尹茉莉 ， 聶元旺 ， 周婉婷 ， 張 爽 ， 劉 磊 ， 冀慧敏 ， 劉方圓 ， 王會(huì)巖

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 吉林省抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 吉林 吉林 132013 ； 2. 吉林省吉林市園林管理中心 ，吉林 吉林 132013 ； 3. 吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司 ， 吉林 長(zhǎng)春 130112)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)奶制品需求量增加，其中96%的奶制品以牛奶為原料。早期妊娠診斷可以降低奶牛的空懷率，縮短產(chǎn)犢周期，增加牧場(chǎng)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[1]。牛妊娠相關(guān)糖蛋白(Bovine pregnancy-associated glycoproteins，bPAG) 基因家族已發(fā)現(xiàn)至少有22個(gè)不同轉(zhuǎn)錄體以及變異體，主要功能是維持妊娠和免疫調(diào)節(jié)[2-5]。bPAG可在妊娠母牛外周血液中被檢測(cè)到，從妊娠開(kāi)始，bPAG濃度緩慢上升，隨著妊娠期的持續(xù)，其濃度出現(xiàn)波動(dòng)，但其平均濃度不斷上升，分娩時(shí)達(dá)到最大濃度。血漿中bPAG濃度是早期妊娠診斷和妊娠監(jiān)測(cè)的可靠生物標(biāo)志物[6]。

目前，早期妊娠診斷方法主要有觀察法、孕酮測(cè)定法、超聲波掃描法和酶聯(lián)免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等[2]。由于ELISA具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且能準(zhǔn)確地檢測(cè)奶牛血液中bPAG濃度及相對(duì)濃度的變化而被推廣應(yīng)用。目前，商品化的bPAG-ELISA檢測(cè)試劑盒主要由美國(guó)愛(ài)德士和百奧特英公司生產(chǎn)，但因應(yīng)用進(jìn)口試劑盒檢測(cè)的成本過(guò)高，許多養(yǎng)殖企業(yè)并未使用。國(guó)內(nèi)該種類檢測(cè)試劑盒尚處于研究階段，無(wú)商品化的報(bào)道[7-9]。為此，建立本國(guó)自主品牌的bPAG-ELISA檢測(cè)試劑盒是迫切需要解決的問(wèn)題。

由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上沒(méi)有售賣可配對(duì)的bPAG單克隆抗體，本試驗(yàn)旨在通過(guò)電融合方法制備能識(shí)別天然bPAG的單克隆抗體，確定最佳配對(duì)抗體，以建立雙抗夾心ELISA方法，為研發(fā)bPAG檢測(cè)試劑盒提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 奶牛胎盤子葉從吉林市春光乳業(yè)有限責(zé)任公司采集，經(jīng)分離純化獲得bPAG天然抗原，純度達(dá)95%，-80 ℃冰箱保存；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、鼠類mAb抗體亞類鑒定試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)默克公司；蛋白A(Protein A)親和層析柱，購(gòu)自蘇州納微科技股份有限公司；牛早孕檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-2F)，購(gòu)自安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)為MCO-18AIC)，購(gòu)自日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(型號(hào)為IC1000)，購(gòu)自上海樂(lè)純生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 雌性BALB/c小鼠(6～8周齡)，購(gòu)自上海斯拉克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(吉)2017—0002；Sp2/0細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院吉林省抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心保存。

1.4 血樣采集 采集64頭人工授精后28～45 d的奶牛血液樣品，分離血清后使用牛早孕檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。在采血當(dāng)天用 B 超儀對(duì)采樣奶牛進(jìn)行妊娠檢查，在人工授精后第48天用B超進(jìn)行復(fù)檢。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 免疫動(dòng)物 在首次免疫中，用等劑量完全弗氏佐劑乳化的50 μg bPAG腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠。之后每14天使用不完全弗氏佐劑乳化的bPAG免疫1次。第3次免疫后，取小鼠尾血測(cè)定血清抗體效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到要求時(shí)，再加強(qiáng)免疫1次。

1.5.2 細(xì)胞電融合及雜交瘤細(xì)胞篩選 分離免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按3∶1的比例混合，經(jīng)鏈霉蛋白酶E(Pronase E)激活后，在LF498-3鉑電極融合室進(jìn)行電融合。融合細(xì)胞密度由電融合緩沖液調(diào)整為2×107個(gè)/mL。電融合參數(shù)設(shè)置為0.8 MHz交流電壓50 V 20 s，直流脈沖電壓450 V 2次0.5 s，融合后50 V 0.8 MHz 7 s。將經(jīng)過(guò)電融合的細(xì)胞懸液從融合室移至已預(yù)熱含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在鋪有分離的小鼠腹腔原代細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中培養(yǎng)。24 h后每孔需補(bǔ)充HAT選擇培養(yǎng)基。融合7～9 d后用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。使用包被液稀釋純化的 bPAG天然抗原至濃度為2 μg/mL 后，加入聚苯乙烯板。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行1∶10、1∶200、1∶800稀釋作為一抗。HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(1∶5 000)作為二抗，TMB 底物顯色，檢測(cè)OD450 nm值≥1判定為陽(yáng)性。記錄陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的集落總數(shù)，按公式(1)計(jì)算雜交瘤細(xì)胞融合效率。

雜交瘤細(xì)胞融合效率/%=(雜交瘤集落總數(shù)÷脾臟細(xì)胞數(shù))×100%

(1)

1.5.3 bPAG單克隆抗體的制備及鑒定 將1×106個(gè)/mL陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞接種已提前注射石蠟油的BALB/c小鼠，7～15 d后抽取腹水。用Protein A親和層析柱純化腹水，SDS-PAGE分析抗體純度。Western blot檢測(cè)抗bPAG單克隆抗體的特異性。使用半干法(100 mA，30 min)將從牛胎盤組織中粗提的天然bPAG蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，加入純化的抗bPAG 單克隆抗體(1∶2 000)；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)；ECL顯色，觀察結(jié)果。用鼠類mAb抗體亞類鑒定試劑盒分析抗體的免疫球蛋白亞類。間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)。參照參考文獻(xiàn)[10]的ELISA方法檢測(cè)單抗與bPAG的親和力。

1.5.4 酶標(biāo)bPAG單克隆抗體效價(jià)檢測(cè) 制備的bPAG單抗用高碘酸鈉法標(biāo)記HRP后作為檢測(cè)抗體[11]。bPAG抗原包被濃度為2 μg/mL，將酶標(biāo)單抗從1∶200起進(jìn)行2倍倍比稀釋，共設(shè)12個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)免疫小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，封閉液作為空白對(duì)照。OD450 nm值≥1.0時(shí)，作為最佳抗體稀釋度。

1.5.5 雙抗夾心ELISA方法的初步建立 將獲得的單克隆抗體作為捕獲抗體包板，濃度為5 μg/mL，4 ℃過(guò)夜。將抗原bPAG稀釋成濃度為10 μg/mL，同時(shí)設(shè)免疫小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，封閉液作為空白對(duì)照。加入HRP標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行兩兩配對(duì)，確定可用于建立夾心ELISA方法的配對(duì)抗體。當(dāng)OD450 nm值≥1時(shí)，作為強(qiáng)陽(yáng)性(P)，OD450 nm值≤0.15時(shí)，作為陰性(N)?？贵w的工作濃度采用棋盤滴定法[12]確定，根據(jù)OD450 nm值≥1，且P/N>2.1時(shí)，判定為最佳工作濃度。初步建立夾心ELISA檢測(cè)方法。

符合率/%=(真妊娠數(shù)+真未妊娠數(shù))÷檢測(cè)總數(shù)×100%

(2)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞電融合及雜交瘤細(xì)胞篩選 使用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的電融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)計(jì)算雜交瘤細(xì)胞融合效率為0.34%。經(jīng)間接ELISA篩選，獲得43個(gè)識(shí)別bPAG 抗原IgGs的雜交瘤克隆(圖1A)。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行1∶10、1∶200、1∶800稀釋，間接ELISA篩選獲得5株強(qiáng)陽(yáng)性單克隆抗體，分別命名為2D7、3G1、5G1、4A10和10H2(圖1B)。

圖1 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩查Fig.1 Screening of positive hybridoma cell linesA：陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株； B：5株強(qiáng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞A：Positive hybridoma cell lines； B：Five strong positive hybridoma cell lines

2.2 bPAG單克隆抗體的制備及鑒定 腹水純化后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在55 kDa和25 kDa附近有2條清晰的條帶，分別為抗體的重鏈和輕鏈，污染蛋白很少(圖2)。Western blot結(jié)果如圖3所示，純化所得的5株單克隆抗體均能特異性識(shí)別bPAG天然蛋白，在35 kDa處均出現(xiàn)目的條帶，這與報(bào)道從妊娠奶牛、山羊、綿羊胎盤組織中分離純化多種PAG亞型分子量為35～76 kDa相符[13]。由表1可知，2D7、5G1和10H2亞類均為IgG1，3G1亞類為IgG2b，4A10亞類為IgG2a。間接ELISA法檢測(cè)5株單克隆抗體效價(jià)，3G1和5G1效價(jià)為1∶256 000，2D7、10H2和4A10效價(jià)為1∶128 000(表1)。2D7、3G1、5G1、4A10和10H2抗體親和力分別為1.63×107L/mol、3.75×107L/mol、1.74×107L/mol、5.83×106L/mol和2.76×107L/mol(表1)。

表1 5株bPAG單克隆抗體的鑒定Table 1 Assessment of five monoclonal antibodies against bPAG

圖2 SDS-PAGE分析5株純化后的單克隆抗體Fig.2 SDS-PAGE analysis of five purified monoclonal antibodiesM：Protein Marker； 1：2D7； 2：3G1； 3：5G1； 4：4A10； 5：10H2

圖3 Western blot 檢測(cè)單克隆抗體特異性Fig.3 Western blot analysis of specificity of monoclonal antibodies 1：2D7； 2：3G1； 3：5G1； 4：4A10； 5：10H2

2.3 酶標(biāo)bPAG單克隆抗體效價(jià)檢測(cè) 如圖4所示，酶標(biāo)抗體HRP-2D7、HRP-3G1、HRP-5G1、HRP-4A10和HRP-10H2最佳稀釋倍數(shù)分別為1∶6 400、1∶12 800、1∶6 400、1∶6 400和1∶12 800。

圖4 酶標(biāo)抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.4 Determination of enzyme-labeled antibody titers

2.4 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的初步建立 如表2所示，以10H2作為捕獲抗體與HRP標(biāo)記的5G1配對(duì)成功，可用于建立雙抗夾心ELISA方法。包被不同濃度的單克隆抗體10H2與不同稀釋倍數(shù)的HRP-5G1單抗作棋盤滴定法確定抗體的工作濃度。結(jié)果如表3所示，單抗10H2包被濃度為2 μg/mL，HRP-5G1單抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

表2 單克隆抗體配對(duì)結(jié)果Table 2 Results of monoclonal antibody coupling

表3 單克隆抗體適宜濃度Table 3 Suitable concentration of monoclonal antibody

2.5 雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)血清樣品 根據(jù)愛(ài)德士牛早孕檢測(cè)試劑盒判斷結(jié)果制定雙抗夾心ELISA方法的陰性、陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)OD450 nm值>0.7判為陽(yáng)性，檢測(cè)OD450 nm值<0.5判為陰性，結(jié)果見(jiàn)圖5。以B超檢測(cè)結(jié)果作為真實(shí)妊娠判定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)愛(ài)德士牛早孕檢測(cè)試劑盒與B超檢測(cè)結(jié)果比較符合率為98.4%(63/64)。雙抗夾心ELISA方法測(cè)定的妊娠結(jié)果中有2個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果，2個(gè)假陰性結(jié)果，與B超檢測(cè)結(jié)果比較符合率為93.8%(60/64)，與愛(ài)德士牛早孕檢測(cè)試劑盒比較符合率為95.2%(60/63)，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖5 雙抗夾心ELISA檢測(cè)牛血清結(jié)果Fig.5 Results of cow serum samples detected by double antibody-sandwich ELISA

表4 3種檢測(cè)方法的比較Table 4 Comparison of three detection method

3 討論

PAG屬于無(wú)活性天冬氨酸蛋白酶家族，與胃蛋白酶有50%以上的相同氨基酸序列，其中bPAG種類繁多，其家族成員同源性較高，在牛妊娠期，每種bPAG的濃度及功能尚不明確[14-15]。從妊娠后的多種母畜胎盤胎兒子葉中可以分離提取PAG天然蛋白，PAG作為多種動(dòng)物的妊娠診斷標(biāo)志物，研發(fā)血清中PAG的檢測(cè)方法一直備受關(guān)注[16]。本試驗(yàn)為了獲得能夠識(shí)別天然bPAG的單克隆抗體，從妊娠母牛胎盤子葉中分離提純bPAG，免疫小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞通過(guò)電融合法進(jìn)行細(xì)胞融合。

單克隆抗體制備的經(jīng)典方法是PEG誘導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)，但其融合效率低，對(duì)細(xì)胞有毒害作用，很難獲得令人滿意的抗體[17]。電融合技術(shù)是一種高效、可復(fù)制、無(wú)毒的細(xì)胞融合技術(shù)，不僅提高了融合細(xì)胞的數(shù)量，而且提高了雜交瘤的生長(zhǎng)速度，更容易獲得具有高度親和力的單克隆抗體[18]。交變電場(chǎng)強(qiáng)度、融合儀器型號(hào)、細(xì)胞類型及比例、脈沖強(qiáng)度等融合參數(shù)會(huì)直接影響細(xì)胞融合率。在進(jìn)行電融合時(shí)，需要摸索各項(xiàng)條件，選擇最適試驗(yàn)參數(shù)。本試驗(yàn)選擇交流電場(chǎng)強(qiáng)度為50 V，直流脈沖強(qiáng)度為450 V，脾臟細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以3∶1的比例進(jìn)行電融合，細(xì)胞融合率達(dá)到0.34%，雜交瘤細(xì)胞狀態(tài)飽滿，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。間接ELISA篩選到5株強(qiáng)陽(yáng)性抗bPAG單克隆抗體。為驗(yàn)證單抗與天然形式bPAG結(jié)合的特性，本試驗(yàn)使用含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液裂解牛子葉組織，獲得的粗提蛋白進(jìn)行單克隆抗體特異性鑒定。

針對(duì)bPAG開(kāi)發(fā)的愛(ài)德士牛早孕ELISA檢測(cè)試劑盒診斷準(zhǔn)確率可達(dá)97.8%[19]，從養(yǎng)殖場(chǎng)取回的陰性、陽(yáng)性血清樣本經(jīng)過(guò)愛(ài)德士牛早孕檢測(cè)試劑盒判斷后，再由本實(shí)驗(yàn)室建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法驗(yàn)證，比較檢測(cè)結(jié)果的符合率。在64個(gè)樣本檢測(cè)過(guò)程中有4個(gè)樣本與B超檢測(cè)真實(shí)妊娠結(jié)果不符合，愛(ài)德士牛早孕檢測(cè)試劑盒與B超檢測(cè)結(jié)果符合率為98.4%，雙抗夾心ELISA方法與B超檢測(cè)結(jié)果符合率為93.8%。為獲得更高度一致性的檢測(cè)結(jié)果，我們需要繼續(xù)優(yōu)化檢測(cè)方法，包括抗體的包被濃度、酶標(biāo)二抗的工作濃度、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間、顯示時(shí)間等。目前，檢查母羊妊娠第18天血清中PAG和孕酮濃度已有報(bào)道，還未見(jiàn)測(cè)定妊娠母牛PAG濃度的報(bào)道[20]。本課題組將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行大量樣本驗(yàn)證，以優(yōu)化技術(shù)參數(shù)，建立定性、定量的bPAG檢測(cè)方法。