戴煒辰，涂清波

（南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

銀杏葉是銀杏科植物銀杏（Ginkgo bilobaL.）的干燥葉，性平，味甘、苦、澀，歸心肺經(jīng)，具有斂肺平喘、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效。銀杏葉的主要成分為黃酮類和萜內(nèi)酯類[1]，而銀杏葉黃酮類化合物根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為單黃酮、雙黃酮和兒茶素等。其中，雙黃酮含量較高[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，銀杏葉雙黃酮具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌、神經(jīng)保護(hù)和心血管保護(hù)等作用[3]。目前，關(guān)于銀杏葉黃酮提取分離與純化工藝的研究較多[4]，但是對(duì)銀杏葉雙黃酮提取和純化工藝的研究很少。因此，本研究探索了表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取銀杏葉總黃酮的工藝，在此基礎(chǔ)上研究了雙黃酮的提取和純化工藝，為銀杏葉雙黃酮的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（TD10002型，天津天馬衡基儀器有限公司）；超聲清洗機(jī)（KQ-500B，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1100型，上海美譜達(dá)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-S1，金壇市醫(yī)療儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司]；高速離心機(jī)（H1850，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；Agilent 1220 Infinity LC（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、銀杏葉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）；纖維素酶（上海藍(lán)季生物）；醋酸鹽緩沖溶液（pH=3.5）；吐溫20、吐溫80、司盤(pán)80（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等均為分析純。

2 銀杏葉總黃酮的提取

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和總黃酮得率的計(jì)算

以蘆丁為標(biāo)樣，測(cè)定銀杏葉總黃酮含量。配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12、14、16 mL置于50 mL容量瓶中。分別加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，混勻，靜置6 min后，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，靜置6 min。分別再加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，以水定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以未吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[5]。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程：

式中：ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；N為樣品的稀釋倍數(shù)；m為銀杏葉粉末質(zhì)量，mg。

2.2 提取方法

銀杏葉中黃酮的提取一般采用超聲法[5]或酶解法[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在超聲輔助酶解法的基礎(chǔ)上加入表面活性劑，3項(xiàng)技術(shù)聯(lián)用可以極大地提高總黃酮得率。將新鮮銀杏葉低溫烘干，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，分別采用以下方法提取，結(jié)果如圖1所示。

（1）超聲提?。悍Q取2.0 g銀杏葉粉末，加入120 mL 70%乙醇溶液，40 ℃超聲提取40 min。過(guò)濾后，取一定量的濾液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

（2）酶解提?。悍Q取2.0 g銀杏葉粉末，置于50 mL容量瓶中，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液及15 mg纖維素酶，45 ℃酶解2 h，滅酶，用70%乙醇定容，提取后過(guò)濾。取一定量濾液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

（3）表面活性劑提取：稱取2.0 g銀杏葉粉末，加入20 mL蒸餾水，50 ℃浸提10 min后，加入0.4 g吐溫80繼續(xù)浸提20 min。過(guò)濾，取一定量提取液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

（4）表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取：稱取2.0 g銀杏葉粉末，加入10 mg纖維素酶、20 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取，10 min后加入0.4 g表面活性劑（分別為吐溫20、吐溫80和司盤(pán)80），繼續(xù)超聲20 min。過(guò)濾，取一定量提取液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

由圖1可知，相對(duì)于超聲提取和酶解提取，采用表面活性劑的銀杏葉總黃酮得率明顯提高，而表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取效果更好。分別選取3種常用的表面活性劑（吐溫20、吐溫80、司盤(pán)80），聯(lián)用超聲酶解法提取后發(fā)現(xiàn)，吐溫20作為表面活性劑的提取效果最佳。因此，選取吐溫20聯(lián)用超聲酶解法作為銀杏葉黃酮的提取方法。

圖1 不同提取法對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

2.3 銀杏葉總黃酮的提取工藝

銀杏葉黃酮提取采用表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法，分別考察表面活性劑用量、纖維素酶用量、料液比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，確定提取工藝條件。

2.3.1 表面活性劑用量的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末5份，各加入10 mg纖維素酶、20 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g吐溫20，繼續(xù)超聲20 min，過(guò)濾，取一定量提取液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)吐溫20的用量達(dá)到0.6 g，即質(zhì)量濃度為0.03 g/mL時(shí)，總黃酮得率最高；當(dāng)吐溫20的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，得率下降。

圖2 表面活性劑用量對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.2 纖維素酶用量的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末5份，分別加入2、6、10、14、18 mg纖維素酶，加入20 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20，繼續(xù)超聲20 min，過(guò)濾，取一定量提取液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)纖維素酶的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，總黃酮得率最高；當(dāng)纖維素酶的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，得率明顯下降。

圖3 纖維素酶用量對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.3 料液比的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末6份，各加入10 mg纖維素酶，分別加入20、40、60、80、100、120 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20，繼續(xù)超聲20 min，過(guò)濾，取一定量提取液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)料液比在1∶40～1∶50時(shí)，總黃酮得率較高。

圖4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.4 提取時(shí)間的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末6份，各加入10 mg纖維素酶、100 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20，分別超聲至總提取時(shí)間為30、40、50、60、70、80 min，過(guò)濾，取一定量提取液，定容，紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間為60～70 min時(shí)，總黃酮得率較高；當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，得率明顯下降。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

2.4 銀杏葉總黃酮的提取條件

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)可以得到優(yōu)化的提取條件：表面活性劑選用吐溫20，用量為0.03 g/mL；纖維素酶用量為0.5 mg/mL；料液比為1∶50；提取時(shí)間為70 min。最后確定的工藝總黃酮得率達(dá)到1.207%。采用表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取，不僅提高了銀杏葉總黃酮得率，也為雙黃酮的進(jìn)一步純化奠定了基礎(chǔ)。

3 銀杏葉雙黃酮的純化

銀杏葉雙黃酮的純化一般采用傳統(tǒng)的硅膠柱層析色譜法[7]，然而，大量雜質(zhì)或其他成分的干擾會(huì)使銀杏葉提取物經(jīng)柱層析后損失較多的雙黃酮。考慮到黃酮可以與硫酸鋅等絡(luò)合[8]，與部分雜質(zhì)分離，本研究嘗試采用金屬絡(luò)合法預(yù)處理銀杏葉提取液，發(fā)揮部分純化的作用，再進(jìn)行柱層析分離。通過(guò)比較雙黃酮的提取率與純度，對(duì)上述純化方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.1 銀杏葉雙黃酮純化方法

3.1.1 直接硅膠柱層析法

取50 mL銀杏葉提取液，用50 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，減壓干燥后以少量乙酸乙酯溶解，濕法上樣，以石油醚-乙酸乙酯（100∶1→1∶1）梯度洗脫，洗脫量為5～8倍柱體積。將收集的洗脫液減壓濃縮，得銀杏葉雙黃酮樣品。

3.1.2 金屬絡(luò)合聯(lián)合硅膠柱層析法

取100 mL銀杏葉提取液，加入0.5 g硫酸鋅，充分?jǐn)嚢柚练磻?yīng)完全后，邊攪拌邊滴加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至9。離心，收集沉淀，加入50 mL 50%乙醇，加入0.2 g乙二胺四乙酸鈉，于60 ℃水浴中振蕩反應(yīng)至沉淀完全溶解。減壓干燥，再加25 mL甲醇溶解，過(guò)濾，濾液減壓干燥，得到粗品。

精制：粗品以少量乙酸乙酯溶解，按照上述硅膠柱層析法得到銀杏葉雙黃酮樣品。

3.2 銀杏葉雙黃酮成分的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定上述樣品中雙黃酮的得率與純度。

（1）色譜條件：Kromasil C18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸（85.0∶15.0∶0.8）；流速：1.0 mL/h；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取2、4、8、12、16 mg銀杏葉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，放入50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，充分溶解后進(jìn)行液相檢測(cè)。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

（3）樣品的準(zhǔn)備：將銀杏葉提取液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣；上述兩種純化工藝所得樣品分別以甲醇溶解，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

3.3 結(jié)果與討論

按前述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，雙黃酮的出峰時(shí)間在4.5 min，根據(jù)峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出雙黃酮的純度及得率。由表1可知，采用金屬絡(luò)合聯(lián)合硅膠柱層析法所得樣品中，銀杏葉雙黃酮的得率和純度分別為0.18%和72.00%，相比直接柱層析法，損失較少，雙黃酮的純度也進(jìn)一步提高。

圖6 不同純化工藝下的液相色譜圖

表1 純化工藝及提取液中雙黃酮的得率和純度比較

4 結(jié)語(yǔ)

優(yōu)化了表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取銀杏葉總黃酮，表面活性劑選用0.03 g/mL吐溫20，纖維素酶用量為0.5 mg/mL，料液比為1∶50，提取時(shí)間為70 min，總黃酮的得率達(dá)到1.207%。在此基礎(chǔ)上，采用金屬絡(luò)合聯(lián)合硅膠柱層析法純化得到銀杏葉雙黃酮，純度得到大幅提升，得率也有所提升。此方法成本低、速度快，可為銀杏葉雙黃酮的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。