黃瀟航 ， 彭佳佳 ， 張 龍 ， 李詩藝 ， 王詩晨 ， 李夢蕊 ，李永霞 ， 賀金峪 ， 黃志堅 ， 殷光文

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 蜂學(xué)學(xué)院 ， 福建 福州 350002 ； 2.福建省動物藥物工程實驗室 ， 福建 福州 350002)

我國水禽產(chǎn)業(yè)較為發(fā)達，但是球蟲、蛔蟲等寄生蟲的感染影響了水禽的生產(chǎn)性能，造成了較為嚴重的經(jīng)濟損失，因此及時有效地確診水禽寄生蟲病的感染類型具有重要意義。動物蛔蟲多具有較為相似的形態(tài)特征，依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法較難進行判斷，因此分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為快速鑒定蛔蟲種類提供了新方法。鴨蛔蟲的臨床案例在國內(nèi)報道較少，且尚未開展致病原相關(guān)研究。在已報道的臨床鴨源蛔蟲臨床案例中，林琳等[1]通過形態(tài)學(xué)鑒定診斷了1例番鴨蛔蟲病，通過蟲卵、成蟲形態(tài)學(xué)方法的比對判斷為雞蛔蟲。而在江梅[2]報道的臨床案例中，鴨蛔蟲被認為主要是禽蛔蟲，但主要還是依據(jù)形態(tài)學(xué)進行判斷。本試驗通過對1例送檢至福建省畜禽疾病診療中心患有蛔蟲病的番鴨進行剖檢，觀察其病理變化。通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，H.E.)染色法對番鴨腸道由于蛔蟲寄生產(chǎn)生的腸道病變進行了觀察。在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，使用分子生物學(xué)技術(shù)，對采集的蟲體進行DNA提取和PCR擴增鑒定，通過與數(shù)據(jù)庫中蛔屬線蟲的遺傳序列比對，基于18S rRNA遺傳區(qū)間對鴨源蛔蟲進行了分子生物學(xué)鑒定，為鴨蛔蟲病的生物學(xué)分類提供了相關(guān)的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 用于剖檢、制備病理切片研究的病變組織，鴨源蛔蟲蟲株均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜禽疾病診療中心惠贈。

1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit，購自美國MP Biomedicals公司；EasyTaqMix 聚合酶、EasyPure Quick Gel Extraction Kit，均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。Omega Fluor Plus 凝膠成像系統(tǒng)，美國 Aplegen 公司產(chǎn)品；Veriti 梯度 PCR 儀，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 病理組織學(xué)觀察 采集樣品時記錄鴨腸道剖檢病變。取病變腸組織，固定于10%中性福爾馬林緩沖液，經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明、包埋、切片，然后進行H.E.染色，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.4 病原形態(tài)學(xué)觀察 使用體式顯微鏡對蟲體進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 PCR擴增 將3條蟲體編號為Y1～Y3，按FastDNA SPIN Kit試劑盒說明書所述方法，提取蟲體基因組DNA。使用線蟲通用引物[3](NEMF1:5′-CGCAAATTACCCACTCTC-3′;S3:5′-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3′),通過PCR擴增18S rRNA基因片段。引物由福州尚亞生物公司合成。反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×EasyTaqMix酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。同時設(shè)ddH2O作為陰性對照，使用雞蛔蟲DNA作為陽性對照。通過膠回收純化目的條帶，送往福州鉑尚生物公司進行測序。

1.6 系統(tǒng)進化分析 將測序得到的基因序列與NCBI中公布的相關(guān)基因序列進行對比分析，使用DNAMAN進行同源性比對，采用MEGA 7.0生物軟件繪制鄰近法(Neighbor-joining,NJ)序列系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 病理切片觀察結(jié)果顯示，發(fā)生腸道蛔蟲寄生的番鴨黏膜層腸絨毛排列不規(guī)則，大量腸絨毛脫落，周圍可見大量脫落的上皮細胞，腸腔內(nèi)可見大量壞死的細胞碎片；黏膜層腸腺數(shù)量豐富，排列緊密；肌層局部可見結(jié)締組織增生，并伴有少量炎性細胞浸潤(圖1)。從病理損傷程度判斷，鴨蛔蟲的感染造成了鴨腸道嚴重機械性損傷。

圖1 番鴨小腸病理切片 (H.E.染色，200×)Fig.1 Histopathological section of the small intestine from Muscovy duck (H.E.staining，200×)箭頭：炎性浸潤，腸黏膜脫落Arrow:Inflammatory infiltration and intestinal mucosa abscission

2.2 病原形態(tài)學(xué)觀察 在病鴨腸道內(nèi)壁可以觀察到細長的蟲體，蟲體顏色為褐黃色，腸道內(nèi)容物中觀察到大量蟲體寄生(圖2)。收集蟲體后，通過體視顯微鏡觀察懷疑蟲體為蛔蟲。

圖2 番鴨小腸的蟲體(箭頭)Fig.2 Worms in the small intestine of Muscovy duck (Arrow)

2.3 PCR擴增及系統(tǒng)進化分析 擴增獲得的目的片段大小在744 bp左右(圖3)。切割陽性產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后送往福州鉑尚生物公司進行Sanger雙向測序，獲得Y1～Y3序列。3條鴨源蛔蟲的18S rRNA序列經(jīng)過DNAMAN片段修剪對齊，雙向多序列比對后，片段同源性為100%。選取Y1作為代表株與NCBI數(shù)據(jù)庫中弓首蛔蟲、雞蛔蟲、雞異刺線蟲等蟲種的18S rRNA序列進行同源性比對。結(jié)果如圖4所示，擴增的Y1～Y3鴨源蛔蟲18S rRNA片段種群遺傳上與雞蛔蟲同源性在99%～100%，其次是雞異刺線蟲；Y1～Y3鴨源蛔蟲在進化樹分支上形成了獨立的分支，與Ascaridiagalli(EF180058.1)序列聚合為一支，與弓首蛔蟲屬等形成了獨立分支，且與雞異刺線蟲等分支可信度超過50，置信度較高。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和序列生物同源性分析，本試驗分離自鴨腸道的蛔蟲屬于Ascaridiagalli。

圖3 鴨源蛔蟲18S rRNA的 PCR擴增Fig.3 PCR amplification of 18S rRNA gene from duck-source AscarisM：2K plus DNA相對分子質(zhì)量標準； 1～3：Y1～Y3鴨源蛔蟲18S rRNA基因片段； 4：陽性對照； 5：陰性對照M:2K plus DNA Marker; 1-3:18S rRNA gene fragment of Y1-Y3 strains; 4:Positive control; 5:Negative control

圖4 鄰近法進化樹Fig.4 Phylogenetic tree by Neighbor-joining method▲:鴨源蛔蟲福建株樣本▲:Fujian strains of duck-source Ascaris

3 討論

蛔蟲是一種演化歷史時間較長的寄生蟲，種類繁多。我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中較常見的蛔蟲種類為雞蛔蟲、豬蛔蟲、鴿蛔蟲等，在臨床上多以造成動物腸道損傷為主，寄生數(shù)量較多時會導(dǎo)致動物虛弱甚至死亡。從本試驗病理組織學(xué)觀察結(jié)果來看，蛔蟲的感染寄生造成番鴨腸黏膜損傷、炎性反應(yīng)，造成腸道機械性損傷，表明鴨源蛔蟲對禽腸道具有較強的致病性。

符敖齊等[4]根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察報道了家鵝感染雞蛔蟲的臨床案例，李欣等[5]采用分子生物學(xué)方法通過對核糖體間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)的測定分析，認為分離自鵝腸道的蛔蟲是有別于雞蛔蟲的新種蛔蟲——鵝蛔蟲，這也提示了在現(xiàn)有水禽臨床案例中，基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)歸類的蛔蟲分類可能由于分子生物學(xué)介入而有了更多新種發(fā)現(xiàn)的可能性。有關(guān)雞蛔蟲的分子生物學(xué)研究、臨床防控等已經(jīng)有較多報道[6-11]，但是關(guān)于鴨的蛔目線蟲感染，目前的報道較少，在2020年de Carvalho等[12]報道了異尖線蟲在巴西番鴨的寄生。

國內(nèi)對于鴨源蛔蟲的分子生物學(xué)研究鮮有報道，診斷也多數(shù)停留在了形態(tài)學(xué)鑒定上。本試驗借助分子生物學(xué)技術(shù)對鴨源蛔蟲進行了分子生物學(xué)鑒定，從18S rRNA的基因同源性分析，本試驗中的鴨源蛔蟲屬于雞蛔蟲，這進一步佐證了早期臨床研究中對感染鴨蛔蟲的種類為雞蛔蟲的觀點[1]，為防控鴨群蛔蟲病提供了分子生物學(xué)上的相關(guān)參考。本試驗中雞蛔蟲在鴨蛔蟲腸道中的感染，可能與鴨攝入雞蛔蟲的感染性蟲卵有關(guān)。因此，在臨床養(yǎng)殖中鴨群不應(yīng)與雞等家禽混養(yǎng)，且做好環(huán)境消毒，定期使用阿苯達唑、左旋咪唑等驅(qū)蟲藥物能夠起到防控效果。