馮連榮，宋立志，趙大根，矯麗曼

（遼寧省楊樹(shù)研究所，遼寧 蓋州 115213）

新林1號(hào)楊（PopulusבXinlin 1’）是國(guó)有新民市機(jī)械林場(chǎng)培育的楊樹(shù)品種，屬于黑楊派與青楊派的雜交種[1]，樹(shù)干通直，樹(shù)冠冠形圓滿，樹(shù)枝多而密，雄株，無(wú)飛絮，2015年9月通過(guò)遼寧省林木良種委員會(huì)被審定為楊樹(shù)良種，2016年10月取得了林木良種生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)許可證。與意大利214楊（P.×euramericana cv.‘I-214’）、蓋 楊（P.×gaixianensis）、107楊（P.×euramericana cv.‘Neva’）和108楊（P.×euramericana cv.‘Guariento’）相比，其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯且抗逆性較強(qiáng)[2]，目前在遼寧省內(nèi)沈陽(yáng)、錦州、葫蘆島等地被大面積推廣，推廣效果良好，是纖維材、膠合板材等原料林重要造林品種，也是重要的防護(hù)林造林品種之一[1]。

新林1號(hào)楊1年生扦插盆栽苗在溫室內(nèi)培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其中1株盆栽苗葉片上出現(xiàn)圓形病斑，為鑒定引起該病斑的病原菌種類，于室內(nèi)進(jìn)行了病原菌菌種分離，并利用rDNA-ITS序列分析進(jìn)行了分子鑒定，為下一步研究該病原菌致病機(jī)理及防治方法等奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 植物材料

新林1號(hào)楊（PopulusבXinlin1’）1年生扦插盆栽苗，置于25℃人工智能溫室內(nèi)培養(yǎng)，空氣濕度70%~80%。

1.2 酶和試劑

TaKaRa Ex Taq、DL2000 Marker購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司、TIANGEN植物快捷型DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司；引物ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4：TC CTCCGCTTATTGATATGC，引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.3 菌種分離

將采集的新林1號(hào)楊病葉于超凈工作臺(tái)中按下列步驟進(jìn)行菌種分離：無(wú)菌水清洗病葉3遍，75%酒精消毒2 min，無(wú)菌水漂洗3次，0.1%HgCl消毒2 min，無(wú)菌水漂洗3次，剪取病健交界處葉片組織約0.5 cm2接種至PDA固體平板培養(yǎng)基中。每個(gè)平板接種2塊，置于25℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。待菌落直徑為2 cm左右時(shí)，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接、純化，將純化后的菌株命名為XL-1，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則，采用離體葉片接種，以菌絲塊作為接種材料進(jìn)行致病性測(cè)定。4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。取健康的新林1號(hào)楊中上部葉片，葉柄末端用浸水脫脂棉包裹，葉片表面用75%酒精擦拭消毒后，將菌餅放置在主脈兩側(cè)葉片上，每側(cè)放置一個(gè)菌餅，對(duì)照處理接種PDA培養(yǎng)基塊，將處理后的葉片放置在直徑為11 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，滴1 mL無(wú)菌水進(jìn)行保濕，25℃條件下培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，從發(fā)病部位進(jìn)行再次分離，通過(guò)柯赫氏法則以驗(yàn)證分離菌株是否為病原菌。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，無(wú)菌刀片刮取平板菌絲，經(jīng)液氮速凍后進(jìn)行研磨，用TIANGEN快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）進(jìn)行DNA提取，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的DNA用TE Buffer溶解于－20℃保存?zhèn)溆?，并利用DHS NanoPro測(cè)定DNA濃度。以DNA為模板進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及應(yīng)程序見(jiàn)馮連榮[3]。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物送至TaKaRa（大連）生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列BLAST比對(duì)分析。下載相似性序列，用Clustalw進(jìn)行多序列比對(duì)，并輔以人工修正，分析時(shí)所有參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。利用MEGA7.0軟件采用N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建發(fā)育樹(shù)時(shí)進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 純種菌絲的獲得

經(jīng)過(guò)組織分離及轉(zhuǎn)接，獲得了XL-1純種菌絲，菌落特征見(jiàn)圖1，菌落平展邊緣整齊，菌絲絮狀、灰白色，后期變?yōu)榛液稚?，不產(chǎn)生色素。菌絲生長(zhǎng)速度較快，5 d左右可以長(zhǎng)滿整個(gè)平板。

圖1 XL-1菌落正、反特征Fig.1 Positive and negative characteristics of XL-1 colony

2.2 XL-1致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果（圖2）顯示,接種PDA培養(yǎng)基的對(duì)照組未產(chǎn)生病斑，接種XL-1菌餅的處理組發(fā)病，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)病斑面積逐漸增大：接種后第2天，菌餅邊緣長(zhǎng)出菌絲，菌餅覆蓋處葉片組織出現(xiàn)小病斑，病斑直徑約1 cm；第3天病斑面積增大且菌絲透過(guò)葉片生長(zhǎng)；第5天葉片表面出現(xiàn)大量霉層，第6天霉層布滿整個(gè)葉片。對(duì)病斑組織再次進(jìn)行病原菌分離獲得相同菌絲，證明新林1號(hào)楊葉部病斑由XL-1引起。

圖2 XL-1致病性測(cè)定Fig.2 Determination of pathogenicity of XL-1

2.3 XL-1分子生物學(xué)鑒定

提取XL-1菌絲DNA，利用DHS NanoPro測(cè)定DNA濃度為68.953 ng·μL-1，A260/A280為1.96。DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶單一明亮（圖3A），證明DNA質(zhì)量較好。以DNA為模板，ITS1/ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得大小約為500 bp的目的條帶（圖3B）。PCR產(chǎn)物送至TaKaRa（大連）生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示目的片段

行BLAST序列比對(duì)，獲得的相似序列均為Botrytis屬真菌，大多數(shù)為B.cinerea和B.fabae，其中與登陸號(hào)為MH212236.1的B.cinerea覆蓋度為100%，相似性為100%。下載排名靠前的B.cinerea和B.fabae序列，利用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖4），XL-1與B.cinerea聚為一支，親緣關(guān)系較近。另外通過(guò)GenBnak下載Botrytis屬標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS序列，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（圖5），結(jié)果顯示XL-1同樣與B.cinerea聚為一支，故將XL-1鑒定為B.cinerea（灰葡萄孢）?；移咸焰邽榻z孢綱（Hyphomycetes）叢梗孢目（Miniliales）叢梗孢科（Moniliaceae）葡萄孢屬（Botrytis）。

3 結(jié)論與討論

圖3 DNA電泳結(jié)果Fig.3 Results of DNA electrophoresis

圖4 基于ITS序列N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Construction of phylogenetic tree based on ITS gene using N-J method

圖5 基于N-J法構(gòu)建XL-1與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Construction of phylogenetic tree of XL-1 and standard strains based on N-J method

楊樹(shù)是遼寧省平原地區(qū)的主要造林樹(shù)種，在防護(hù)林和用材林的建設(shè)中均占有重要地位，具有防風(fēng)固沙、水土保持、農(nóng)田防護(hù)、固碳釋氧、凈化空氣等作用，同時(shí)還承擔(dān)著產(chǎn)業(yè)建設(shè)的重任，為社會(huì)提供大量木材，解決木材短缺、供給不足的問(wèn)題[1]。在楊樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)受到各種病原菌的侵染，其中葉部病害較為常見(jiàn)，如楊樹(shù)黑斑病[4]、楊葉銹病[5-6]、楊樹(shù)葉枯病[7-8]等，目前關(guān)于楊樹(shù)灰霉病的研究報(bào)道還比較少。楊樹(shù)灰霉病主要危害楊樹(shù)的莖和葉，在新植楊樹(shù)中發(fā)生較重，影響楊樹(shù)生長(zhǎng)，降低了造林成活率，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致楊樹(shù)大面積死亡[9-10]。段冰冰研究表明Del/Ros基因在新疆楊（P.alba var.pyramidalis）的株系過(guò)表達(dá)，可顯著提高新疆楊葉片中的丹寧、花青素、槲皮素、山奈酚以及總酚等黃酮類物質(zhì)的含量，進(jìn)一步提高了其對(duì)灰霉病的抗病能力[9]。吉海龍研究了長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）T05對(duì)灰霉病菌的抑菌活性，菌落對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果顯示T05對(duì)灰霉病菌抑菌率達(dá)88.4%，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉病菌抑菌率達(dá)91.9%[10]。

灰霉菌又稱灰葡萄孢菌，是一種廣寄主性的、能夠引起多種植物幼苗、果實(shí)及儲(chǔ)藏器官的猝倒、落葉、花腐、爛果及爛窖的病源菌[11]。潮濕時(shí)病部表層產(chǎn)生大量的灰色霉層（分生孢子梗和分生孢子），稱為灰霉病?；移咸焰弑徽J(rèn)為是新鮮水果蔬菜中最重要的采后病原菌之一，也被認(rèn)為是全球范圍第二重要的植物病原菌[12-13]。它對(duì)各種重要經(jīng)濟(jì)作物的災(zāi)難性影響，造成全球每年100億~1000億美元不等的經(jīng)濟(jì)損失[14]。在葡萄（Vitis viniferax×V.labrusca'Shuijing'）[15]、番茄（Solanumlyco persicum）[16]、草莓（Fragaria×ananassa）[17]、人參（Panax ginseng）[18]、煙草（Nicotiana tabacum）[19]、藍(lán)莓（Vaccinium spp.）[20]、浙貝母（Fritillaria thunbergii）[21]中均有報(bào)道。對(duì)于灰霉病菌的鑒定，一般基于形態(tài)特征并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定來(lái)完成。形態(tài)特征一般從菌落形態(tài)、菌絲體、分生孢子及分生孢子梗等方面進(jìn)行初步鑒定；分子生物技術(shù)鑒定應(yīng)用最為廣泛的是rDNA-ITS序列分析，如應(yīng)用rDNA-ITS序列分析對(duì)蝴 蝶 蘭（Phalaenopsis amabilis）[22]、香 蔥（Allium ascalonicum）[23]、煙草[24]、番茄[25]等灰霉病的鑒定。在真核生物基因組的編碼核糖體基因中有5SrDNA、5.8SrDNA、18SrDNA和28SrDNA這樣4種，其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，其中的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）,包括ITS1及ITS2兩部分[26]。ITS序列通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索比對(duì),序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬；序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種[27]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的基因被應(yīng)用于病原真菌的鑒定，如甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)、組蛋白（Histone）、翻譯延伸因子1-α（Elongation factor，EF1-α）、微管蛋白(β-tubulin，BT1和BT2)、幾丁質(zhì)合成酶(chitin synthase，CHS)等[28-29]。

本研究從新林1號(hào)楊1年生扦插苗上分離獲得一種引起葉部病害的病原菌XL-1，結(jié)合病原菌菌落形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析對(duì)病原菌種屬地位進(jìn)行了鑒定，其中與登陸號(hào)為MH212236.1的B.cinerea覆蓋度為100%，相似性為100%，系統(tǒng)發(fā)育分析與B.cinerea聚為一支，雖然未進(jìn)行多基因聯(lián)合分析，從比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析可以確定分離病原菌為灰葡萄孢（B.cinerea）。該病原菌侵染楊樹(shù)葉片后可迅速蔓延，導(dǎo)致整個(gè)葉片發(fā)霉腐爛，嚴(yán)重影響楊樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育。下一步需要針對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性、病原菌對(duì)不同楊樹(shù)品種的致病能力和致病機(jī)理以及防治方法等進(jìn)行深入研究，提出楊樹(shù)灰霉病綜合防治方法，以減輕其對(duì)楊樹(shù)的危害。