劉劍鋒，湯劍明，陽蓮，程建紅，李露，洪莉

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種存在于骨髓結(jié)締組織中的基質(zhì)細(xì)胞，具有廣泛的增殖能力以及多向分化的潛能，是組織修復(fù)方向的研究熱點(diǎn)[1]。目前BMSCs被廣泛用于多種疾病的治療和研究，如心肌梗死[2]、肢體缺血[3]、壓力性尿失禁[4]等。目前，BMSCs提取方法有多種，包括全骨髓差速貼壁法[5]、密度梯度離心法[6]、免疫磁珠分選法[7]等。然而，BMSCs的生長(zhǎng)增殖受多種因素的影響，其體外培養(yǎng)條件及方法尚無統(tǒng)一觀點(diǎn)。血清是細(xì)胞培養(yǎng)過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，當(dāng)下市面上的血清種類多樣，成分、來源不同，使BMSCs的分離培養(yǎng)效果具有差異。本文采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行C57BL/6小鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)，選用配置10%濃度的血清培養(yǎng)基[8-9]，并探究在相同實(shí)驗(yàn)條件下含兩種不同品牌胎牛血清(Yeasen血清，Gbico血清)的培養(yǎng)基對(duì)BMSCs細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)以及生長(zhǎng)周期的影響，從而為BMSCs體外分離培養(yǎng)的血清選擇提供更加優(yōu)化的方案，以服務(wù)于臨床和科研。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體重15～20 g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

0.25%胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，中國(guó)，Yeasen公司，貨號(hào)：40130es76),DMEM/F12 培養(yǎng)基(Hyclone) 、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,美國(guó)，Gibco公司，貨號(hào)：10099-141)，Cell Counting Kit-8(CCK-8) 試劑盒(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司),臺(tái)盼藍(lán)染液(凱基生物公司)，青鏈霉素，兔抗小鼠CD34、44、90及106多克隆抗體(Ⅰ抗，美國(guó)Santa Cruz 產(chǎn)品),兔抗小鼠CD34、CD44、CD90、CD106(Ⅰ抗，Abcam公司)。Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen公司,貨號(hào)：MUBMX-90021)，Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen公司,貨號(hào)：MUBMX-90031)。

培養(yǎng)基配制：Yeasen胎牛血清組：10% Yeasen胎牛血清+89% DMEM/F12+1%青鏈霉素；Gibco胎牛血清組：10% Gibco胎牛血清+89% DMEM/F12+1%青鏈霉素。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)，25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，六孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱(中國(guó)香港，Healforce)，普通倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本，Olympus)，酶標(biāo)儀(美國(guó)，Waltham MA)，低溫離心機(jī)(德國(guó)，Eppendorf)。

1.4 小鼠BMSCs的原代分離和培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死小鼠，酒精浸泡2～3 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，組織鑷剝離干凈股骨和脛骨上附著的肌肉等組織(見圖1)放入含10%青鏈霉素的PBS液中清洗3遍，剪去股骨和脛骨的骨骺端，暴露骨髓腔，用10 mL注射器吸取DMEM-12完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白。隨后1 000 r/min 離心含有骨髓細(xì)胞的懸液5 min，棄上清液，重懸細(xì)胞沉淀經(jīng)均勻轉(zhuǎn)入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶里，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)其細(xì)胞活力，放入37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)共分為兩組：Yeasen組：含10% Yeasen胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基組；Gbico組：含10% Gbico胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基組，36 h后首次換液，72 h后半定量換液，隨后每2 d換液1次。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡(100×)下，每24 h觀察兩組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中原代細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征。

1.7 免疫熒光檢測(cè)

采用第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)傳代至六孔板培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，取出預(yù)先放置于6孔培養(yǎng)板中爬滿細(xì)胞的蓋玻片，PBS 沖洗3次，每次3 min；40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗3次，每次3 min；3 g/L 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)孵育30 min，PBS 沖洗3次，每次3 min；FBS室溫封閉30 min，棄去，分別加兔抗小鼠CD34、CD44、CD90、CD106(1∶200)一抗4℃過夜，PBS 沖洗3 次，每次 3 min；羊抗兔IgGⅡ抗室溫1 h，PBS 沖洗3次，每次 3 min;熒光倒置顯微鏡(400×)下觀察，并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 BMSCs誘導(dǎo)分化

成骨：取第3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用0.25% Trypsin-0.04% EDTA進(jìn)行消化，以2×104/cm2密度均勻鋪至0.1%明膠包被的6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合到60%～70%時(shí)，換用2 mL Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)2～4周后，茜素紅染色。

成脂：取第3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25% Trypsin-0.04% EDTA進(jìn)行消化，以2×104/cm2密度均勻鋪至6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合到100%時(shí)，換用2 mL Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)16～27 d后，油紅O染色。

1.9 生長(zhǎng)曲線繪制

采用第三代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種到96孔板，每孔100 μL，每組副孔3 個(gè)，放置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞貼壁0.5 h；棄去上清，每孔加CCK-8 10 uL;在 37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其 450 nm處吸光度。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照 CCK-8檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，重復(fù)4次，求其平均值，連續(xù)檢測(cè)8 d，并繪制其細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

采用倒置顯微鏡分別觀察原代以及傳代后不同時(shí)間段(2 d、4 d、6 d)BMSCs的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，原代剛接種的BMSCs呈圓形，大小不一，懸浮于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2 d后細(xì)胞開始貼壁，貼壁細(xì)胞多呈梭形或多角形，出現(xiàn)成團(tuán)生長(zhǎng)現(xiàn)象。其中，Gbico組細(xì)胞較Yeasen組，成團(tuán)生長(zhǎng)現(xiàn)象更為明顯且細(xì)胞生長(zhǎng)密度更大。后在4 d、6 d 的倒置圖像也顯示出，Gbico組細(xì)胞密度明顯高于Yeasen組。詳見圖 2。

圖2 兩種品牌血清培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs在2 d、4 d、6 d的細(xì)胞形態(tài)(100×)

2.2 免疫熒光鑒定

在熒光倒置顯微鏡(400×)下觀察BMSCs的表面抗原標(biāo)志物CD34、44、90、106的表達(dá)。結(jié)果顯示，在梭形或多角形的P3細(xì)胞的免疫熒光圖像中,CD106、CD90和CD44為陽性表達(dá)，CD34為陰性表達(dá)，如圖3。

圖3 BMSCs 表面抗原熒光檢測(cè)情況(400×)

2.3 細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化

第3代BMSCs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)，在7 d后可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，誘導(dǎo)21 d時(shí)可見多處鈣結(jié)節(jié)沉積，茜素紅染色陽性；成脂誘導(dǎo)第12天，可見多量圓形細(xì)胞，從第12～20天，圓形細(xì)胞內(nèi)部有脂滴形成并逐漸增多，油紅O染色可見密集紅色脂滴，如圖4。

圖4 BMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化(100×)

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)

通過CCK-8法分別從0 d、2 d、4 d、6 d、8 d測(cè)得細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，從而間接反映小鼠BMSCs的生長(zhǎng)趨勢(shì)，結(jié)果顯示含10% Gbico血清與10% Yeasen血清的BMSCs都呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，無血清培養(yǎng)基組細(xì)胞未見增長(zhǎng)。相較于Yeasen組，Gbico組的BMSCs生長(zhǎng)趨勢(shì)更為顯著。如圖5。

圖5 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是存在于骨髓腔與多個(gè)組織器官的成體干細(xì)胞，可以分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等組織，具有多向分化潛能[10-12]。同時(shí)，干細(xì)胞療法在多種組織修復(fù)的研究中表現(xiàn)出巨大潛力[13-15]。然而，BMSCs在小鼠骨髓中含量少、存活率低、提取困難，其體外分離培養(yǎng)的難度很大。常用的MSCs體外分離培養(yǎng)方法包括：差速貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和細(xì)胞表面標(biāo)志物分選法4種方法[16]。

本次實(shí)驗(yàn)采用差速貼壁法提取小鼠BMSCs，是一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的分選方法，根據(jù)骨髓細(xì)胞群的貼壁能力以及對(duì)胰酶的敏感程度不同，在換液以及胰酶消化傳代過程中不斷分離出BMSCs。在體外分離實(shí)驗(yàn)后，通過倒置顯微鏡觀察到了呈梭形或多角形、團(tuán)狀生長(zhǎng)的MCSCs，隨著時(shí)間的推移數(shù)量明顯增多。BMSCs的表型具有間充質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)，一般通過不表達(dá)CD14、CD34等，表達(dá)CD44、CD90、CD106等標(biāo)志，對(duì)BMSCs進(jìn)行初步鑒定[17-18]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群高表達(dá)CD44、CD90、CD106，低表達(dá)CD34。免疫熒光圖片與倒置顯微鏡圖說明了BMSCs的成功分離與增殖。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用BMSCs成骨、成脂分化培養(yǎng)基對(duì)BMSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)，通過茜素紅染色(+)與油紅染色(+)表明了誘導(dǎo)的成功，進(jìn)一步說明了BMSCs的多向分化能力。

BMSCs對(duì)血清、培養(yǎng)基等微環(huán)境敏感，體外培養(yǎng)需要苛刻的環(huán)境條件。目前，市面上的血清種類復(fù)雜、來源多樣、成分不清，對(duì)不同細(xì)胞的培養(yǎng)效果差異較大[19]。KuboH等[20]在BMSCs的培育中發(fā)現(xiàn)，相較于自體血清，補(bǔ)充普通胎牛血清BMSCs的血小板減少趨勢(shì)明顯，更有利于其增殖。本文結(jié)合了以往的大量研究文獻(xiàn)，選用了兩種常用的特級(jí)胎牛血清：Yeasen胎牛血清和Gbico血清，以10%血清+89%DMEM/F12+1%雙抗比例配置培養(yǎng)基，對(duì)兩種培養(yǎng)基進(jìn)行比較，以觀察BMSCs在兩種培養(yǎng)基環(huán)境中的生長(zhǎng)狀態(tài)。通過倒置圖片發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)基都發(fā)生了BMSCs的生長(zhǎng)與增殖。但是，含Gbico血清的培養(yǎng)基相較于含Yeasen胎牛血清的培養(yǎng)基，BMSCs的數(shù)目增多更為明顯。并進(jìn)一步通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞以及無血清條件下的BMSCs在0、2、4、6、8d的數(shù)目，繪制了生長(zhǎng)曲線，以觀察細(xì)胞活力與生長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)果顯示，兩種血清環(huán)境下BMSCs都表現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中Gbico血清促進(jìn)效果更加明顯，而Yeasen血清有著更加優(yōu)惠的價(jià)格。Gbico胎牛血清來自澳洲，Yeasen胎牛血清選自南美，這兩種特級(jí)胎牛血清都有著低含量的內(nèi)毒素與血紅素，為干細(xì)胞培養(yǎng)提供了合適的生長(zhǎng)環(huán)境，二者表現(xiàn)上的差異可能與Gbico胎牛血清能夠提供與體內(nèi)更加相似的環(huán)境有關(guān)。關(guān)于造成這一差異的更深層次原因，其血清內(nèi)具體成分以及這些成分與BMSCs的關(guān)系如何，值得進(jìn)一步探究。

本研究從BMSCs的體外分離培養(yǎng)、鑒定、分化等一系列過程進(jìn)行了較為全面的探究?？傊煌愋偷难宕_實(shí)會(huì)影響到BMSCs的體外培養(yǎng)。通過差速貼壁法快速簡(jiǎn)便地獲取該細(xì)胞，含10%Yeasen血清與10%Gbico血清的DMEM/F12培養(yǎng)基都適用于該細(xì)胞的體外培養(yǎng)。其中Yeasen血清有著更高的性價(jià)比，10%Gbico則在促進(jìn)增殖方面表現(xiàn)更加良好。