū)蟲藥和抗真菌劑的豐富來源[2]。然而，由于取樣難和培養(yǎng)技術的限制，對深海放線菌及其代謝物的研究非常有限，遠遠低于淺水和陸地來源放線菌的研究[3]。目前研究中可利用的海洋放線菌活性菌株資源依然有限，且利用率較低，如何深入、有效地挖掘現(xiàn)有深海放線菌化學多樣性是其可持續(xù)利用的關鍵。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，在放線菌基因組中有大量生物合成基因簇，這些基因簇在標準的實驗室培養(yǎng)條件下似乎沒有表達[4]。激活這些神秘的基因簇有望增加發(fā)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物的機會。因此，需要新手段、新方法去激活基因簇的表達，以發(fā)現(xiàn)更多結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物。

放線菌具有復雜的形態(tài)劃分機制和代謝調(diào)控網(wǎng)絡，能產(chǎn)生較多次級代謝產(chǎn)物，而大部分生物合成基因簇在標準的培養(yǎng)條件下處于休眠狀態(tài)[5]。單菌多次級代謝產(chǎn)物(OSMAC)策略[6]已被證明是一種簡單而強大的工具，其通過改變培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法等手段，可以激活微生物中的許多沉默生物遺傳基因簇，從而獲得大量具有活性的代謝產(chǎn)物和天然產(chǎn)物。例如，Abdelmohsen等[7]分別使用4種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)紅海海綿放線菌Actinokineosoporasp.EG49，并從肉湯培養(yǎng)基的發(fā)酵液中分離出兩種新化合物Actinosporins A和Actinosporins B，其中Actinosporins A對布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的半抑制濃度(IC50)為15 μmol/L。Sproule等[8]分別采用14種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)從愛德華島沉積物中分離得到的放線菌Streptomycessp.RKND004，在細菌種子培養(yǎng)基(BSM)的發(fā)酵液中分離得到兩種多環(huán)聚醚離子載體Terrosamycins A和Terrosamycins B，這兩種載體對革蘭氏陽性菌均有較好的抗生素活性，對兩種乳腺癌細胞均有抑制活性。Wu等[9]分別用7種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)深海放線菌Streptomycessp.YB104，并從ACM液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液中得到濃度為25 mg/L的新天然產(chǎn)物Thinomycin B。此外，據(jù)文獻報道，海洋細菌TM104在搖床發(fā)酵和靜態(tài)發(fā)酵兩種條件下產(chǎn)生不同的含硫抗生素(Tropodithietic acid TDA)，表明TDA表達受環(huán)境和培養(yǎng)條件的影響[10]。

Streptomycessp.SCSIO 15079是一株分離自印度洋深海-3 386 m沉積物的放線菌，前期通過小規(guī)模發(fā)酵罐發(fā)酵研究，從該菌株代謝產(chǎn)物浸膏中分離得到6個新的芳香酸類化合物和3個新的亮氨酸衍生物，這些化合物均有較好的降血脂活性[11]。為了深入研究Streptomycessp. SCSIO 15079的化學和生物多樣性，本研究運用OSMCA策略，考察海鹽濃度、pH值及發(fā)酵方式對其次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響，并對發(fā)酵產(chǎn)物的差異部分進行分離和化學結(jié)構(gòu)鑒定，以期進一步豐富放線菌的次級代謝產(chǎn)物研究。

1 材料與方法

1.1 材料

放線菌Streptomycessp.SCSIO 15079于2013年分離自印度洋深海沉積物樣品(10.00371667°N,88.72803333°E，-3 386 m)，經(jīng)16S rRNA基因測序及形態(tài)學分析，鑒定為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，編號為SCSIO 15079，該菌株保存在南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中藥化學實驗室。

A液體培養(yǎng)基：酵母提取粉1 g/L，甘油20 g/L，葡萄糖10 g/L，玉米粉5 g/L，大豆粉10 g/L，牛肉膏20 g/L，MgSO40.1 g/L，CaCO31 g/L，蒸餾水1 L，pH值為7.2。

儀器和試劑:AVANCEⅢTMHD-600 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司)，中壓色譜儀(瑞士Buchi公司)，Agilent1200/1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，半制備色譜柱(YMC-packODS-A,10 mm×250 mm,5 μm，日本YMC公司)，硅膠柱色譜和薄層硅膠板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (美國Amersham公司)，EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，CDCl3、CD3OD、DMSO-d6等氘代溶劑(美國CIL公司)，提取分離所用試劑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等均為分析純(天津市津東天正精細化工試劑廠)，液相乙腈、甲醇等均為色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

菌株Streptomycessp.SCSIO 15079經(jīng)過活化后，接種到裝有100 mL A液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，在28℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d即獲得種子培養(yǎng)液。

將種子培養(yǎng)液以3%的接種量轉(zhuǎn)移至裝有300 mL A液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，以A液體培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基，控制pH值在7.2左右，于28℃的搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d 后對海鹽的濃度(0%、3%、5%)進行考察；取確定的海鹽濃度并按原來的培養(yǎng)條件對pH值(4.0，5.0，7.2，8.0，10.0)進行考察；取確定的海鹽濃度和pH值并按原來的培養(yǎng)條件考察發(fā)酵時長(5 d、6 d、7 d)。每個條件設3個平行樣，觀察并記錄菌株的生長狀況。采用高速離心的方法將菌絲體和菌液分開，分別用500 mL乙酸乙酯萃取3次，再分別合并菌體和發(fā)酵液的萃取液，濃縮，得到發(fā)酵液乙酸乙酯相浸膏。通過建立指紋圖譜分析比對紫外吸收，找出產(chǎn)物最豐富的發(fā)酵條件。

1.2.2 發(fā)酵方式對菌株次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響

成熟期：畢業(yè)生心態(tài)平和，具有合作精神和相當?shù)墓ぷ骷寄?，技能穩(wěn)步增長，并逐步在團隊內(nèi)部顯示出其人格魅力，得到其他人員的認可，更加注重工作的成就感和人生價值的實現(xiàn)。因此，用人單位一方面要為他們提供干事創(chuàng)業(yè)、實現(xiàn)發(fā)展的平臺，讓他們充分發(fā)揮聰明才干；另一方面要及時把優(yōu)秀人才選拔到更高的職位上來，讓他們發(fā)揮更大的作用。

在1.2.1節(jié)確定的發(fā)酵條件下，將種子液以3%的比例接種到裝有300 mL A液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，發(fā)酵體積28 L，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7 d得到搖床發(fā)酵液。發(fā)酵罐發(fā)酵則是將3%的種子液接入到裝有40 L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，通過發(fā)酵罐里面溶解氧(DO)水平來確定發(fā)酵終止時間，最終發(fā)酵時間為80 h。通過指紋圖譜對比紫外吸收分析不同發(fā)酵方式對Streptomycessp.SCSIO 15079次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響。

1.2.3 化合物提取分離與純化

搖床發(fā)酵結(jié)束后，得到的發(fā)酵液通過超速離心機將菌絲體和菌液分離，分別向菌絲體和菌液中加入雙倍乙酸乙酯，37℃超聲30 min，浸泡過夜，抽濾后收集上清液。在38℃下進行減壓蒸餾除去上清液中的乙酸乙酯，剩下菌絲體及菌液中再加入回收的乙酸乙酯，重復浸泡提取3次，最終合并菌液和菌絲體的乙酸乙酯萃取物，得粗浸膏為50.0 g。

浸膏采用正相硅膠柱色譜、十八烷基硅烷(Octadecyl Silane,ODS)反相柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜、半制備高效液相色譜等方法對搖床發(fā)酵產(chǎn)物中與發(fā)酵罐發(fā)酵具有差異的化學成分進行導向分離和純化，并根據(jù)核磁共振方法和文獻對比鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

所得浸膏經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，隨著海鹽濃度的增加，菌株次級代謝產(chǎn)物減少；在pH值為7時，菌株的代謝產(chǎn)物比偏酸性和偏堿性條件的代謝產(chǎn)物更豐富；發(fā)酵時間為7 d時，指紋圖譜中小極性吸收峰有所增加。因此，最后確定的最佳發(fā)酵條件：不添加海鹽、pH值為7.2的A液體培養(yǎng)基，搖床發(fā)酵時長為7 d。

2.2 化合物的提取與分離結(jié)果

浸膏用硅膠拌樣，用正相硅膠色譜柱進行梯度洗脫(石油醚-乙酸乙酯0-100%、乙酸乙酯-甲醇0-100%，流速50 mL/min)，經(jīng)薄層色譜法合并為10個餾分Fr.1-10。Fr.10經(jīng)ODS反相中壓梯度洗脫、半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=75∶25)純化得到化合物6(3.2 mg)。Fr.4經(jīng)ODS反相中壓梯度分離成3小段，F(xiàn)r.4-3經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜分離合并后，采用半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=80∶20)純化得到化合物1(5.5 mg)，采用半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=55∶45)純化得到化合物2(3.3 mg)。Fr.6經(jīng)ODS反相中壓柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜分析合并得到10個組分，F(xiàn)r.6-10采用半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=35∶65)純化得到化合物4(4.2 mg)和化合物3(6.1 mg)，F(xiàn)r.6-5再次經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜、半制備高效液相色譜(MeOH∶H2O=60∶40)純化分別得到化合物5、化合物7、化合物8和化合物9(2-5 mg)。

2.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

化合物1：白色片狀晶體。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.90(1H，s，H-10)，8.11(1H，s，H-2)，8.17(1H，d，J=7.7 Hz，H-5)，7.49(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，7.23-7.30(2H，m，H-7，H-8)；13C-NMR(151 MHz，CD3OD)δ：187.1(C-10)139.4(C-2)，125.4(C-3)為138.6(C-9)，124.7(C-6)，123.3(C-7)，122.1(C-5)，119.8(C-4)，112.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的吲哚甲醛一致，確認化合物1為吲哚甲醛。

化合物2：白色晶體。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.16(1H，s，H-2)，7.54(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，7.34(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，7.09(1H，m，H-7)，7.01(1H，m，H-8)；13C-NMR(151 MHz，CD3OD)δ：138.0(C-3)，124.5(C-2)，128.7(C-9)，124.6(C-6)，122.4(C-7)，119.8(C-5)，109.1(C-4)，112.2(C-8)。通過對比文獻[12]，確認化合物2為3-羥基吲哚。

化合物3：白色粉末。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：0.95(1H，brs，NH)，10.61(H，brs，NH)，7.32(1H，s，H-6)，1.70(3H，s，H-7)；13C-NMR(151 MHz，DMSO-d6)δ：165.0(C-4)，151.5(C-2)，137.8(C-6)，107.7(C-5)，11.8(C-7)。通過對比文獻[13]，確定化合物3為胸腺嘧啶。

化合物4：白色粉末。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.93(2H，brs，2NH)，7.37(1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，5.42(1H，d，J=7.5 Hz，H-6)；13C-NMR(151 MHz，DMSO-d6)δ：164.4(C-2)，151.6(C-4)，142.3(C-6)，100.2(C-5)。通過對比文獻[13]，確定化合物4為尿嘧啶。

化合物5：黃色固體。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.22-7.37(5H，m，H2′-6′)，4.27(1H，dd，J=3.0，10.7 Hz，H-9)，4.08(1H，t，J=7.6 Hz，H-6)，3.67(1H，m，Ha-10)，3.60(2H，m，H-3)，2.78(1H，m，Hb-10)，2.33(1H，m，Ha-5)，2.02(2H，m，H-4)，1.91(1H，m，Hb-5);13C-NMR(151 MHz，CDCl3)169.5(C-1)，165.2(C-7)，136.0(C-1′)，129.5(C-2′)，129.2(C-3′)，129.5(C-6′)，129.2(C-5′)，127.7(C-4′)，59.3(C-6)，56.3(C-9)，45.6(C-3)，36.9(C-10)，28.5(C-5)，22.7(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致，故鑒定化合物5為環(huán)-(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽。

化合物6：白色無定型結(jié)晶，易溶于氯仿。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.01(1H，d，J=10.0 Hz，H-3)，3.90(1H，m，H-6)，2.41(1H，m，H-11)，1.89(1H，m，H-8)，1.79(1H，m，Ha-7)，1.67(1H，m，Hb-7)，1.05(3H，d，J=7.14 Hz，H-12)，0.99(3H，d，J=6.54 Hz，H-12)，0.95(6H，d，J=6.42 Hz，H-9，10);13C-NMR(151 MHz，CDCl3)δ：169.1(C-2)，167.5(C-5)，60.3(C-3)，53.2(C-6)，31.6(C-11)，24.3(C-8)，43.8(C-7)，23.4(C-9)，21.1(C-10)，28.9(C-12)，16.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致，故鑒定化合物6為環(huán)-(亮氨酸-纈氨酸)二肽。

化合物7：黃棕色固體。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.12(1H，m，H-6)，3.86(1H，m，H-3)，2.11(1H，m，H-7)， 1.50(3H，d，J=7.0 Hz，H-10)，1.05(3H，d，J=7.1 Hz，H-8)，0.97(3H，d，J=6.84 Hz，H-9)；13C-NMR(151 MHz，CDCl3)δ：169.4(C-5)，168.0(C-2)，61.2(C-3)，50.3(C-6)，32.7(C-7)，19.8(C-10)，18.8(C-8)，16.5(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致，故鑒定化合物7為環(huán)-(丙氨酸-纈氨酸)二肽。

化合物8：白色固體。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.03(1H，m，H-3)，3.90(1H，s，H-6)，1.87-2.00(1H，m，H-8)，1.51(1H，m，H-9a)，1.43(3H，d，J=7.1 Hz，H-7)，1.20-1.29(1H，m，H-9b)，1.01(3H，d，J=7.1 Hz，H-11)，0.94(3H，t，J=7.4 Hz，H-10);13C-NMR(151 MHz，CD3OD)δ：171.3(C-2)，169.2(C-5)，60.9(C-6)，51.6(C-3)，40.3(C-8)，25.6(C-9)，20.9(C-7)，15.5(C-11)，12.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致，故鑒定化合物8為環(huán)-(丙氨酸-異亮氨酸)。

化合物9：白色固體。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：6.86(1H，brs，H-8)，4.08(1H，dd，J=10.0，6.4 Hz，H-6)，3.83-3.61(2H，m，H-5)，3.51(1H，m，H-9)，2.50-2.14(2H，m，H-3)，2.12-1.69(2H，m，H-4)，1.03(3H，d，J=6.9 Hz，H-11)，0.98(3H，d，J=6.8 Hz，H-12)；13C-NMR(151 MHz，DMSO-d6)δ：168.7(C-1)，165.0(C-7)，62.6(C-9)，57.6(C-6)，45.1(C-3)，32.4(C-10)，29.0(C-5)，21.5(C-4)，19.0(C-11)，18.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故鑒定化合物9為環(huán)-(纈氨酸-脯氨酸)。

化合物1-9結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 化合物1-9結(jié)構(gòu)式

3 討論

為了激活菌種中不同的合成基因簇，獲得更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，前人采用OSMAC策略開展菌種次級代謝產(chǎn)物多樣性研究，目前該類研究大多數(shù)采用改變培養(yǎng)基成分而發(fā)酵方式不變的方式，改變發(fā)酵方式而培養(yǎng)基成分不變的方式研究較少，因此相關實驗機制尚不確定。本研究基于OSMAC策略，在相同培養(yǎng)基條件下，采用單因素實驗研究發(fā)酵條件和發(fā)酵方式對深海來源放線菌Streptomycessp.SCSIO 15079次級代謝產(chǎn)物多樣性的影響。研究結(jié)果表明，Streptomycessp.SCSIO 15079在不添加海鹽、pH值為7.2的A液體培養(yǎng)基中搖床發(fā)酵7 d，可產(chǎn)生更多具有活性的次級代謝產(chǎn)物。經(jīng)指紋圖譜比對發(fā)現(xiàn)，使用搖床和發(fā)酵罐兩種不同發(fā)酵方式獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，其色譜峰紫外吸收差異較大。進一步對比研究發(fā)現(xiàn)，從搖床發(fā)酵產(chǎn)物中分離出9個與發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)物不一樣的化合物，經(jīng)鑒定均為含氮類化合物，包括2個吲哚類化合物，吲哚甲醛(1H-indole-3-carbaldehyde，1)、3-羥基吲哚(3-Hydroxy-1H-indole，2)；2個嘧啶類化合物，胸腺嘧啶(Thymine，3)、尿嘧啶(Uiracil，4)；5個環(huán)二肽類氨基酸，環(huán)-(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽[Cyclo(Phe-Pro)，5]、環(huán)-(亮氨酸-纈氨酸)二肽[Cyclo(Leu-Val)，6]、環(huán)-(丙氨酸-纈氨酸)二肽[Cyclo(Ala-Val)，7]、環(huán)-(丙氨酸-異亮氨酸)二肽[Cyclo(Ile-Ala)，8]、環(huán)-(纈氨酸-脯氨酸)二肽[Cyclo(Val-Pro)，9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐發(fā)酵得到11個化合物，其中有9個新化合物，且均有較好的降血脂活性[11]，而搖床發(fā)酵得到的化合物大多數(shù)為含氮類生物堿，說明不同發(fā)酵方式同樣也能影響菌株基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)控不同的代謝途徑，這也是對OSMAC策略的一種補充。推測其原因：一是兩者培養(yǎng)基滅菌方式不同，搖瓶是通過外流蒸汽靜態(tài)加熱，發(fā)酵罐是培養(yǎng)基直接與蒸汽混合加熱，因此影響了培養(yǎng)基的質(zhì)量；二是兩者在發(fā)酵過程中溶解氧含量不同，搖瓶發(fā)酵處于密封缺氧狀態(tài)，發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中通入無菌氣體并攪拌，具體因素有待進一步研究。本研究結(jié)果進一步豐富了放線菌的次級代謝產(chǎn)物研究，并為深海來源創(chuàng)新藥物研發(fā)提供了重要物質(zhì)基礎和科學依據(jù)。