柴仲秋 周 冰 張靜莎 韓云雨

(1 天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,天津,300451; 2 天津中醫(yī)藥大學,天津,301608)

近年來，中醫(yī)辨證論治在結直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)治療方案中逐漸成為不可忽視的一環(huán)，其積極作用也日益顯現(xiàn)。然而由于缺乏客觀、穩(wěn)定的診斷及療效評價指標，中醫(yī)證候的辨識多顯得模糊不穩(wěn)定。因此，探尋中醫(yī)證候標志性因子，為中醫(yī)證候客觀化提供依據一直以來是研究的熱點和方向。課題組在前期對臨床CRC患者進行辨證分析，發(fā)現(xiàn)血瘀證為臨床常見證候之一，因此應用iTRAQ定量蛋白質組學對血瘀證腫瘤組織和正常組織的差異表達蛋白進行了比較和分析。

1 資料與方法

1.1 資料與材料 選取2012年8月至2019年8月因CRC就診于天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院行手術治療的患者158例進行臨床資料采集和中醫(yī)證候調查。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號：201201012)。手術切除腫瘤后每例標本分別取癌灶腸管組織及遠端正常腸管組織(距腫瘤邊緣5～8 cm，具體根據截取腸管長度，選擇最遠端正常組織)，各2份，立即置于液氮凍存。

1.2 診斷標準 參照中華中醫(yī)藥學會《中醫(yī)肛腸科常見病診療指南》[1]、Dukes分期及AJCC/UICC TNM分期標準進行病情分期判定[2]。

1.3 納入標準 1)CRC初發(fā)患者;2)年齡<85歲的患者;3)已簽署知情同意書者。

1.4 排除標準 1)入組前已經接受放化療患者;2)伴有急性闌尾炎、腹膜炎等其他急腹癥癥狀的患者;3)合并嚴重的心、肝、腎、腦等臟器器質性或功能性疾病患者;4)意識或言語表述不清的患者;5)無法判斷中醫(yī)證型及資料不全患者。

1.5 試劑與儀器 iTRAQ?試劑盒中的還原劑(AB Sciex公司，美國，貨號：4381664)、iTRAQ?試劑盒中的Cysteine-Blocking試劑(AB Sciex公司，美國，貨號：4381664)、iTRAQ?試劑盒中的解散緩沖試劑(AB Sciex公司，美國，貨號：4381664)、胰蛋白酶(AB Sciex公司，美國，貨號：4370285，4352157)，溶于解散緩沖試劑；高效液相色譜儀：[Thermo Scientic公司，美國，型號：EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC)]、質譜系統(tǒng)(Thermo Scientic公司，美國，型號：Q-Exactive)。

1.6 證候調查方法 結合中醫(yī)專家臨床經驗制訂《結直腸癌中醫(yī)證候調查初表》，并請2名中醫(yī)主任醫(yī)師對該表進行審核及修正。由2名主治醫(yī)師依照中醫(yī)證候采集表對158例患者進行一般情況及中醫(yī)四診信息的調查。采取雙人核對錄入的方法將數(shù)據錄入Epidata 3.0流行病學軟件建立數(shù)據庫。對接受擇期手術的患者進行詳細的術式及病理信息采集。

1.7 蛋白提取 將樣本用液氮預冷的砸碎器砸碎，液氮研磨，按照1∶10(W/V)加入裂解液{7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲，4% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate,CHAPS)}，渦旋混勻，室溫提取30 min；40 000×g，10 ℃離心1 h，小心取出上清，分裝后凍存于-80 ℃。同時進行分組標記。二喹啉甲酸法(Bicinchoninic Acid，BCA)法定量檢測蛋白質水平。

1.8 蛋白酶解及標記 蛋白定量后取200 μg蛋白溶液置于離心管中，按照iTRAQ試劑盒操作說明得到100 μL酶解后的樣品，并分別進行標記，腫瘤組織標記為117，正常組織標記為118。

1.9 酶解肽段離線預分離及液質色譜-串聯(lián)質譜法(Liquid Chromatography-mass Spectroscopy/Mass Spectrometry，LC-MS/MS質譜分析

1.9.1 高pH條件下的反相色譜分離 用100 μL的流動相A溶解混合標記后的樣品，使用400 μg酶解好的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)進行分離，取100 μL準備好的樣本上樣，流速0.7 mL/min分離。取100 μL準備好的樣本上樣；流速0.7 mL/min梯度分離。

1.9.2 納升級反相色譜-Q-Exactive進行蛋白質分析 將高pH反相分離得到的組分用20 μL 12%ACN，0.1%FA復溶;12 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm，吸取上清上樣;上樣體積8 μL，采取夾心法上樣;Loading Pump流速3 μL/min，5 min;分離流速0.3 μL/min。設置質譜參數(shù)后，進行質樸分析。

1.9.3 質譜數(shù)據分析 在本次實驗中選擇的數(shù)據庫來自美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，數(shù)據庫本版為Ref_Human_130704。iTRAQ的質譜分析是由Thermo Q-Exactive型質譜完成，產生的質譜原始文件采用Thermo公司的配套商用軟件Proteome Discoverer1.3處理。

1.9.4 數(shù)據的生物信息解析 將組間的差異表達蛋白輸入Uniprot數(shù)據庫進行功能和基因檢索，將對應基因保存為TXT文件，輸入到Metascape，選擇選擇H.Sapiens，然后選擇Express Analysis，可自動生成對差異表達蛋白進行的通路富集和分析。

2 結果

2.1 證候調查結果 證候診斷為血瘀證的患者共24例，男13例，女11例，平均年齡為(58.43±16.05)歲；TNM分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期6例、Ⅲ期3例；病理大體分型：隆起型6例、潰瘍型13例、浸潤型5例；病理類型：腺癌19例、黏液腺癌2例、印戒細胞癌2例、腺癌并印戒細胞癌1例。

2.2 差異表達蛋白識別 根據蛋白定量信息，選取上下調差異倍數(shù)≥1.4的蛋白作為差異蛋白結果。在血瘀證組織比較中，腫瘤組織較遠端正常組織差異蛋白共55個，其中上調13個。見表1。下調42個。見表2。

表1 血瘀證腫瘤組織與正常組織比較

表2 血瘀證腫瘤組織與正常組織比較

續(xù)表2 血瘀證腫瘤組織與正常組織比較

2.3 差異表達蛋白分析 應用Metascape對差異表達蛋白進行通路富集顯示，差異表達蛋白多集中在紅細胞吸收氧氣并釋放二氧化碳、超分子纖維組織、表皮細胞分化、核心組織、NABA核心母體、對無機物的反應、Nop56p相關前rRNA復合體、中性粒細胞遷移、DNA結合的調控、水解酶活性負調節(jié)、脂肪酸衍生物代謝過程、上皮細胞增殖的正調控和生物氧化等通路。見表3、圖1。基因本體(Gene Ontology,GO)分析主要生物過程集中紅細胞吸收氧氣并釋放二氧化碳、角化、核心組織、超分子纖維組織、血壓調節(jié)和整合素途徑。見圖2。

表3 差異表達蛋白的通路富集

圖1 差異表達蛋白通路富集

圖2 GO富集分析主要生物過程

3 討論

CRC是胃腸道中常見的惡性腫瘤，在我國以41～65歲人群發(fā)病率較高。近20年來，尤其在城市中，發(fā)病率明顯上升[4]。CRC的發(fā)病發(fā)展是多步驟、多階段及多基因參與的過程[5]。以往關于CRC的研究大多是基于其臨床病理數(shù)據(例如腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、淋巴結及血管浸潤等)和單分子生物標志物[例如癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)及糖類抗原199(Carbohydrate Antigen199，CA199)、CA125等]所作的預測[6-8]。隨著研究的不斷進展，研究者認為基于蛋白水平的研究相較于RNA水平更有利于在臨床上應用[9]。

考慮到影像學在CRC分期中的影響[10-12]，課題組均以術后標本病理結果進行臨床分期作為納入標準的依據。在通過比較血瘀證腫瘤組織和正常組織的差異表達蛋白發(fā)現(xiàn)，差異表達蛋白主要集中在紅細胞吸收氧氣并釋放二氧化碳、超分子纖維組織、表皮細胞分化、核心組織、NABA核心母體、對無機物的反應、Nop56p相關前rRNA復合體、中性粒細胞遷移、DNA結合的調控、水解酶活性負調節(jié)、脂肪酸衍生物代謝過程、上皮細胞增殖的正調控和生物氧化等過程中。

既往有研究發(fā)現(xiàn)在大腸癌發(fā)生、侵襲、轉移過程中，某些病理因素導致機體循環(huán)障礙而發(fā)生組織缺氧，使血管活性因子之間的動態(tài)平衡發(fā)生改變，表現(xiàn)出不同程度的外周微循環(huán)障礙[13]，血瘀證CRC患者的組織存在明顯缺氧癥狀，“血管生成開關”動態(tài)平衡發(fā)生改變，引發(fā)血管的高阻力狀態(tài)，進而發(fā)生大腸癌血管新生的病理變化，并進一步研究證明活血化瘀中藥可能是通過調節(jié)缺氧微環(huán)境來抑制大腸癌血管新生，也為缺氧致血瘀提供了有力的科學依據[14]。這與本研究發(fā)現(xiàn)的血瘀證腫瘤組織和正常組織的差異表達蛋白集中在紅細胞吸收氧氣并釋放二氧化碳的生物過程中的結果有相同之處。

CRC血瘀證腫瘤組織與正常組織的差異表達蛋白的研究，為研究中醫(yī)證候本質提供了一些新的方向，但仍有其技術的局限性。在中醫(yī)證候本質的研究中，除蛋白組學外，研究者還嘗試應用多數(shù)據庫分析[15-16]、代謝組學[17-19]、網絡生物學[20]、系統(tǒng)生物學[21-22]、表觀遺傳學[23-24]以及基因多態(tài)性[25]等方法來嘗試相關研究，為該領域研究方法的探討提供了更多的研究方案和思考。