李宇鵬 , 吳 丹 , 羅潤波 , 宋仁德 , 格桑卓瑪 , 白 吉 , 索朗斯珠

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院 ， 西藏 林芝 860000 ； 2. 青海玉樹藏族自治州畜牧獸醫(yī)工作站 ， 青海 玉樹 815099 ； 3. 西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 ， 西藏 拉薩 850014)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱魏氏梭菌，兼性厭氧，為可產(chǎn)生芽孢的革蘭陽性大桿菌，廣泛分布于自然界中，是一種重要的人獸共患的條件致病菌[1]；根據(jù)其產(chǎn)生的致死性毒素α、β、ε、ι毒素可將其分為A、B、C、D和E共5個毒素型[2]。其中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α和β毒素，可以引發(fā)人和禽類的壞死性腸炎、初生小牛和羔羊等反芻動物的腸毒血癥、羊猝疽和仔豬紅痢等多種嚴(yán)重疾病，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生較大的危害。據(jù)報道，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起牦牛猝死綜合征，主要的臨床特征有牛舌脫垂、肛門外翻，病理剖檢可見肺敗血癥、腸淤血和腸出血等癥狀[3]。本試驗通過對牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生物特性進行研究，為牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌后續(xù)研究和防治等方面提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 由西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室從青海玉樹地區(qū)牦牛糞樣中分離保存的1株牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為qinghai-12。

1.2 主要試劑和儀器 梭菌增菌液體培養(yǎng)基、7%羊血瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維綿羊血，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)試紙，購自意大利Liofilchem公司；Trans 2K DNA Marker、核酸染料GelStain(10 000×)，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

PCR儀由Applied Biosystems公司生產(chǎn)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，均由美國Bio-Rad生產(chǎn)；高速離心機由德國Eppendorf生產(chǎn)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱由上海博訊實業(yè)有限公司生產(chǎn)；UV-1800PC型紫外可見分光光度計由上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)與觀察 將凍存于-80 ℃的牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌緩慢梯度升溫解凍，三區(qū)劃線法接種于無菌血瓊脂平板，41 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)18～24 h。隨后將單菌落接種至梭菌增菌液體培養(yǎng)基中，41 ℃恒溫厭氧增菌培養(yǎng)16～18 h。革蘭染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 生化鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[4]，利用8種(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、吲哚、乳糖、脂酶、卵磷脂酶、酪蛋白)細(xì)菌微量生化管鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌的基本生化特性。根據(jù)陸承平[5]推薦方法，取對數(shù)生長期的梭菌增菌液體培養(yǎng)基1 mL接種于適量無菌石蕊牛奶液體培養(yǎng)基，在45～47 ℃水浴2 h后，每隔1 h觀察有無“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象，此特性為鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌最為突出的生化特性。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 16S rRNA PCR擴增 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌全基因組DNA，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。根?jù)參考文獻[6]合成細(xì)菌通用16S rRNA引物，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16S rRNA PCR反應(yīng)體系(50 μL)：上、下游引物各1 μL，2×TaqMix酶 25 μL，模板2 μL，去離子水 21 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 終延伸10 min，擴增條帶大小為1 456 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，委托擎科生物科技有限公司進行測序并上傳至NCBI進行序列比對。

1.5.2 多重PCR分型 根據(jù)參考文獻[7]合成產(chǎn)氣莢膜梭菌分型引物(表1)。多重分型PCR體系(50 μL)：上、下游引物(共4對)各1 μL，2×TaqMix酶 25 μL，模板2 μL，去離子水15 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1.6 生長曲線測定 參照祖若夫等[8]介紹的振蕩比濁法(Dλ法)，將1.3中制備好的增菌液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于300 mL梭菌增菌液體培養(yǎng)基，振蕩混勻后均分至15支試管作為試驗組，同時分裝15支無菌梭菌增菌液試管作為空白對照組，石蠟液封，置于41 ℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。每隔2 h取出1支試驗組試管和1支空白對照組試管，以空白對照組進行調(diào)零，利用UV-1800PC型紫外可見分光光度計測定培養(yǎng)液OD600 nm值，每個時間點重復(fù)測量3次，取平均值，連續(xù)測量24 h。以O(shè)D600 nm值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，利用Microsoft Excel 2019軟件繪制出牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長曲線。

1.7 外毒素含量測定 根據(jù)單雪梅等[9]介紹方法，在1.6中測定OD600 nm值時，同時吸取適量菌液，12 000 r/min離心10 min，用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾，制得外毒素粗提取液。分別測定OD280 nm和OD260 nm值，根據(jù)蛋白濃度經(jīng)驗公式計算不同培養(yǎng)時間點培養(yǎng)液的外毒素蛋白質(zhì)含量(ρ)。

ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm

1.8 同源性分析 將測得的牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，在對比結(jié)果中選取來自亞洲地區(qū)且相似度較高的動物菌株序列，下載其序列后利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 MIC測定 挑取單菌落接種于梭菌增菌液體培養(yǎng)基中，待菌液濃度生長至0.5個麥?zhǔn)蠞岫?OD600 nm：0.8～1.3)，用稀釋涂布平板法均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，采用E-test法[10]測定牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌對8種常用抗菌藥物(頭孢噻肟、青霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、四環(huán)素、多黏菌素B、紅霉素、慶大霉素)的MIC。MIC紙條環(huán)尖所對應(yīng)紙條上的數(shù)值就是對應(yīng)抗菌藥對細(xì)菌的最低抑菌濃度，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的《抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)》對測定結(jié)果進行判定[11]。

2 結(jié)果

2.1 牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生長情況觀察 復(fù)蘇菌株在血瓊脂平板上生長為表面光滑、半透明、圓屋頂樣菌落并產(chǎn)生雙溶血環(huán)(圖1)；在梭菌增菌培養(yǎng)基中生長后培養(yǎng)基液體由透亮的黃色變渾濁；革蘭染色鏡檢顯示，牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭陽性大桿菌，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，常單在或成雙排列(圖2)。

圖1 牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌在血平皿上的生長情況Fig.1 Growth of Clostridium perfringens from yak on blood plate

圖2 牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌革蘭染色鏡檢 (1 000×)Fig.2 Gram staining microscopic examination of Clostridium perfringens from yak (1 000×)

2.2 生化鑒定 牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定結(jié)果見表2。該菌株在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化管中呈陽性反應(yīng)；在脂酶和吲哚生化管中呈陰性反應(yīng)。該菌株在石蕊牛奶中牛乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì)，上升到培養(yǎng)基表面，且能發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。牛乳發(fā)酵試驗結(jié)果符合產(chǎn)氣莢膜梭菌基本生化特征。

表2 牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定Table 2 Biochemical identification of Clostridium perfringens from yak

2.3 PCR鑒定 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖3，16S rRNA PCR產(chǎn)物在約1 456 bp處出現(xiàn)條帶，測序比對結(jié)果確定其為產(chǎn)氣莢膜梭菌；毒力分型PCR產(chǎn)物在196 bp和325 bp處出現(xiàn)條帶，檢測到β和α毒素，與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素相符合，可確定菌株qinghai-12為牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖3 16S rRNA(A)和毒力分型(B)的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA (A) and virulence typing (B)M：Trans 2K DNA Marker； -：陰性對照； 1：菌株qinghai-12M:Trans 2K DNA Marker; -：Negative control; 1:Strain qinghai-12

2.4 生長曲線測定 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長曲線見圖4。該菌株在接種后0～4 h內(nèi)處于遲緩期；4～8 h處于對數(shù)生長期；8～24 h為生長平衡的穩(wěn)定期；在測定期間內(nèi)未測量到衰亡期。

圖4 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長曲線Fig.4 Growth curve of Clostridium perfringens type C from yak

2.5 外毒素含量測定 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌不同時間點外毒素蛋白含量見表3，在培養(yǎng)10 h后，該菌株所產(chǎn)毒素的蛋白質(zhì)含量達(dá)4.173 mg/mL，且隨著時間的推移蛋白質(zhì)含量持續(xù)增長。結(jié)果表明，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)外毒素蛋白質(zhì)在10 h時達(dá)到最佳產(chǎn)毒時間，含量達(dá)4.173 mg/mL。

表3 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素蛋白含量Table 3 Toxin protein content of Clostridium perfringens type C from yak

2.6 同源性分析 GenBank中公布的其他產(chǎn)氣莢膜梭菌參考株序列與該菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化發(fā)育樹見圖5，該菌株與北京人源(GenBank登錄號：KP944154.1)、安多牦牛源(GenBank登錄號：MN960262.1)、美國豬源(GenBank登錄號：JQ607422.1)、華東兔源(GenBank登錄號：KX986316.1)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較近的親緣性；與中國野豬源(GenBank登錄號：KX094441.1)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較遠(yuǎn)的親緣性。

圖5 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌 16S rRNA遺傳進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on 16S rRNA of Clostridium perfringens type C from yak▲:本試驗分離菌株▲：Strain isolated in this study

2.7 MIC測定 MIC測定結(jié)果見表4，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素表現(xiàn)為敏感，對紅霉素表現(xiàn)為中度敏感，對慶大霉素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B表現(xiàn)不敏感。

表4 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌 MIC測量結(jié)果Table 4 MIC measurement results of Clostridium perfringens type C from yak

3 討論

生化試驗是利用生物化學(xué)的方法測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件進而鑒別細(xì)菌的試驗[5]。本試驗中所用牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12的生化鑒定結(jié)果與張瑾瑜[12]鑒定結(jié)果相同，均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生化特征。

生長曲線是指以微生物生長量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)所繪制的曲線；常用的微生物生長量的測定方法有對微生物數(shù)量、重量及群體生理指標(biāo)的測定[13]。本試驗選用數(shù)量測定中的比濁法，該方法可連續(xù)測定以獲得即時數(shù)據(jù)。本試驗結(jié)果顯示，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12在接種后的0～4 h內(nèi)處于遲緩期，4～8 h處于對數(shù)生長期，8～24 h為生長平衡的穩(wěn)定期，在測定期間內(nèi)未測量到衰亡期。該結(jié)果與單雪梅等[9]和王開功等[14]測量的生長曲線結(jié)果不同，其原因可能是試驗方案的不同和菌株宿主來源不同。另外，本試驗未能測得衰亡期可能是因為生長后期死菌對菌液渾濁度產(chǎn)生影響，為了更準(zhǔn)確地測定活菌的數(shù)量，應(yīng)配合平板菌落計數(shù)法來對衰亡期菌落數(shù)進行校正。

由于蛋白質(zhì)組成中常有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，且該類氨基酸在280 nm的紫外光處有最大吸收峰[15]，故可根據(jù)280 nm處的吸光度大小來測量蛋白的含量。另外培養(yǎng)液中還存在核酸等成分，其最大吸收峰在260 nm，故可通過經(jīng)驗公式ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm計算蛋白濃度，排除核酸的影響。本試驗利用該方法測得牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12的最佳產(chǎn)毒時間是10 h，此時蛋白質(zhì)含量達(dá)4.173 mg/mL，且隨著時間的推移蛋白質(zhì)含量持續(xù)增長。該結(jié)果與單雪梅等[9]測量的D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的最佳產(chǎn)毒時間為10 h基本一致,與王開功等[14]研究的 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)毒素的最佳時間8 h有所差異，可能同樣是與產(chǎn)氣莢膜梭菌的宿主和毒素型有關(guān)。

MIC是測量抗菌藥物的抗菌活性大小的指標(biāo)之一，指在體外培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長的最低藥物濃度，可以直觀地了解病原菌的耐藥性。本試驗對頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素、紅霉素、慶大霉素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明8種常見抗菌藥進行MIC測定，結(jié)果顯示：牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12對頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素表現(xiàn)為敏感，對紅霉素表現(xiàn)為中度敏感，對慶大霉素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B表現(xiàn)不敏感。依據(jù)牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12來源地為青海，分析該地區(qū)可能存在慶大霉素、復(fù)方新諾明和多黏菌素B的濫用情況，推薦該地區(qū)疑似該菌感染動物優(yōu)先選用頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素類藥物，對紅霉素的使用需慎重，必要時交叉用藥，避免耐藥性的產(chǎn)生。

綜上所述，本試驗復(fù)蘇菌株為牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，其生長特性符合梭菌生長規(guī)律，在梭菌增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h達(dá)到最佳產(chǎn)毒時間，且對慶大霉素、復(fù)方新諾明和多黏菌素B耐藥，對今后牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌后續(xù)研究及防治等方面具有一定的指導(dǎo)意義。