夏詩(shī)琪，歐陽(yáng)天林，溫 強(qiáng)，周成釧，樓浙輝，宋 穎,3，劉麗婷★

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西省林業(yè)科技實(shí)驗(yàn)中心，江西 贛州 341600；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)·林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

花櫚木(Ormosia henryi)為豆科(Leguminosae)紅豆屬(Ormosia)常綠喬木，在中國(guó)屬珍貴樹(shù)種，多生于亞熱帶地區(qū)的低海拔常綠闊葉林中?；澳緲?shù)形優(yōu)美，樹(shù)姿挺拔，是優(yōu)良的園林綠化或防火樹(shù)種?；澳具m合材用，其木質(zhì)細(xì)膩，紋理精美。在藥用價(jià)值方面，其全株均可入藥，具有治療抑郁、鎮(zhèn)定安神等多種功效[1-2]。近年來(lái)，由于人類(lèi)對(duì)花櫚木資源的不合理開(kāi)發(fā)利用，花櫚木的野生資源已處于瀕危狀態(tài)，同時(shí)因其種子種皮致密堅(jiān)硬，不易萌芽，自然繁殖能力較弱，當(dāng)前花櫚木的野外種群數(shù)量銳減[3]，現(xiàn)已被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，國(guó)內(nèi)外對(duì)花櫚木的研究多集中在種苗擴(kuò)繁、藥效分析[4-5]、遺傳分析、資源分布及評(píng)價(jià)[6-8]等領(lǐng)域，在遺傳特性方面的研究還較少。為進(jìn)一步對(duì)花櫚木群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域開(kāi)展研究，發(fā)掘、保護(hù)和利用其遺傳資源，有必要開(kāi)展花櫚木基因組的研究。

基因組大小(DNA C值)是一個(gè)評(píng)價(jià)生物單倍體細(xì)胞核DNA含量的關(guān)鍵指標(biāo)[9]，基因組特征研究是植物基因資源開(kāi)發(fā)和分子機(jī)制研究的前提[10-11]。目前測(cè)定基因組大小的方法主要有流式細(xì)胞術(shù)和基于K-mer分析的基因組Survey測(cè)序。流式細(xì)胞術(shù)常用于評(píng)估基因組大小及倍性水平，基因組Survey測(cè)序具有速度快且數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。近年來(lái)，基于流式細(xì)胞術(shù)及Genome Survey技術(shù)的豆科植物基因組研究已逐漸開(kāi)展，但多集中在草本植物，如大豆(Glycine max)、綠豆(Vigna radiata)、苜蓿(Medicago sativa)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)等均已完成了全基因測(cè)序[14]，對(duì)豆科中木本植物的基因組研究還較少。本研究以花櫚木為材料，采取流式細(xì)胞術(shù)和基于K-mer分析的基因組Survey測(cè)序兩種方法，估測(cè)花櫚木基因組大小，并獲得基本特征信息，以期為花櫚木的系統(tǒng)進(jìn)化和基因資源開(kāi)發(fā)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

花櫚木樣品采自江西省林業(yè)科學(xué)院苗圃，取健康花櫚木植株的新鮮葉片，經(jīng)液氮速凍后置于－80℃超低溫冰箱保存，備用。內(nèi)參植物為豌豆（Pisum sativum）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞核懸浮液制備

細(xì)胞核懸浮液的制備是流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)。取0.8 mL mGb解離液進(jìn)行預(yù)冷，加入1 g待測(cè)花櫚木樣品并迅速垂直切碎其組織，使之與解離液充分接觸。靜置10 min后用400目濾網(wǎng)過(guò)濾至離心管中，經(jīng)離心后棄上清液，收集細(xì)胞核沉淀再加入200μL解離液即得到細(xì)胞核懸浮液。選用非特異染料碘化丙啶(propidium iodide,PI)對(duì)細(xì)胞核DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，在暗處染色20 min后備用。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

單獨(dú)測(cè)定內(nèi)參植物和待測(cè)植物的熒光峰強(qiáng)度，并以此為依據(jù)，調(diào)整二者的混合比例，使共進(jìn)樣品時(shí)兩種植物細(xì)胞核濃度一致，然后進(jìn)行檢測(cè)。利用BD FACScalibur流式細(xì)胞儀對(duì)染色后的細(xì)胞核懸浮液樣品上機(jī)檢測(cè)，電壓為290 V，采用488 nm藍(lán)光激發(fā)，檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度，每次檢測(cè)收集參數(shù)設(shè)定為10 000。變異系數(shù)(coeffcient of variation,CV)需要控制在5%以?xún)?nèi)[15]。使用Modifit 3.0分析軟件作圖分析。

1.2.3 基因組大小計(jì)算

PI染色時(shí)，其嵌入量與DNA含量呈正比，因?qū)φ諛悠返幕蚪M大小已知，根據(jù)待測(cè)植物與內(nèi)參植物的熒光比值即可測(cè)定待測(cè)植物的DNA含量。計(jì)算公式為：待測(cè)植物DNA含量=內(nèi)參植物DNA含量×待測(cè)植物的熒光強(qiáng)度/內(nèi)參植物的熒光強(qiáng)度。觀(guān)察花櫚木和豌豆PI-DNA復(fù)合體的熒光峰值，得出二者DNA含量的比值，再與豌豆的C值相乘，即可計(jì)算出花櫚木的C值。

1.2.4 基因組DNA提取與建庫(kù)測(cè)序

采用改良CTAB法進(jìn)行花櫚木基因組DNA提取，DNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，經(jīng)Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷，構(gòu)建插入片段為400 bp的DNA文庫(kù)，在Illumina Hiseq X-ten上進(jìn)行雙末端(Paired-End)測(cè)序，經(jīng)SOAP nuke v1.6.5軟件質(zhì)控過(guò)濾后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)，利用SOAP de novo進(jìn)行數(shù)據(jù)組裝，采用模擬數(shù)據(jù)擬合的方法評(píng)估基因組雜合率，用CASAVA軟件對(duì)原始圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別。

1.2.5 基因組大小預(yù)測(cè)和雜合度估計(jì)

將測(cè)序所得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于K-mer分析，K-mer是從測(cè)序數(shù)據(jù)中提取出的長(zhǎng)度為K的寡聚核苷酸序列[16]。本研究取K=41進(jìn)行分析，對(duì)序列進(jìn)行頻率作圖，得到K-mer分布曲線(xiàn)，根據(jù)公式計(jì)算基因組大?。ɑ蚪M大小=K-mer總數(shù)/K-mer期望深度）?；蚪M重復(fù)序列比例根據(jù)K-mer曲線(xiàn)分布圖的拖尾現(xiàn)象評(píng)估，基因組的雜合率通過(guò)雜合峰值/純合峰值來(lái)確定。

1.2.6 樣品污染評(píng)估

樣品污染問(wèn)題在基因組研究中有著決定性的地位[17]，在開(kāi)展基因組調(diào)查前，需查明所提取的樣品DNA是否存在污染物種。本研究中，對(duì)過(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)隨機(jī)抽取10 000條reads(read1和read2各5 000條)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Blast軟件與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NT庫(kù))進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算與NT庫(kù)比對(duì)上的reads占總reads數(shù)目的比例，查看比對(duì)上的物種是否為樣本的近緣物種，以此判斷樣品有無(wú)污染。在NT庫(kù)比對(duì)結(jié)果中，若為同源比對(duì)，則認(rèn)為樣品材料未被污染。

1.2.7 GC含量分布分析

物種GC（堿基對(duì)）含量是評(píng)估調(diào)研圖分析準(zhǔn)確性和后續(xù)基因組精細(xì)組裝難度的重要指標(biāo)之一[18]。利用contigs覆蓋深度分布與GC含量分布構(gòu)建GCdepth關(guān)聯(lián)圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定花櫚木基因組大小

使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定物種基因組大小時(shí)，常使用內(nèi)參法。本研究以已知基因組大小的豌豆(基因組大小為4.45 Gb)為內(nèi)參植物，進(jìn)行細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)，估算花櫚木的基因組大小。同時(shí)對(duì)豌豆和花櫚木的PI發(fā)射熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定分析，得到圖1。由圖1可知，豌豆和花櫚木所呈現(xiàn)的峰在形狀上均尖而細(xì)，碎片背景也非常少，二者測(cè)定峰的位置沒(méi)有重疊干擾，保證了用豌豆做內(nèi)參的準(zhǔn)確性。經(jīng)2次重復(fù)測(cè)定，得到花櫚木與內(nèi)參植物豌豆熒光強(qiáng)度的比值，由此測(cè)算得到花櫚木的基因組大小為2.99 Gb和3.01 Gb(表1)。

圖1 花櫚木流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fig.1 Flow cytometry detection of Ormosia henryi

表1 花櫚木基因組測(cè)定Tab.1 O.henryi genomic assay

2.2 Genome Survey測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量評(píng)估

基于Illumina Hiseq平臺(tái)進(jìn)行雙PE150測(cè)序，獲得花櫚木reads數(shù)量190 771 231對(duì)，共57.23 Gb原始數(shù)據(jù)(表2)。以Q20與Q30為指標(biāo)衡量測(cè)序質(zhì)量，其中，Q20比率為96.47%、Q30比率為90.68%，測(cè)序錯(cuò)誤率正常(＜0.05%)。

表2 花櫚木測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Sequencing data statistics of O.henryi

2.3 K-mer分析以及基因組大小估計(jì)

利用K-mer的分析方法來(lái)預(yù)測(cè)花櫚木基因組的大小、雜合率和重復(fù)序列等基因組特征。當(dāng)取K=41時(shí)，得到其K-mer的頻率分布情況(圖2)，K-mer曲線(xiàn)在depth=28附近出現(xiàn)主峰，經(jīng)計(jì)算后得到花櫚木基因組大小為3.05 Gb，修正后為3.01 Gb。由圖2可知，K-mer分布曲線(xiàn)出現(xiàn)較為明顯的拖尾現(xiàn)象。根據(jù)Kmer的深度分布，估計(jì)重復(fù)序列比率為82.23%，以雜合峰值與純合峰值的比值計(jì)算得到花櫚木基因組雜合率為1.04%。利用SOAP de novo軟件預(yù)測(cè)得到Kmer總數(shù)為85 418 954 938(表3)。

圖2 K-me r17的分布頻率Fig.2 Distribution frequency of K-mer17

表3 基因組特征統(tǒng)計(jì)Tab.3 Feature statistics of genome sequences

2.4 基因組數(shù)據(jù)初步組裝

利用SOAP de novo軟件對(duì)花櫚木有效基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行初步組裝和拼接，本研究K-mer值取41得到最佳拼接效果(表4)，共獲得4 066 523條contigs，基因組總長(zhǎng)度為1 343 713 339 bp，最長(zhǎng)的contig長(zhǎng)度為54 197 bp，N50長(zhǎng)度為656 bp，N90長(zhǎng)度為127 bp。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步組裝得到3 866 097條scaffolds，拼接總長(zhǎng)度為1 364 689 951 bp，最長(zhǎng)序列為59 305 bp，N50為762 bp，N90為130 bp。

表4 基因組組裝統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics of outcome of genome assembly

2.5 樣品污染評(píng)估——核苷酸比對(duì)結(jié)果

隨機(jī)選取10 000條單端reads，與NT庫(kù)BLAST比對(duì)，核苷酸比對(duì)結(jié)果顯示(表5)，比對(duì)率最高的6個(gè)物種均為豆科不同屬物種，大豆、黃羽扇豆（Lupinus luteus）、鷹嘴豆、百脈根（Lotus corniculatus）、水黃皮（Millettia pinnata）、蠶豆（Vicia faba），表明此研究中的樣品不存在污染，可正常用于后續(xù)分析。

表5 原始數(shù)據(jù)文庫(kù)與NT庫(kù)比對(duì)Tab.5 Blast of raw date with NT database

2.6 GC含量分布分析

針對(duì)組裝的contigs統(tǒng)計(jì)GC含量，并進(jìn)行了GC含量與測(cè)序深度的關(guān)聯(lián)分析(圖3)，結(jié)果表明，GC含量主要集中在40%，沒(méi)有明顯的GC偏向性，GCdepth散點(diǎn)未出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，說(shuō)明未出現(xiàn)外源污染情況，不影響后續(xù)的拼接和注釋。經(jīng)計(jì)算分析，得到花櫚木基因組GC含量為37.17%。

圖3 GC-depth分布Fig.3 The distribution of GC-depth

3 結(jié)論與討論

基因組大小是物種最基礎(chǔ)的基因多樣性特征參數(shù)，指一個(gè)物種單倍體基因組的DNA含量[19]。每個(gè)物種都有其獨(dú)特的C值，通過(guò)測(cè)定物種基因組大小，可以對(duì)物種全基因組測(cè)序、物種鑒定、系統(tǒng)分類(lèi)及進(jìn)化、遺傳資源挖掘與保護(hù)等方面的研究提供參考和理論依據(jù)[20-21]。目前基因組大小的測(cè)定方法主要有基因組調(diào)查測(cè)序法、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、孚耳根微顯影技術(shù)、Feulgen染色圖像密度分析等[22-23]。其中基于K-mer分析的Genome Survey是一種更高效、準(zhǔn)確的方法，能夠在開(kāi)展全基因組測(cè)序工作之前，對(duì)目標(biāo)物種基因組特征進(jìn)行估測(cè)，進(jìn)而可為后續(xù)全基因組測(cè)序策略選擇提供數(shù)據(jù)參考[23-24]。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)由于具有操作快捷簡(jiǎn)便、分辨率和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，也被廣泛運(yùn)用于物種染色體倍性及核型分析、基因組大小測(cè)定、種質(zhì)鑒定等研究[15-16]。

在使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)基因組大小進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其準(zhǔn)確性直接受樣品處理、對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)選擇、流式測(cè)定條件、熒光染料種類(lèi)、濃度及染色時(shí)間等因素影響[25]。本研究中，使用PI進(jìn)行DNA特異性染色，PI的吸光波長(zhǎng)為480～580 nm，熒光波長(zhǎng)為623 nm，采用波長(zhǎng)為488 nm的藍(lán)光激發(fā)，其與PI的最大激發(fā)波長(zhǎng)相一致，由此可以保證流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定基因組大小的準(zhǔn)確度。本研究經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)后得到的直方圖分辨率高、峰圖平滑且完整，表明以PI作為熒光染料測(cè)定花櫚木基因組大小可行，結(jié)果具有參考價(jià)值。Genome Survey分析中，BLAST結(jié)果亦未發(fā)現(xiàn)其他科樹(shù)種或動(dòng)物類(lèi)、微生物類(lèi)的高比率情況，表明此研究中的樣品不存在污染，可正常用于后續(xù)分析。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，目前已有多種豆科草本植物的全基因組被解析，如大豆、豌豆、紫花苜蓿（Medicago sativa）、蠶豆、綠豆和蒺藜（Tribulus terrestris）、苜蓿等作物，在遺傳學(xué)和基因組學(xué)方面已建立模式系統(tǒng)，為豆科生物學(xué)研究提供了一定的基礎(chǔ)理論指導(dǎo)?；澳緸槎箍萍t豆屬樹(shù)種，目前對(duì)豆科木本植物參考基因組的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)花櫚木基因組大小進(jìn)行測(cè)定，所得的基因組大小為2.99 Gb和3.01 Gb。在此基礎(chǔ)上，利用了基于Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)的K-mer分析技術(shù)進(jìn)一步測(cè)定及驗(yàn)證，得到花櫚木的基因組大小為3.01 Gb，與前者所得基本一致。兩種方法結(jié)合使用對(duì)花櫚木基因組進(jìn)行分析與評(píng)估，獲得基因組的大小、重復(fù)序列、GC含量等信息，提高了研究的可靠性，使所得結(jié)果更全面、準(zhǔn)確。

通常情況下，當(dāng)GC含量處于25%~65%時(shí)，分析結(jié)果可信度較高[26]。本研究中，花櫚木的基因組GC含量為37.17%，無(wú)明顯偏性，說(shuō)明測(cè)序中不含有污染，結(jié)果可靠。重復(fù)序列比例為82.23%，雜合率高達(dá)1.04%，表明該基因組為高重復(fù)高雜合基因組。為了進(jìn)一步獲得高質(zhì)量的全基因組圖譜，后續(xù)研究策略可考慮結(jié)合三代測(cè)序PacBio和Illumina測(cè)序平臺(tái)，輔以高通量染色體構(gòu)象捕獲(Hi-C)技術(shù)及相應(yīng)的拼接組裝軟件進(jìn)行基因組的組裝，以完成花櫚木全基因組的測(cè)序研究。