耿仕夏 ， 羅蓀琳 ， 熊夢琴 ， 張麗英 ， 陳義強 ， 楊文軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室 ， 北京 海淀 100193)

膽汁酸是膽汁的重要組成成分，是機體膽固醇代謝過程中產(chǎn)生的一系列膽烷酸的總稱[1]。近年來研究結(jié)果顯示，膽汁酸不僅可以促進脂肪和脂溶性維生素消化和膽囊膽固醇溶解，還可以作為信號分子通過激活多條信號通路調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)、糖脂代謝和能量代謝[2-3]，對機體代謝發(fā)揮著非常重要的作用。反之亦然，機體生理狀態(tài)的改變也會影響膽汁酸的組成和分布。研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飲食的結(jié)腸癌患者通過糞便排出的次級膽汁酸水平升高，特別是脫氧膽酸(Deoxycholic acid,DCA)和石膽酸(Lithocholic acid,LCA)，這不利于結(jié)腸上皮的結(jié)構(gòu)和功能[4]。在2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠中發(fā)現(xiàn)血清中12α-OH膽汁酸與非12α-OH膽汁酸的比值增加，這為尋找可能的T2DM生物標志物提供線索[5]。因此，血清膽汁酸組分測定也許在某些疾病的早期無創(chuàng)診斷和治療監(jiān)測中具有重要意義。但目前對于不同種類膽汁酸在機體中發(fā)揮的生理作用及病理學(xué)功能尚不清楚，部分原因在于各類膽汁酸定量檢測技術(shù)受限。因此建立動物體內(nèi)膽汁酸代謝譜的檢測方法，對深入探討膽汁酸的生理功能和作用機制具有重要意義。

目前已建立了酶測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法、薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)、高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)等多種膽汁酸檢測方法。酶測定法和ELISA法快速、方便、簡單，但特異性低、檢測限高[6-7]。TLC僅適用于定性分析，不能準確檢測某類膽汁酸的水平[8-9]。HPLC、GC-MS和LC-MS具有較高的靈敏度和特異性，但是HPLC和GC-MS樣品制備過程復(fù)雜甚至有時需要衍生化，增加了試驗操作難度[10-11]。LC-MS/MS不需要衍生化過程，分析更快速和方便，且分析法靈敏度高、多靶標同步分析能力強，已成為膽汁酸分析的主要技術(shù)手段[12]?；诖?，本研究采用基于同位素內(nèi)標的LC-MS/MS分析方法測定小鼠血清中的膽汁酸。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀：Agilent Technologies 1290 Series，美國Agilent Technologies公司；串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀：Agilent 6490 Triple Quadrupole Mass Spectrometer，美國Agilent Technologies公司；超純水儀：Millipore Milli-Q純化系統(tǒng)，美國Merk Millipore公司；電子分析天平：BSA124S，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；全自動樣品冷凍研磨儀：JXFSTPRP-CLN，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；高速冷凍離心機：3-30K型，德國Sigma公司；旋渦混合器：HQ-60-Ⅱ，北京同方股份有限公司；HSC-24B水浴氮吹儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司。膽酸(Cholic acid,CA)、α-鼠膽酸(α-Muricholic acid,α-MCA)、β-MCA、熊脫氧膽酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)、牛磺α-鼠膽酸(Tauro-α-muricholic acid,Tα-MCA)、牛磺豬膽酸(Taurohyocholic acid,THCA)、牛磺豬去氧膽酸(Taurohyodeoxychoic acid,THDCA)、甘氨鵝去氧膽酸(Glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)、甘氨豬膽酸(Glycohyocholic acid,GHCA)、甘氨石膽酸(Glycolithocholic acid,GLCA)、甘氨豬去氧膽酸(Glycohyodeoxycholic acid,GHDCA)、氘代鵝脫氧膽酸(CDCA-D4)、氘代石膽酸(LCA-D4)、氘代甘氨膽酸(GCA-D4)，均購自Steraloids公司；ω-MCA、LCA、鵝脫氧膽酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)、豬膽酸(Hyocholic acid,HCA)、豬去氧膽酸(Hyodeoxychoic acid,HDCA)、?；悄懰?Taurocholic acid,TCA)、?；鞘懰?(Taurolithocholic acid,TLCA)、?；切苊撗跄懰?Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)、牛磺去氧膽酸(Taurodeoxycholic acid,TDCA)、Tβ-MCA、?；蛆Z脫氧膽酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、甘氨去氧膽酸(Glycodeoxycholic acid,GDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(Glycoursodeoxycholic acid,GUDCA)、甘氨β-鼠膽酸(Glyco-β-muricholic acid,Gβ-MCA)、氘代去氧膽酸(DCA-D4)，均購自Cayman Chemical公司；氘代?；悄懰?TCA-D5)、氘代?；蛆Z脫氧膽酸(TCDCA-D5)，均購自Toronto Research Chemical公司；DCA、Tω-MCA、甘氨膽酸(Glycocholic acid,GCA)，均購自上海甄準生物科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，德國Merk公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)，色譜純，美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18超高效液相色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)；保護柱：Waters BEH VanGuard 保護柱(1.7 μm,2.1 mm×5 mm)。流動相：0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)。柱溫：65 ℃，進樣量：5 μL，流速：0.5 mL/min。洗脫程序：水相在0～0.5 min時體積分數(shù)為95%，0.5～5.0 min時體積分數(shù)變?yōu)?5%，5.0～9.0 min時體積分數(shù)由85%變?yōu)?5%，9.0～19.5 min時體積分數(shù)變?yōu)?0%，19.5～21.5 min時體積分數(shù)由60%變?yōu)?%并保持至23 min，最后恢復(fù)初始條件。

1.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),采用負離子模式(ESI-)。電噴霧離子源參數(shù)設(shè)置為霧化氣溫度300 ℃，霧化氣氣流7 L/min；鞘氣溫度350 ℃，鞘氣氣流7 L/min；毛細管電壓4 000 V，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple reaction monitoring,MRM)。

1.4 溶液的配制

1.4.1 膽汁酸儲備液及工作液 分別取28種膽汁酸標準品10 mg，精密稱量，用DMSO定容至10 mL量瓶中，充分混勻后，得到濃度為1 mg/mL的各膽汁酸儲備液。隨后用50%甲醇-水稀釋膽汁酸儲備液得到濃度分別為1、10、50、100、500、1 000、3 000 ng/mL和100 000 ng/mL的28種膽汁酸的混合標準溶液，冷藏保存。

1.4.2 內(nèi)標儲備液及工作液 分別取各內(nèi)標標準品溶液約10 mg，精密稱量，用DMSO定容至10 mL量瓶中，充分混勻得到濃度為1 mg/mL的內(nèi)標儲備液。隨后用50%甲醇-水稀釋得到濃度為0.05、0.2、1、10 μg/mL和100 μg/mL的混合內(nèi)標工作液，冷藏保存。

1.5 樣品處理方法 吸取50 μL血清樣本于1.5 mL塑料離心管中，加入10 μL內(nèi)標工作液(1 μg/mL)，再加入240 μL甲醇溶液，在全自動樣品冷凍研磨儀中研磨120 s。于-20 ℃靜置20 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液至1.5 mL塑料離心管中。在沉淀物中再加入240 μL甲醇溶液進行提取、研磨與離心。合并2次上清液，氮氣吹干，再以100 μL 50%甲醇-水復(fù)溶，渦旋后于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清至進樣小瓶中待上機分析。

1.6 結(jié)果計算 按照以下公式計算飼料樣品中各種膽汁酸的含量。

X=c×2

式中：X為血清中某種膽汁酸的含量(ng/g)；c為由標準曲線得到試液中某種膽汁酸的濃度(ng/mL)。

1.7 方法驗證

1.7.1 標準曲線與線性范圍 按選定的色譜條件對已配制的膽汁酸混合標準工作溶液進行上機檢測，以各膽汁酸標準品溶液濃度為橫坐標，以膽汁酸標準品溶液與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，進行權(quán)重回歸。

1.7.2 添加回收試驗 取空白小鼠血清樣做回收試驗，設(shè)置20、50 ng/mL和200 ng/mL三個添加濃度的膽汁酸同位素內(nèi)標混合標準工作溶液，每個添加濃度設(shè)置3個平行測定，按1.5方法進行樣品預(yù)處理，上機檢測，測定膽汁酸的回收率。

1.7.3 實際樣本的檢測 采集6只C57BL/6J小鼠血清于無抗凝劑的采血管中，編號1～6，靜置后于4 ℃、3 000 g離心10 min分離血清，采用所建的LC-MS/MS法檢測小鼠血清樣品中的膽汁酸含量。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線與線性范圍 結(jié)果如表1所示，TLCA、GLCA的線性范圍為0.7～1 000 ng/mL，TCDCA、TDCA、TUDCA、THDCA、GCA、GCDCA、GDCA、GUDCA、Gβ-MCA和Gγ-MCA(GHCA)的線性范圍為0.9～1 000 ng/mL，CA的線性范圍為1.1～1 000 ng/mL，CDCA、DCA的線性范圍為1.8～1 000 ng/mL，UDCA、α-MCA、β-MCA、γ-MCA(HCA)和ω-MCA的線性范圍為2.2～1 000 ng/mL，HDCA、TCA、Tα-MCA、Tβ-MCA、Tγ-MCA(THCA)、Tω-MCA和GHDCA的線性范圍為3.3～1 000 ng/mL，LCA的線性范圍為5.0～1 000 ng/mL；濃度與峰面積的比值具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；以信噪比(S/N)為3和10作為最低檢出限和定量限，各膽汁酸的檢測限在0.2～1.5 ng/mL，定量限在0.7～5.0 ng/mL。

表1 各膽汁酸的檢測限、定量限、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 1 Detection limit,quantitation limit,linear range and correlation coefficient of bile acids

續(xù)表

典型膽汁酸標準溶液的多反應(yīng)監(jiān)測MRM色譜圖如圖1所示，在本研究所建LC-MS/MS方法下，各膽汁酸的峰形較穩(wěn)定，周圍雜質(zhì)峰干擾少，有良好的分離效果，可準確定量檢測各膽汁酸的含量。

圖1 典型膽汁酸的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of typical bile acids

2.2 添加回收試驗 由表2可知，用所建的LC-MS/MS方法進行膽汁酸同位素內(nèi)標的添加回收試驗，各膽汁酸同位素內(nèi)標均可達到較穩(wěn)定的回收率，平均加標回收率均在83.5%～108.4%，變異系數(shù)均小于14.9%。

表2 小鼠血清中膽汁酸的添加回收率和變異系數(shù) Table 2 Recovery and coefficient of variation of bile acids in mouse serum (%)

續(xù)表

2.3 小鼠血清樣品的檢測 小鼠血清樣品檢測結(jié)果如表3所示，樣本中所有膽汁酸分離良好，峰形穩(wěn)定；小鼠血清中可檢測出25種膽汁酸，主要以?；撬峤Y(jié)合形式存在，且有較高含量的CA。

表3 小鼠血清膽汁酸譜 Table 3 Bile acids profile in mouse serum (ng/mL)

3 討論

為了獲得各膽汁酸色譜圖的最佳分辨率和峰形，研究中通常采用固相萃取法和蛋白沉淀法作為血清膽汁酸測定的前處理方法，本研究選用甲醇沉淀血清蛋白，與Han等[13]采用的固相萃取前處理方法相比，甲醇提取方法操作簡單快速，且可用于大批量科研樣本的檢測。本研究初期采用甲醇沉淀蛋白，發(fā)現(xiàn)提取1次后的沉淀物中仍有膽汁酸殘留，因此對前處理方法進行優(yōu)化，將提取次數(shù)增為2次，通過添加回收試驗驗證該法測定28種膽汁酸的平均加標回收率均在83.5%～108.4%，變異系數(shù)均小于14.9%，完全滿足對小鼠血清膽汁酸代謝譜準確定量的分析需求。

本研究對流動相組成、流速及柱溫進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈作為流動相，在流速為0.5 mL/min，柱溫65 ℃時獲得較好的色譜峰形和保留時間。本研究大多數(shù)膽汁酸母離子/子離子離子對與Krautbauer等[14]所報道的及預(yù)期的膽汁酸產(chǎn)物離子一致。通過比較250～380 V不同破裂電壓的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在380 V時，各膽汁酸響應(yīng)值處于較高水平，因此將破裂電壓設(shè)置為380 V。在優(yōu)化的破裂電壓下對碰撞能進行進一步優(yōu)化。碰撞能較低時，即在30 eV時游離膽汁酸的產(chǎn)物離子被檢測到，為去質(zhì)子化離子；碰撞能在74～80 eV時牛磺酸結(jié)合型膽汁酸被檢測到；碰撞能在38～42 eV時甘氨酸結(jié)合型膽汁酸被檢測到。國內(nèi)有研究報道建立了檢測人體和小鼠血清樣本中15種膽汁酸的測定方法[15-16]。國外也有文獻報道建立了可以檢測19種[17]和21種[18]膽汁酸的方法。本研究所建立的方法在23 min內(nèi)即可完成28種游離型和結(jié)合型膽汁酸的同步測定，檢測的膽汁酸種類超過了上述研究。經(jīng)本研究驗證，28種膽汁酸檢測限在0.2～1.5 ng/mL，定量限在0.7～5.0 ng/mL，在線性范圍內(nèi)線性良好，較廣的線性范圍有助于將此方法拓展到其他種類樣本(如糞便、膽汁和組織等)中膽汁酸的測定，較豐富的膽汁酸種類可以滿足研究對于常見膽汁酸的檢測研究。本研究采用與待測膽汁酸理化性質(zhì)相近的多種同位素標記膽汁酸作為內(nèi)標，可對樣品前處理和質(zhì)譜分析過程中的誤差進行校正。相較于羅鑭等[19]采用的氯霉素內(nèi)標，同位素內(nèi)標得出的檢測值相對準確。Zheng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠膽汁中的主要膽汁酸為TCA、Tα-MCA、Tβ-MCA和TDCA。與之一致的是，本研究采用所建立的LC-MS/MS法檢測出小鼠血清的25種膽汁酸，也是主要以?；撬峤Y(jié)合形式存在，TCA、γ-MCA、Tβ-MCA具有較高的水平。本研究推測，腸道微生物對甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的水解速度高于對?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸的水解速度可能是牛磺酸結(jié)合型膽汁酸比例占優(yōu)勢的原因。

綜上可知，本研究建立的基于同位素內(nèi)標的LC-MS/MS檢測方法可同時檢測28種膽汁酸，能夠用于小鼠血清膽汁酸譜的測定。該方法前處理操作方便快捷，靈敏度和特異性較高，對某些疾病的早期無創(chuàng)診斷具有重要意義。