李少麗 ， 尹忠良 ， 胡曉鳳 ， 康 斌 ， 王家福

(杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司 ， 浙江 杭州 310018)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，為我國一類動(dòng)物疫病之一。盡管世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)宣布目前已有38個(gè)無豬瘟的國家或地區(qū)，但豬瘟仍然在亞洲、南美、東歐及非洲部分地區(qū)流行[1]。尤其近2年，豬瘟在巴西、日本和韓國等曾宣布無豬瘟的國家重新出現(xiàn)，引發(fā)人們對豬瘟再度暴發(fā)的警惕[2-4]。

CSFV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約12.3 kb，含1個(gè)大的開放閱讀框，編碼1個(gè)獨(dú)立的由3 898個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，這個(gè)多聚蛋白被宿主蛋白酶裂解為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1、E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。囊膜糖蛋白E0和E2介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞，是重要的免疫保護(hù)性抗原，其中的E2蛋白由約373個(gè)氨基酸構(gòu)成，是CSFV的主要中和性抗原蛋白，在靠近E2基因氨基端上游有一段用于調(diào)控蛋白表達(dá)的信號肽序列，羧基端疏水的跨膜區(qū)常會抑制蛋白的表達(dá)，因此，常需要將E2基因的跨膜域去掉，再進(jìn)行豬瘟E2蛋白的高效表達(dá)。

豬瘟病毒只有1個(gè)血清群，可分為3個(gè)基因型和11個(gè)基因亞型?；?型(1.1、1.2、1.3和1.4)主要包含從世界各地分離的包括所有豬瘟弱毒活疫苗在內(nèi)的毒株；基因2型(2.1、2.2和2.3)包含自1980年至今導(dǎo)致豬瘟流行率上升的大多數(shù)流行毒株；基因3型(3.1、3.2、3.3和3.4)毒株主要分布于韓國、日本、泰國和中國臺灣等國家或地區(qū)[5]。雖然目前沒有明確的證據(jù)表明基因型和毒力之間存在相關(guān)性，但一般來說，強(qiáng)毒力毒株一般為基因1型，而大多數(shù)為中等毒力毒株屬基因2型。

1 豬瘟疫苗面臨的機(jī)遇

1.1 豬瘟疫苗的良好典范——豬瘟“C株”活疫苗 中國不僅是世界上最大的養(yǎng)豬大國，同時(shí)也是世界上豬肉消耗量最多的國家。豬瘟疫苗是我國養(yǎng)豬業(yè)必須接種的基礎(chǔ)疫苗。1950年，我國的方時(shí)杰、周泰沖等學(xué)者將豬瘟強(qiáng)毒在兔體內(nèi)連續(xù)傳480多代培育成豬瘟兔化弱毒“C株”，它集高度安全性與不可比擬的免疫原性于一體，可同時(shí)激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，并可使免疫豬抵抗不同基因型豬瘟強(qiáng)毒的攻擊，對我國甚至全球的豬瘟防控做出了巨大貢獻(xiàn)，是優(yōu)良豬瘟疫苗的典范[6-7]。我國豬場使用的兔源的豬瘟脾淋苗、乳兔苗以及細(xì)胞源的犢牛睪丸細(xì)胞苗和ST傳代細(xì)胞苗，都是用豬瘟兔化弱毒“C株”制備抗原。作為豬瘟活疫苗黃金標(biāo)準(zhǔn)的“C株”疫苗，一直具有以下幾項(xiàng)優(yōu)秀的免疫指標(biāo)：首先，“C株”疫苗可阻斷CSFV的水平傳播和垂直傳播，疫苗免疫4 d的接種豬攻毒后不表現(xiàn)任何豬瘟相關(guān)臨床癥狀，且檢測不到攻擊毒株，妊娠母豬免疫后7 d即能阻止病毒經(jīng)母體胎盤傳播給胎兒，“C株”疫苗的免疫保護(hù)期可長達(dá)1年甚至終身[8]；其次，“C株”疫苗生產(chǎn)成本低，適宜口服接種，可用于野豬的口服免疫。

1.2 豬瘟“C株”活疫苗缺乏DIVA特性 按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《2021年國家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》的要求[9]，各省級畜牧獸醫(yī)主管部門根據(jù)本轄區(qū)內(nèi)豬瘟流行情況，繼續(xù)實(shí)施豬瘟的強(qiáng)制免疫。目前我國豬群感染豬瘟主要表現(xiàn)為非典型性癥狀，種豬的持續(xù)性感染和仔豬的先天性感染比較普遍，均以隱性感染為主。近2年豬瘟樣品陽性率均在5%以下，以2.1型為主要流行基因型[10]，豬瘟“C株”活疫苗仍可對其進(jìn)行有效的交叉免疫保護(hù)。然而，豬瘟“C株”黃金活疫苗卻不能采用血清學(xué)方法區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物與野毒感染動(dòng)物(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA)，導(dǎo)致野毒感染動(dòng)物潛伏在疫苗接種動(dòng)物中，不能進(jìn)行鑒別診斷，不能滿足未來豬瘟疫苗的市場需求和國家重大動(dòng)物疫病凈化的需要，豬瘟疫苗面臨新的機(jī)遇。

2 豬瘟疫苗面臨的挑戰(zhàn)

學(xué)者們利用豬瘟E2蛋白良好免疫原性的特點(diǎn)，陸續(xù)開發(fā)了基于E2蛋白的豬瘟亞單位疫苗和嵌合病毒DIVA活疫苗，如德國拜耳和默沙東的BAYOVAC?CSF E2和Porcilis?Pesti E2，中國的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗Rb-03株和WH09株，以及韓國和歐盟的嵌合病毒活疫苗Flc-LOM-BErns和CP_E2alf[11-12]。這些商品化的豬瘟DIVA疫苗均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的E2抗體和中和抗體，保護(hù)豬抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊。國外很多學(xué)者采用植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬瘟E2蛋白或者構(gòu)建重組疫苗進(jìn)行DIVA疫苗的開發(fā)。在我國，近幾年處在新獸藥注冊階段的豬瘟疫苗依然是以“C株”為基礎(chǔ)的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗、基因工程活疫苗或聯(lián)苗(表1)，病毒載體疫苗研究也較多，但還未見有申請注冊的報(bào)道。隨著豬瘟DIVA疫苗研究和應(yīng)用的增加，問題日益顯現(xiàn)，豬瘟疫苗的應(yīng)用面臨新的挑戰(zhàn)。

表1 近5年處于新獸藥申請階段的豬瘟疫苗匯總

2.1 豬瘟E2蛋白亞單位疫苗表達(dá)量低 理想的疫苗不僅應(yīng)該是安全有效的，而且還應(yīng)是終端用戶能夠負(fù)擔(dān)得起的，成功表達(dá)大量具有強(qiáng)免疫原性的E2蛋白是成本效益的關(guān)鍵。就當(dāng)前上市的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗而言，大多采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行E2蛋白的表達(dá)，該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白能進(jìn)行翻譯后修飾并能正確折疊，但蛋白表達(dá)量低導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。針對這個(gè)問題，學(xué)者們嘗試了多種方法解決：(1)在表達(dá)載體中加入強(qiáng)啟動(dòng)子，F(xiàn)eng等[13]在表達(dá)載體中加入內(nèi)源性Txnip啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，E2蛋白表達(dá)量高于使用CMV啟動(dòng)子；(2)在E2基因啟動(dòng)子之前加入最優(yōu)的信號肽序列可提高E2蛋白的分泌表達(dá)，Xu等[14]選擇了一種新的信號肽序列SPZJ (SP23)，其誘導(dǎo)表達(dá)的E2蛋白量可達(dá)65 μg/mL，表達(dá)量比其他信號肽序列(SP13、SP18等)至少增加50%；(3)與分子佐劑融合表達(dá)，以促進(jìn)蛋白表達(dá)并提高融合蛋白的免疫原性，鑒于CD154可作為分子佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的特性，可將豬瘟E2基因和CD154分子構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，細(xì)胞上清中E2蛋白表達(dá)量可達(dá)50 mg/L，單次免疫攻毒后未在血液、扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)等組織檢測到CSFV，表明融合蛋白激發(fā)了機(jī)體堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)[15-17]。

植物生長成本低，不需要特殊的設(shè)備且易于規(guī)?；磉_(dá)外源蛋白。近2年，采用植物表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行豬瘟E2蛋白的表達(dá)成為研究熱點(diǎn)。Park等[18]用植物表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)豬瘟E2蛋白和可提高蛋白溶解度及表達(dá)水平的IgG的Fc段，融合蛋白表達(dá)量可達(dá)1.135 μg/μL，1 kg植物葉片可表達(dá)302 mg融合蛋白，并且150 μg融合蛋白乳化后間隔20 d免疫2次試驗(yàn)豬，直到二免后170 d豬瘟特異性中和抗體仍大于6log2。植物表達(dá)系統(tǒng)不但表達(dá)量高，表達(dá)蛋白也具有很好的免疫原性。Park等[19]還用煙草組織培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)的豬瘟E2蛋白制備疫苗，免疫2次妊娠64 d的母豬后可阻止病毒由母體傳染給仔豬。Laughlin等[20]用農(nóng)桿菌表達(dá)豬瘟E2蛋白，試驗(yàn)豬免疫1次后用強(qiáng)毒攻擊，豬只全部存活。因此，在保證免疫效果的前提下，為控制生產(chǎn)成本，植物表達(dá)系統(tǒng)將來也許會作為外源蛋白表達(dá)的工具而規(guī)模化應(yīng)用。

2.2 豬瘟E2蛋白亞單位疫苗建立免疫保護(hù)的時(shí)間長 與屠宰政策相比，迅速采取緊急疫苗接種策略以防止病毒傳播至關(guān)重要。“C株”疫苗免疫后1 d，攻毒動(dòng)物即可得到一定程度的攻毒保護(hù)，免疫后3 d，大多數(shù)動(dòng)物免于臨床疾病和病毒血癥，鼻分泌物中的病毒數(shù)量顯著減少[21]。相比之下，豬瘟E2蛋白亞單位疫苗不能在體內(nèi)復(fù)制且不能引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，一般于首免后21 d或二免后7～14 d即可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫[22-24]，因此，豬瘟E2蛋白亞單位疫苗不能用于緊急免疫，而更適用于感染背景明確種群的免疫。

2.3 豬瘟E2蛋白亞單位疫苗不能阻斷病毒的垂直傳播 豬瘟E2蛋白亞單位疫苗能阻止病毒的水平傳播，也能對不同基因型的病毒產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。Chen等[25]間隔3周免疫2次豬瘟E2亞單位疫苗，第2次免疫3周后用105TCID50/mL的豬瘟強(qiáng)毒攻擊豬只，并于攻毒4 d后引入哨兵豬同居。結(jié)果顯示，CSF E2蛋白亞單位疫苗免疫組豬只在CSFV攻毒后具有較高的中和抗體滴度，無臨床癥狀和明顯的病理變化，且同居期間未發(fā)現(xiàn)哨兵豬感染，表明CSF E2蛋白亞單位疫苗能阻止病毒的水平傳播。此外，該類疫苗是否能防止病毒經(jīng)母體胎盤垂直傳播給胎兒也很重要。我國的TWJ-E2蛋白亞單位疫苗能對2.1型和2.2型豬瘟的攻擊產(chǎn)生完全的攻毒免疫保護(hù)，不出現(xiàn)病毒血癥，血液和組織中也未檢測到CSFV核酸[25]。但對其能否阻斷病毒垂直傳播的研究報(bào)道很少。然而，大多研究資料表明，豬瘟E2蛋白亞單位疫苗不能阻斷CSFV的垂直傳播[26-29]，也就是說如果豬瘟E2蛋白亞單位疫苗用于免疫母豬，則有可能使仔豬先天感染，導(dǎo)致胎兒出生后出現(xiàn)體弱、死亡或震顫等臨床癥狀，有的呈免疫耐受而無臨床癥狀，對之后免疫的疫苗不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，持續(xù)向外界排毒成為傳染源，甚至與豬肺疫、豬繁殖與呼吸綜合征、豬鏈球菌病和仔豬副傷寒等疫病并發(fā)或混合感染。針對這個(gè)問題，目前主要通過嘗試開發(fā)嵌合病毒活疫苗解決。

2.4 豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗的免疫效力問題 針對E2蛋白亞單位疫苗建立有效免疫時(shí)間長，很難阻止病毒垂直傳播的問題，豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗應(yīng)運(yùn)而生。2014年，豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗CP7_E2alf在歐盟獲批上市，它是以BVDV毒株CP7為骨架，將其E2基因用CSFV毒株Alfort/187的E2基因替代，安全性和有效性可與傳統(tǒng)的豬瘟活疫苗相媲美[16],可阻斷病毒的水平傳播[30]。然而，當(dāng)進(jìn)行早期CSFV強(qiáng)毒攻擊試驗(yàn)以評估CP7_E2alf是否可作為緊急免疫疫苗時(shí)，有些案例中CP7_E2alf并不能阻止病毒的胎盤傳播[31]。但若CP7_E2alf緊急免疫時(shí)攻擊CSFV中等毒力毒株，則可有效阻斷母豬傳染給仔豬[32]，也就是說CP7_E2alf疫苗更適于感染中等毒力CSFV時(shí)的緊急免疫。不過在復(fù)雜的CSFV流行背景下，為盡量避免可能造成的仔豬先天性感染，母豬應(yīng)謹(jǐn)慎接種CP7_E2alf疫苗。

另一個(gè)成功注冊的豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗是2017年韓國上市的Flc-LOM-BErns，該疫苗是以CSFV LOM毒株為骨架，將其C蛋白的3′端基因及E0基因用BVDV的相應(yīng)基因替代。與CP7_E2alf相比，F(xiàn)lc-LOM-BErns阻止病毒垂直傳播的能力更強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，該疫苗免疫妊娠母豬2周后，豬只鼻拭子和糞便拭子中均未檢測到疫苗毒株[33]。而在豬瘟“C株”中引入標(biāo)記基因制備DIVA疫苗，是否能保持“C株”的有效性和安全性還在研究中。

2.5 豬瘟DIVA疫苗配套ELISA檢測方法存在的問題

2.5.1 E0抗體的交叉反應(yīng) E2蛋白亞單位疫苗中只含純化的E2蛋白，免疫后機(jī)體僅產(chǎn)生針對E2蛋白的抗體，若采用ELISA方法能在血液中檢測到非疫苗蛋白(如E0、NS3)的抗體，則表明豬群感染豬瘟野毒或接種了全病毒豬瘟疫苗。由于NS3蛋白在除CSFV之外的其他瘟病毒中也存在，不適合作為CSFV的特異性檢測標(biāo)記[34]，因此，豬瘟DIVA疫苗配套的鑒別檢測試劑盒均是針對E2和E0蛋白設(shè)計(jì)的。對于CP7_E2alf和Flc-LOM-BErns這2種豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗配套的ELISA方法，均存在E0抗體交叉免疫反應(yīng)的弊端[33,35]。為解決這個(gè)問題，有研究嘗試用與豬瘟同屬但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的病毒的同源基因代替。Postel等[36]采用挪威鼠瘟病毒和/或叉角羚瘟病毒的E0基因代替CSFV Alfortp447的E0基因構(gòu)建感染性cDNA克隆，血清學(xué)檢測未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，為豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗配套檢測的建立提供了借鑒。

2.5.2 敏感性和特異性有待提高 當(dāng)前所建立的豬瘟DIVA配套檢測方法敏感性和特異性不高。Pannhorst等[37]采集CSFV感染早期(感染<21 d)的57份血清和感染后期(感染>21 d)的127份血清，采用PrioCHECK CSFV ErnsELISA試劑盒進(jìn)行敏感性和特異性檢測。結(jié)果顯示，該方法對感染早期血清敏感性范圍為82%～95%，對感染后期血清的敏感性范圍為90%～98%,而對CP7_E2alf疫苗免疫攻毒后血清的檢測敏感性只有78%～89%。同時(shí)，用該試劑盒對CP7_E2alf疫苗接種豬血清檢測的特異性為89%～96%，多次免疫血清的特異性只有79%～85%。表明豬瘟感染階段以及是否進(jìn)行多次免疫均對該試劑盒的檢測結(jié)果有很大影響，因此，該試劑盒只能測定部分群體動(dòng)物，不適于全群檢測。相比之下，Meyer等[35]建立的Pigtype ErnsELISA方法敏感性和特異性更高些，其對感染不同基因型CSFV血清的敏感性和特異性分別為93.5%和99.7%，對豬瘟CP7_E2alf免疫血清的敏感性和特異性分別為90.2%和93.8%。暫未發(fā)現(xiàn)其他關(guān)于豬瘟DIVA嵌合病毒活疫苗檢測方法的詳細(xì)報(bào)道。不過，從這2種試劑盒檢測結(jié)果看，豬瘟DIVA檢測方法的敏感性和特異性還有很大的提升空間。

3 展望

近年來豬瘟區(qū)域頻發(fā)，全球范圍內(nèi)重新暴發(fā)豬瘟的風(fēng)險(xiǎn)提高。2014年，宣布無豬瘟的韓國Jeju島，因意外接種豬瘟LOM疫苗暴發(fā)豬瘟，其分離株與LOM疫苗毒株核苷酸同源性高達(dá)98.7%～99.0%[38]。同樣在2018年，曾宣布無豬瘟的日本Gifu，26年來首次暴發(fā)豬瘟疫情，而且在野豬不太可能傳染到的豬場也暴發(fā)了豬瘟[39-40]。這些案例引起了人們對傳統(tǒng)豬瘟活疫苗毒株毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)意識的警惕，也督促我們重新審視豬場的生物安全措施及疫病控制策略。盡管我國的豬瘟“C株”活疫苗非常安全，在豬體傳30代后毒力仍不返強(qiáng)，而且，其對最近流行的3種基因型的CSFV均可產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)，但畢竟其已普免多年，需要對其安全性重新評估，提前防范，防止像非洲豬瘟一樣，對我國豬場再次造成毀滅性打擊。

據(jù)中國獸藥信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，2020年，國內(nèi)豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)共申請了14個(gè)批次的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗和1 698個(gè)批次的豬瘟活疫苗。而截止2021年11月，相應(yīng)疫苗分別為39個(gè)批次和1 475個(gè)批次，這反映出國內(nèi)豬場使用豬瘟疫苗的動(dòng)向，也進(jìn)一步表明豬瘟DIVA疫苗取代豬瘟“C株”活疫苗還有很長的路要走。因此，開發(fā)集豬瘟“C株”活疫苗的安全性、有效性和DIVA特點(diǎn)于一體的豬瘟DIVA疫苗，符合未來豬瘟疫苗市場的必然需求和豬瘟凈化的需要。在畜牧獸醫(yī)相關(guān)部門大力倡導(dǎo)支持下，采用優(yōu)秀的豬瘟DIVA疫苗及配套的血清檢測方法，淘汰無抗體反應(yīng)或抗體水平低的種豬，同時(shí)逐步改善養(yǎng)豬場的生態(tài)環(huán)境并提高生物安全水平，才能逐步建立起豬瘟陰性豬群，加快我國豬瘟凈化的進(jìn)程，早日實(shí)現(xiàn)豬瘟凈化的目標(biāo)。