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        銀杏葉雙黃酮的提取及純化研究

        2022-02-09 13:35:14戴煒辰涂清波
        現(xiàn)代鹽化工 2022年6期
        關(guān)鍵詞:黃酮

        戴煒辰,涂清波

        (南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

        銀杏葉是銀杏科植物銀杏(Ginkgo bilobaL.)的干燥葉,性平,味甘、苦、澀,歸心肺經(jīng),具有斂肺平喘、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效。銀杏葉的主要成分為黃酮類和萜內(nèi)酯類[1],而銀杏葉黃酮類化合物根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為單黃酮、雙黃酮和兒茶素等。其中,雙黃酮含量較高[2]。現(xiàn)代藥理研究表明,銀杏葉雙黃酮具有多種生物活性,包括抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌、神經(jīng)保護(hù)和心血管保護(hù)等作用[3]。目前,關(guān)于銀杏葉黃酮提取分離與純化工藝的研究較多[4],但是對(duì)銀杏葉雙黃酮提取和純化工藝的研究很少。因此,本研究探索了表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取銀杏葉總黃酮的工藝,在此基礎(chǔ)上研究了雙黃酮的提取和純化工藝,為銀杏葉雙黃酮的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        1 儀器與試劑

        1.1 儀器

        電子天平(TD10002型,天津天馬衡基儀器有限公司);超聲清洗機(jī)(KQ-500B,昆山市超聲儀器有限公司);紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1100型,上海美譜達(dá)儀器有限公司);恒溫水浴鍋(HH-S1,金壇市醫(yī)療儀器廠);循環(huán)水式多用真空泵[SHZ-D(Ⅲ),上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司];高速離心機(jī)(H1850,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);Agilent 1220 Infinity LC(安捷倫科技有限公司)。

        1.2 試劑

        蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、銀杏葉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司);纖維素酶(上海藍(lán)季生物);醋酸鹽緩沖溶液(pH=3.5);吐溫20、吐溫80、司盤(pán)80(化學(xué)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等均為分析純。

        2 銀杏葉總黃酮的提取

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和總黃酮得率的計(jì)算

        以蘆丁為標(biāo)樣,測(cè)定銀杏葉總黃酮含量。配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12、14、16 mL置于50 mL容量瓶中。分別加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL,混勻,靜置6 min后,加入10%硝酸鋁溶液2 mL,搖勻,靜置6 min。分別再加入4%氫氧化鈉溶液20 mL,以水定容至刻度,搖勻,放置15 min后,以未吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[5]。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程:

        式中:ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣品溶液的體積,mL;N為樣品的稀釋倍數(shù);m為銀杏葉粉末質(zhì)量,mg。

        2.2 提取方法

        銀杏葉中黃酮的提取一般采用超聲法[5]或酶解法[6]。研究發(fā)現(xiàn),在超聲輔助酶解法的基礎(chǔ)上加入表面活性劑,3項(xiàng)技術(shù)聯(lián)用可以極大地提高總黃酮得率。將新鮮銀杏葉低溫烘干,用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩,分別采用以下方法提取,結(jié)果如圖1所示。

        (1)超聲提?。悍Q取2.0 g銀杏葉粉末,加入120 mL 70%乙醇溶液,40 ℃超聲提取40 min。過(guò)濾后,取一定量的濾液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

        (2)酶解提?。悍Q取2.0 g銀杏葉粉末,置于50 mL容量瓶中,加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液及15 mg纖維素酶,45 ℃酶解2 h,滅酶,用70%乙醇定容,提取后過(guò)濾。取一定量濾液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

        (3)表面活性劑提取:稱取2.0 g銀杏葉粉末,加入20 mL蒸餾水,50 ℃浸提10 min后,加入0.4 g吐溫80繼續(xù)浸提20 min。過(guò)濾,取一定量提取液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

        (4)表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取:稱取2.0 g銀杏葉粉末,加入10 mg纖維素酶、20 mL蒸餾水,50 ℃超聲提取,10 min后加入0.4 g表面活性劑(分別為吐溫20、吐溫80和司盤(pán)80),繼續(xù)超聲20 min。過(guò)濾,取一定量提取液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率。

        由圖1可知,相對(duì)于超聲提取和酶解提取,采用表面活性劑的銀杏葉總黃酮得率明顯提高,而表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取效果更好。分別選取3種常用的表面活性劑(吐溫20、吐溫80、司盤(pán)80),聯(lián)用超聲酶解法提取后發(fā)現(xiàn),吐溫20作為表面活性劑的提取效果最佳。因此,選取吐溫20聯(lián)用超聲酶解法作為銀杏葉黃酮的提取方法。

        圖1 不同提取法對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

        2.3 銀杏葉總黃酮的提取工藝

        銀杏葉黃酮提取采用表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法,分別考察表面活性劑用量、纖維素酶用量、料液比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響,確定提取工藝條件。

        2.3.1 表面活性劑用量的確定

        稱取2.0 g銀杏葉粉末5份,各加入10 mg纖維素酶、20 mL蒸餾水,50 ℃超聲提取10 min后分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g吐溫20,繼續(xù)超聲20 min,過(guò)濾,取一定量提取液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)吐溫20的用量達(dá)到0.6 g,即質(zhì)量濃度為0.03 g/mL時(shí),總黃酮得率最高;當(dāng)吐溫20的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí),得率下降。

        圖2 表面活性劑用量對(duì)總黃酮得率的影響

        2.3.2 纖維素酶用量的確定

        稱取2.0 g銀杏葉粉末5份,分別加入2、6、10、14、18 mg纖維素酶,加入20 mL蒸餾水,50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20,繼續(xù)超聲20 min,過(guò)濾,取一定量提取液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,當(dāng)纖維素酶的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),總黃酮得率最高;當(dāng)纖維素酶的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí),得率明顯下降。

        圖3 纖維素酶用量對(duì)總黃酮得率的影響

        2.3.3 料液比的確定

        稱取2.0 g銀杏葉粉末6份,各加入10 mg纖維素酶,分別加入20、40、60、80、100、120 mL蒸餾水,50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20,繼續(xù)超聲20 min,過(guò)濾,取一定量提取液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,當(dāng)料液比在1∶40~1∶50時(shí),總黃酮得率較高。

        圖4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

        2.3.4 提取時(shí)間的確定

        稱取2.0 g銀杏葉粉末6份,各加入10 mg纖維素酶、100 mL蒸餾水,50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20,分別超聲至總提取時(shí)間為30、40、50、60、70、80 min,過(guò)濾,取一定量提取液,定容,紫外測(cè)定吸光度并計(jì)算得率,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,當(dāng)提取時(shí)間為60~70 min時(shí),總黃酮得率較高;當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí),得率明顯下降。

        圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

        2.4 銀杏葉總黃酮的提取條件

        根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)可以得到優(yōu)化的提取條件:表面活性劑選用吐溫20,用量為0.03 g/mL;纖維素酶用量為0.5 mg/mL;料液比為1∶50;提取時(shí)間為70 min。最后確定的工藝總黃酮得率達(dá)到1.207%。采用表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取,不僅提高了銀杏葉總黃酮得率,也為雙黃酮的進(jìn)一步純化奠定了基礎(chǔ)。

        3 銀杏葉雙黃酮的純化

        銀杏葉雙黃酮的純化一般采用傳統(tǒng)的硅膠柱層析色譜法[7],然而,大量雜質(zhì)或其他成分的干擾會(huì)使銀杏葉提取物經(jīng)柱層析后損失較多的雙黃酮。考慮到黃酮可以與硫酸鋅等絡(luò)合[8],與部分雜質(zhì)分離,本研究嘗試采用金屬絡(luò)合法預(yù)處理銀杏葉提取液,發(fā)揮部分純化的作用,再進(jìn)行柱層析分離。通過(guò)比較雙黃酮的提取率與純度,對(duì)上述純化方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

        3.1 銀杏葉雙黃酮純化方法

        3.1.1 直接硅膠柱層析法

        取50 mL銀杏葉提取液,用50 mL二氯甲烷萃取3次,合并萃取液,減壓干燥后以少量乙酸乙酯溶解,濕法上樣,以石油醚-乙酸乙酯(100∶1→1∶1)梯度洗脫,洗脫量為5~8倍柱體積。將收集的洗脫液減壓濃縮,得銀杏葉雙黃酮樣品。

        3.1.2 金屬絡(luò)合聯(lián)合硅膠柱層析法

        取100 mL銀杏葉提取液,加入0.5 g硫酸鋅,充分?jǐn)嚢柚练磻?yīng)完全后,邊攪拌邊滴加NaOH溶液,調(diào)節(jié)pH至9。離心,收集沉淀,加入50 mL 50%乙醇,加入0.2 g乙二胺四乙酸鈉,于60 ℃水浴中振蕩反應(yīng)至沉淀完全溶解。減壓干燥,再加25 mL甲醇溶解,過(guò)濾,濾液減壓干燥,得到粗品。

        精制:粗品以少量乙酸乙酯溶解,按照上述硅膠柱層析法得到銀杏葉雙黃酮樣品。

        3.2 銀杏葉雙黃酮成分的測(cè)定

        采用高效液相色譜法測(cè)定上述樣品中雙黃酮的得率與純度。

        (1)色譜條件:Kromasil C18色譜柱(150.0 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水-乙酸(85.0∶15.0∶0.8);流速:1.0 mL/h;檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

        (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取2、4、8、12、16 mg銀杏葉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品,放入50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,充分溶解后進(jìn)行液相檢測(cè)。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。

        (3)樣品的準(zhǔn)備:將銀杏葉提取液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣;上述兩種純化工藝所得樣品分別以甲醇溶解,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

        3.3 結(jié)果與討論

        按前述色譜條件進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,雙黃酮的出峰時(shí)間在4.5 min,根據(jù)峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出雙黃酮的純度及得率。由表1可知,采用金屬絡(luò)合聯(lián)合硅膠柱層析法所得樣品中,銀杏葉雙黃酮的得率和純度分別為0.18%和72.00%,相比直接柱層析法,損失較少,雙黃酮的純度也進(jìn)一步提高。

        圖6 不同純化工藝下的液相色譜圖

        表1 純化工藝及提取液中雙黃酮的得率和純度比較

        4 結(jié)語(yǔ)

        優(yōu)化了表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取銀杏葉總黃酮,表面活性劑選用0.03 g/mL吐溫20,纖維素酶用量為0.5 mg/mL,料液比為1∶50,提取時(shí)間為70 min,總黃酮的得率達(dá)到1.207%。在此基礎(chǔ)上,采用金屬絡(luò)合聯(lián)合硅膠柱層析法純化得到銀杏葉雙黃酮,純度得到大幅提升,得率也有所提升。此方法成本低、速度快,可為銀杏葉雙黃酮的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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