范賢平，張 晟，蔣 葛，曹曉慧，喬 毅，成 婕，徐軍田，胡闖顯，沈 輝**

(1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222000；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；3.江蘇農(nóng)墾金鯉漁業(yè)有限公司，江蘇鹽城 224500)

急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)是一種新出現(xiàn)的對(duì)蝦病害，可感染凡納濱對(duì)蝦(Penaeusvannamei)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)和中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)，死亡率為70%-100%[1]。據(jù)相關(guān)研究表明，AHPND病原為攜帶一個(gè)69 kD的pVA1質(zhì)粒，可編碼pirA、pirB毒力基因的一類弧菌(VPAHPND)，通過(guò)基因重組和敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)pirA和pirB的突變導(dǎo)致菌株致病力消失，證明PirA和PirB毒力蛋白是引起AHPND的主要致病因子[2]。Victorio-De Los Santos等[3]通過(guò)克隆重組PirA和PirB毒力蛋白，發(fā)現(xiàn)PirB亞基是一種特異性氨基糖凝集素，可與蝦肝胰腺上皮細(xì)胞膜上受體分子結(jié)合，從而觸發(fā)細(xì)胞大量脫落，這進(jìn)一步證實(shí)了PirA、PirB毒力蛋白是AHPND的關(guān)鍵致病因子。

研究發(fā)現(xiàn)pirA和pirB毒力基因共同位于1 665 bp的基因片段上，pirA(336 bp)與pirB(1 317 bp)基因之間相隔12 bp基因序列，該序列分析結(jié)果與熒光發(fā)光桿菌(Photorhabdus)的pirA2B2[4]和致病桿菌屬(Xenorhabdus)的pirAB[5]基因相似，二者都利用自身的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，重組表達(dá)產(chǎn)生的PirAB毒素對(duì)四齡棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)毒性[6]。Sirikharin等[7]將pirA和pirB基因片段分別克隆并連接到pET-17b載體和pGEX-4T-1載體，并在大腸桿菌(Escherichiacoli) BL-21(DE3)中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)pirA或pirB基因所得到的蛋白沒(méi)有毒性或毒性較低，猜測(cè)PirA和PirB重組蛋白需要結(jié)合才能誘發(fā)AHPND的典型癥狀。然而，誘導(dǎo)死亡所需的重組PirA和重組PirB組合的數(shù)量相對(duì)較高，其次表達(dá)載體、重組蛋白的構(gòu)建方法和表達(dá)細(xì)胞系的選擇不同，可能導(dǎo)致重組蛋白的構(gòu)象和活性發(fā)生變化，影響毒力大小[7-10]，最后PirA和PirB在致病機(jī)制中的作用尚未完全確定。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得VPAHPND的毒力基因，克隆并連接到pET 21b(+)原核表達(dá)載體上，并進(jìn)行原核表達(dá)和純化，以獲取大量PirA、PirB及PirAB蛋白，為下一步的PirA/PirB毒力和抗體的研究積累技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

VPAHPND菌株(編號(hào)1669)和表達(dá)質(zhì)粒pET 21b(+)由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所生物技術(shù)室保存并提供，克隆菌株E.coliTop10、表達(dá)菌株E.coliBL-21(DE3)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試劑及儀器

高分子量蛋白marker、2×Taq PCR MasterMix、DNA分子量 marker、Nhel和Scal限制性內(nèi)切酶、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)、辣根過(guò)氧化氫酶DAB顯色試劑盒、Mag-Beads His-Tag蛋白純化磁珠、硝酸纖維素印跡膜(NC印跡膜)、10×TBST WB漂洗液購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化(北京)科技有限公司；兔抗(PirA和PirB)一抗、山羊抗兔IgG二抗(辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記)購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，ClonExpressⅡ重組克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。蛋白電泳槽(DYCZ-24DN)、濕轉(zhuǎn)儀(DYCZ-4OD)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；冷凍離心機(jī)、PCR儀、移液槍均購(gòu)自德國(guó)艾本德公司(Eppendorf)；超微量分光光度計(jì)(DeNovix DS-11)購(gòu)自廣州市深華生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的片段的擴(kuò)增

將經(jīng)平板純化的VPAHPND1669菌種轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，6 000 g離心收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。根據(jù)GenBank登錄的pirAB基因(NC_025152.1)序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增pirA、pirB、pirAB (表1)。下劃線分別為Nhel、Scal兩個(gè)酶切位點(diǎn)。pirA引物：pirA-F-Nhel/pirA-R-Scal，pirB引物：pirB-F-Nhel/pirB-R-Scal，pirAB 引物：pirAB-F-Nhel/pirAB-R-Scal。反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol/L)，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化回收試劑盒純化并回收目的片段。

表1 PCR引物

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

使用Nhel和Scal限制性內(nèi)切酶酶切載體pET 21b(+)，酶切體系：ddH2O 11 μL，載體30 μL，10×QuickCut Buffer 5 μL，Nhel和Scal各2 μL；酶切反應(yīng)條件：37℃水浴2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA回收試劑盒純化并回收目的片段。利用ClonExpressⅡ重組克隆試劑盒將pirA、pirB和pirAB的PCR擴(kuò)增DNA片段連接到質(zhì)粒載體pET 21b(+)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Top10中，涂布于含有100 μg/mL 氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進(jìn)行Nhel和Scal雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21 (DE3)中，涂布于LB平板(添加 100 μg/mL Amp)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證連接的正確性及所克隆基因的完整性。

1.3.3 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

將鑒定正確的重組菌接種至含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜。為得到高濃度的重組蛋白，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。時(shí)間和溫度優(yōu)化：在1.0 mmol/L IPTG濃度下，分別于20℃、25℃和30℃條件下，以150 r/min搖床培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h，各取2 mL菌液進(jìn)行檢測(cè)。IPTG濃度優(yōu)化：分別以0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L IPTG于20℃、150 r/min誘導(dǎo)16 h，各取2 mL菌液，離心棄上清。將菌體用0.01 mol/L PBS緩沖液重懸，冰浴超聲波破碎菌體，超聲條件：45 W、超聲5 s 停5 s,總時(shí)間5 min，超聲后4℃、10 000 r/min 離心10 min，分別取其上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.3.4 重組蛋白的純化與分析

按1∶100體積比接種過(guò)夜培養(yǎng)的重組菌液于500 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，160 r/min、37℃培養(yǎng)菌液至OD600為0.6-0.8；以實(shí)驗(yàn)確定的誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，10 000 g離心10 min收取菌體，并用0.01 mol/L PBS重懸菌體進(jìn)行超聲波破碎，10 000 g離心10 min收取上清液。按照Mag-Beads His-Tag蛋白純化磁珠說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用含有不同濃度咪唑(5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、50 mmol/L、500 mmol/L)的洗脫緩沖液進(jìn)行目標(biāo)蛋白純化，并收集洗脫液。純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 Western blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)

純化蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶于室溫封閉過(guò)夜；用1×TBST WB漂洗液洗滌3次，每次5 min；加入兔抗(PirA和PirB)一抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育2-3 h；1×TBST WB漂洗液洗滌3次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶4 000稀釋)，于室溫孵育1 h；1×TBST漂洗液洗滌3次，每次10 min。最后用辣根過(guò)氧化氫酶DAB顯色試劑盒底物顯色液顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建

pirA、pirB及pirAB擴(kuò)增片段分別為336 bp、1 317 bp、1 665 bp，與預(yù)測(cè)目的條帶大小一致[圖1(a)]；空載質(zhì)粒pET 21b(+)雙酶切后全長(zhǎng)為5 442 bp [圖1(b)]；將目的片段和雙酶切后的pET 21b(+)質(zhì)粒載體連接后，獲取重組質(zhì)粒pET21b-pirA、pET 21b-pirB、pET21b-pirAB，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，條帶大小與預(yù)測(cè)一致[圖1(c)]。經(jīng)測(cè)序結(jié)果分析，pirA、pirB和pirAB序列成功克隆至載體質(zhì)粒中。

M:DNA marker,(a) Electrophoresis of PCR amplified fragments,(b) Double enzyme digestion of pET 21b(+) vector fragments,(c) Double enzyme digestion of recombinant plasmi

2.2 重組蛋白表達(dá)分析

2.2.1 IPTG濃度對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的影響

PirA (17 kDa)、PirB (50 kDa)及PirAB (50+17) kDa在8個(gè)濃度梯度組中均呈現(xiàn)清晰的目的條帶，表明8個(gè)濃度的 IPTG 都能誘導(dǎo)重組PirA、PirB和PirAB蛋白的表達(dá)，PirB和PirAB在不添加IPTG的情況下也能成功表達(dá) (圖2)。重組蛋白PirB和PirAB在IPTG濃度為0時(shí)的表達(dá)量顯著低于IPTG濃度為0.01 mmol/L的表達(dá)量(圖3)，其他濃度的IPTG對(duì)重組蛋白表達(dá)量影響較小。因此，確定誘導(dǎo)重組蛋白PirA、PirB和PirAB表達(dá)的IPTG最適濃度為0.01 mmol/L。

M:Protein molecular weight standard;1-9:Supernatant of induced bacterial crushing solution (IPTG concentrations were 0 mmol/L,0.01 mmol/L,0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L,2.0 mmol/L,respectively);The target protein is shown in the frame

M:Protein molecular weight standard;1:IPTG concentration of 0.01 mmol/L;2:IPTG concentration of 0 mmol/L

2.2.2 誘導(dǎo)溫度和時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的影響

重組表達(dá)的溫度和誘導(dǎo)時(shí)間結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白PirA和PirAB表達(dá)量顯著上升，并于24 h達(dá)到峰值；重組蛋白PirB的表達(dá)量在誘導(dǎo)4 h后沒(méi)有顯著變化(圖4)。重組蛋白在20℃、25℃和30℃條件下均能較好地表達(dá)，細(xì)菌裂解液的上清液和沉淀中都能觀察到目的條帶，根據(jù)目的條帶的粗細(xì)可知，80%左右的重組蛋白為可溶性表達(dá)(圖4)。如圖4：(j)-(l)所示，在20℃、25℃、30℃條件下，PirA和PirAB誘導(dǎo)24 h，PirB誘導(dǎo)4 h時(shí)，上清液樣品SDS-PAGE結(jié)果中30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)重組蛋白PirA、PirB和PirAB表達(dá)量最大。以上結(jié)果表明，30℃為PirA、PirB和PirAB重組蛋白的最適誘導(dǎo)溫度，重組蛋白PirA和PirAB的最適誘導(dǎo)時(shí)間為24 h，重組蛋白PirB的最適誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

M:Protein molecular weight standard;1:Broken liquid of uninduced bacteria;2-7:Supernatant of the disrupted liquid of induced bacteria (times are 4 h,8 h,12 h,16 h,18 h,24 h,respectively);8-13:Broken induced bacteria liquid precipitation (times are 4 h,8 h,12 h,16 h,18 h,24 h,respectively);The target protein is shown in the frame

2.3 重組蛋白純化及濃度測(cè)定

重組蛋白經(jīng)純化后濃度為1.2-2.0 mg/mL，PirA、PirB重組蛋白經(jīng)10 mmol/L咪唑洗脫后能得到高純度蛋白，PirAB經(jīng)20 mmol/L、50 mmol/L、500 mmol/L咪唑洗脫液后均能得到高純度蛋白，獲得的3種高純度重組蛋白均可滿足多克隆抗體制備的要求(圖5)。

M:protein molecular weight standard;1:Unpurified crude protein;2,3:Wash miscellaneous liquid;4-8:Eluent (imidazole concentration is 5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L,50 mmol/L,500 mmol/L);The target protein is shown in the frame

2.4 Western blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，PirA、PirB及PirAB分別在17 kDa、50 kDa及(50+17) kDa附近顯色(圖6)，與預(yù)測(cè)蛋白大小一致，表明所獲得的純化重組蛋白均具有較好的免疫原性。

M:protein molecular weight standard;1:PirAB;2:PirA;3:PirB

3 討論

AHPND主要致病因子為毒力蛋白PirAB，大量獲取該蛋白的方式主要為硫酸銨沉淀法和異源表達(dá)。致病菌菌體中毒力蛋白PirAB表達(dá)量少，硫酸銨沉淀法獲得的毒力蛋白雜蛋白多，后期純化復(fù)雜，不利于后期的攻毒實(shí)驗(yàn)。原核表達(dá)系統(tǒng)可以目標(biāo)明確地獲得大量融合蛋白，通過(guò)親和層析純化，可有效降低雜蛋白含量，獲得高純度重組目的蛋白[11]。本研究直接將pirAB的全序列插入含有6個(gè)His標(biāo)簽的pET 21b(+)載體中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)，并對(duì)重組菌種的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最后成功表達(dá)了PirA、PirB和PirAB重組蛋白。

誘導(dǎo)劑IPTG為乳糖類似物，不受細(xì)胞代謝的影響，但I(xiàn)PTG對(duì)E.coli生長(zhǎng)亦存在抑制作用，因此，在不影響融合蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上應(yīng)選用最小的劑量[12]。柴政斌等[13]發(fā)現(xiàn)，IPTG濃度對(duì)融合蛋白GST-PADI4的表達(dá)量無(wú)明顯影響，但可溶性目的蛋白的比例會(huì)隨著濃度的升高而增加。在本研究中，IPTG濃度為0時(shí)的PirB及PirAB表達(dá)量顯著低于濃度為0.01 mmol/L的表達(dá)量，其他濃度的IPTG對(duì)重組蛋白表達(dá)量影響較小。另外，相關(guān)研究表明，低溫誘導(dǎo)蛋白能促進(jìn)蛋白的正確折疊，從而得到較好的可溶性蛋白，但合成的速率較慢[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PirA、PirB和PirAB重組蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，不易形成包涵體，盡管不同誘導(dǎo)溫度對(duì)各重組蛋白的表達(dá)影響較小，但在30℃條件下，重組蛋白的表達(dá)比例最高。這一結(jié)果與葉彩燕[15]誘導(dǎo)表達(dá)VPAHPNDPirB蛋白的誘導(dǎo)溫度一致。

PirAB與蘇云金芽孢桿菌 (Bacillusthuringiensis，Bt)殺蟲(chóng)蛋白Cry具有較高的同源性，推測(cè)PirAB破壞宿主細(xì)胞的作用機(jī)制與Cry毒素較相似[16]。Lin等[17]的研究表明，在純化PirA和PirB單體的情況下，兩者相互結(jié)合的親合力較低，并提出了這兩種二元毒力復(fù)合物的異四聚體相互作用模型，認(rèn)為PirA和PirB蛋白在重組的情況下形成的PirA/PirB復(fù)合體才會(huì)具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且PirA/PirB的結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定。pirA和pirB基因位于毒力質(zhì)粒(pVA1)的同一個(gè)操縱子上[18]，理論上認(rèn)為，這兩個(gè)基因在共表達(dá)情況下才產(chǎn)生PirA和PirB毒素，此時(shí)這兩者的相互作用才具有較高的細(xì)胞毒力[19]。Yang等[5]將嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) HB310 的pirA基因去除終止密碼子后，通過(guò)柔性連接子linker與pirB基因連接重組并融合表達(dá)了PirAB-fusion蛋白，同時(shí)共表達(dá)了PirAB蛋白；經(jīng)針對(duì)大蠟螟(Galleriamellonella)的半數(shù)致死量(LD50)驗(yàn)證，共表達(dá)的PirAB蛋白生物活性比PirA/PirB重組蛋白混合物強(qiáng)，PirAB-fusion蛋白喪失了生物活性。在本研究中，在不去除PirA的終止密碼子的前提下，聯(lián)合表達(dá)pirA和pirB基因，得到的重組蛋白PirAB具有17 kDa的PirA蛋白和50 kDa的PirB蛋白，該聯(lián)合表達(dá)蛋白理論上具有較高的細(xì)胞毒性，可為后期抗體的研發(fā)提供技術(shù)資料。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在最適誘導(dǎo)條件和高效純化條件下獲得了小批量高純度的PirA、PirB重組蛋白，并首次共表達(dá)了VPAHPND的PirAB蛋白，SDS-PAGE電泳分析表明，表達(dá)的3種重組蛋白主要以可溶性形式存在，Western blot分析證實(shí)該重組蛋白質(zhì)具有良好的反應(yīng)原性。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步的抗體制備和致病機(jī)理研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料，為AHPND的防控研究提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。