王明，李麗，張亨德，李博

目前，選擇性單囊胚移植已被各生殖醫(yī)學中心廣泛應用，如何準確選擇一枚優(yōu)質囊胚移植是單囊胚移植的核心，更是影響人類輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)助孕結局的關鍵?，F階段胚胎質量的評估主要還是依據形態(tài)學觀察。檢索文獻發(fā)現，關于胚胎發(fā)育過程中出現空泡及空泡對胚胎發(fā)育潛能的影響研究較少，且其相關機制也未明確[1-3]。有研究通過Time-lapse技術觀測發(fā)現，空泡在8細胞胚胎期到桑葚胚期階段發(fā)生更為頻繁且對后續(xù)發(fā)育潛能影響更深[4]。因此，本研究對4 355枚胚胎的囊胚培養(yǎng)數據進行了回顧性分析，探討授精后第4天(D4)出現空泡對胚胎發(fā)育潛能的影響，以期發(fā)現空泡化對胚胎發(fā)育潛能的預測價值，為臨床選擇移植優(yōu)質胚胎提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2021年1～6月唐都醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心行新鮮周期單囊胚移植患者的臨床資料，共計658例患者，709個周期納入本研究。選擇D4胚胎作為研究材料，出現空泡的1 391枚胚胎作為空泡組，同期形態(tài)正常無空泡的2 964枚胚胎作為對照組。進一步根據空泡化程度將胚胎分為一般空泡組(1 016枚胚胎)和嚴重空泡組(375枚胚胎)。比較組間的囊胚形成率、可利用囊胚率及優(yōu)質囊胚率。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方案 體外受精周期中使用GnRH長方案或GnRH拮抗劑方案進行促排卵治療。B超監(jiān)測，當主導卵泡直徑≥18 mm時，或至少有3枚卵泡直徑≥17 mm時，根據激素水平肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(hCG，珠海麗珠)5 000～10 000 IU/艾澤(默克雪蘭諾，意大利)250 μg。在注射34～36 h后，B超引導下經陰道取卵。授精方式根據患者病史及取卵日精子質量選擇采用常規(guī)體外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵胞漿內單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)操作。

1.2.2 胚胎評估 受精后16～18 h評估受精結果，將受精正常的合子放入COOK培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)3～7 d。卵裂胎質量的評估和分類按照下列原則：1級(卵裂球大小均一，沒有或者僅有少許碎片≤5%，無空泡)，2級(卵裂球大小不均勻，碎片10%～20%，有空泡)，3級(卵裂球大小嚴重不均勻，碎片25%，有大量空泡)和4級(卵裂球大小嚴重不均勻，碎片>50%)。1級和2級被認為是優(yōu)質胚胎，3級為可利用胚胎。第3天對擬進行囊胚培養(yǎng)的胚胎換液處理。

胚胎評估時觀察到卵裂球或胚胎面存在空泡則定義為一般空泡組。當大于或等于1/3卵裂球數出現空泡；或空泡面積占比達到胚胎面的1/3則定義為嚴重空泡組。

囊胚質量評估：采用 Gardner囊胚評分系統(tǒng)進行囊胚質量評估。根據內細胞團和外滋養(yǎng)層細胞的發(fā)育對囊胚進行分級，評級標準如下：① 內細胞(ICM)的發(fā)育分為3級：A級為細胞數目多，排列緊密；B級為細胞數目少、排列松散；C級為細胞數目很少。② 外滋養(yǎng)層細胞(TE)的發(fā)育分為3級：A級為細胞數目較多，結構致密；B級為細胞數目少、結構松散；C級為細胞稀疏。內細胞團或外滋養(yǎng)層的評分至少有一項達到C級以上為可利用囊胚，內細胞團和外滋養(yǎng)層的評分均在B級及以上的囊胚為優(yōu)質囊胚。

1.2.3 主要觀察指標 分別計算以下指標：囊胚形成率=囊胚形成數/囊胚培養(yǎng)數×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚數/囊胚形成數×100%；優(yōu)質囊胚率=優(yōu)質囊胚數/囊胚形成數×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

空泡組和對照組在患者年齡、體質量指數(BMI)、基礎FSH值、AMH值、Gn用量和獲卵數方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響

空泡組胚胎的囊胚形成率高于對照組，但優(yōu)質囊胚率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組的可利用囊胚率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響[例(%)]

2.3 不同程度空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響

一般空泡組胚胎的囊胚形成率高于對照組(P<0.001)，但可利用囊胚率和優(yōu)質囊胚率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。嚴重空泡組胚胎的囊胚形成率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，低于一般空泡組(P<0.05)。且嚴重空泡組的可利用囊胚率和優(yōu)質囊胚率均低于對照組及一般空泡組(P<0.001)。詳見表3。

表3 不同程度空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響[例(%)]

3 討論

形態(tài)學評分因其具有快捷、經濟和無創(chuàng)等優(yōu)點，是實驗室最常用的胚胎篩選方式。已有大量關于卵裂數目、卵裂球均一度、碎片化程度及碎片分布對胚胎發(fā)育潛能影響的研究報道[5-7]。而空泡是一種充滿水液的球形膜狀胞質內含物，作為一種較為常見的胚胎異常形態(tài)，在胚胎的各個發(fā)育時間均有可能出現。Ebner T等[8]曾報道，空泡可能是滑面內質網或高爾基體的小空泡融合形成，但目前關于胚胎中空泡的形成原因和機制還未明確。

魏玉蘭等[9]研究發(fā)現，空泡組患者的Gn用量顯著高于對照組。Fancsovits P等[10]和Balaban B等[11]研究發(fā)現，患者年齡、用藥方案及培養(yǎng)環(huán)境都會造成胚胎胞質異常，導致空泡形成。但Zhang JY等[4]選擇D3和D4胚胎作為研究對象，發(fā)現空泡組與對照組患者年齡、基礎FSH值及獲卵數差異均無統(tǒng)計學意義。Ebner T等[8]也發(fā)現兩組間年齡、基礎FSH值、Gn用量、E2水平、LH水平和P水平差異無統(tǒng)計學意義。本研究結果顯示，空泡組與對照組患者年齡、BMI、基礎FSH值、AMH值、Gn用量和獲卵數比較差異均無統(tǒng)計學意義，與Zhang JY等結果一致。

目前，關于空泡的研究大多都集中在卵母細胞和卵裂期胚胎階段，對于桑椹胚空泡化的研究較少。卵母細胞內空泡可能會影響細胞骨架功能的發(fā)揮，從而顯著影響受精和正常的細胞卵裂過程，甚至導致胚胎發(fā)育阻滯[12-13]。Balaban B等[11]報道，解凍復蘇后卵裂期胚胎的胞質空泡會嚴重影響囊胚形成，且優(yōu)質囊胚占比明顯下降。Zhang JY等[4]借助time-lapse技術發(fā)現，卵裂期胚胎空泡組的囊胚形成率及優(yōu)質囊胚率均顯著低于正常組，可利用囊胚率高于正常組；進一步分析顯示兩組間種植率差異無統(tǒng)計學意義，但空泡組的流產率顯著升高。本研究結果也發(fā)現，空泡組的優(yōu)質囊胚率低于對照組，與前期研究一致，證實了空泡會降低胚胎發(fā)育潛能，導致優(yōu)質囊胚率下降。這可能是因為出現空泡會導致胚胎胞質體積縮小，進而造成形成囊胚的細胞數目減少，影響囊胚質量[13]。此外，本研究還發(fā)現與對照組相比，空泡組有更高的囊胚形成率，這與前期研究結果相悖。分析原因可能是，桑葚胚作為囊胚形成前期的獨特形態(tài)，其致密化階段又是空泡形成的高峰期，而空泡的形成可能是胚胎致密化后促進融合形成囊胚的一種方式，因而在空泡組反而有更高的囊胚形成率[14]。

關于空泡的研究只分析了其對于胚胎發(fā)育有無影響，僅少量文獻對空泡化程度進行區(qū)分報道。魏玉蘭等[9]回顧分析了D5出現嚴重空泡化胚胎與正常形態(tài)胚胎的可利用囊胚率、優(yōu)質囊胚率及臨床結局，發(fā)現空泡組的可利用囊胚率及優(yōu)質囊胚率均低于對照組，但兩組間的妊娠率、活產率和流產率差異均無統(tǒng)計學意義。Zhang JY等[4]發(fā)現，在一個卵裂球上有空泡對胚胎發(fā)育的影響遠低于在多個卵裂球上都出現空泡。本研究結果顯示，D4胚胎嚴重空泡組的可利用囊胚率及優(yōu)質囊胚率均低于對照組和一般空泡組。該結果與前期報道一致，提示可將嚴重空泡化視為影響胚胎后續(xù)發(fā)育潛能的不良指標。在胚胎發(fā)育的各個階段，發(fā)生嚴重空泡化的胚胎，可能由于細胞胞質的較大部分會受空泡影響而不能發(fā)揮作用，干擾胚胎的正常生長發(fā)育，甚至會誘發(fā)細胞凋亡，對后續(xù)的發(fā)育潛能造成極大的損傷[8]。本研究還發(fā)現，一般空泡組的可利用囊胚率及優(yōu)質囊胚率與對照組差異無統(tǒng)計學意義，囊胚形成率卻增高，推測D4胚胎出現輕度空泡對后續(xù)發(fā)育潛能可能并無影響，反而可以一定程度促進囊胚的形成。

挑選高發(fā)育潛能的優(yōu)質胚胎進行移植是ART助孕成功的重要環(huán)節(jié)[15]，在ART周期中，大部分移植的是卵裂期胚胎或囊胚，很少嘗試選擇D4的桑葚胚進行移植。但隨著技術的不斷創(chuàng)造革新及培養(yǎng)液的研發(fā)完善，桑葚胚移植逐漸進入人們視野。相關研究發(fā)現，D4和D5單胚胎移植的臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學意義[16-17]，選擇D4胚胎移植不僅可以降低因胚胎發(fā)育遲緩或停滯而取消移植的風險，還可以一定程度減少體外培養(yǎng)對胚胎帶來的表觀遺傳學改變。鑒于桑葚胚移植的諸多積極方面，如何評估D4胚胎已成為生殖醫(yī)學熱議的話題[14,18-20]。目前，D4胚胎的評估尚無共識，需要從多個方面去論證優(yōu)質胚胎的評定標準。

綜上所述，本研究發(fā)現D4一般空泡組胚胎的囊胚形成率高于對照組，嚴重空泡化D4胚胎的可利用囊胚率和優(yōu)質囊胚率均低于對照組和一般空泡組胚胎。推測嚴重空泡化可作為影響胚胎發(fā)育潛能的負向指標，在進行胚胎評估時應慎重對待。本研究對預判空泡化D4胚胎的發(fā)育潛能，挑選最優(yōu)質胚胎進行移植有一定參考價值。另外，本研究尚未涉及到空泡化胚胎的臨床結局，還需要繼續(xù)跟蹤研究。