蘇曉鵬 晏 軍 張潞潞 李玲孺 黨志博 李 玲 周怡馳 胡世平

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京，100700； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 3 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京，100700； 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院肝病科，深圳，518172)

原發(fā)性肝癌(Primary Hepatic Carcinoma，PHC)是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的一種常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率均較高，國(guó)際癌癥研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)2018年報(bào)告指出肝癌發(fā)病率位于第6位，病死率位于第4位，男性癌性死亡位于第2位[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)此病最有效的治療方法是肝切除術(shù)、肝移植，但是該病起病較隱匿，早期癥狀不典型，且病情進(jìn)展迅速，僅有不到30%的患者得到了最佳治療[2]。絕大數(shù)患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，從而選擇射頻消融術(shù)(Radio Frequency Ablation,RFA)、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞化療(Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE)以及放射治療，這些治療可以提高患者的生存率，但是在治療過(guò)程均會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，如發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐等[3]。

中醫(yī)學(xué)對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)歷史悠久，內(nèi)容豐富。肝癌的臨床表現(xiàn)在中醫(yī)古代文獻(xiàn)中的記載散見(jiàn)于“伏梁”“肝積”“癥瘕”“積聚”“鼓脹”“肥氣”等病，如《難經(jīng)·五十六難》中記載“肝之積，名曰肥氣。在左脅下如覆杯，有頭足”。現(xiàn)代醫(yī)家結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)，認(rèn)為該病的病理性質(zhì)為虛實(shí)夾雜，同時(shí)依據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》有“邪之所湊，其氣必虛”和“壯人無(wú)積，虛人則有之”的理論,多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為正氣虧虛是該病發(fā)生的核心病機(jī)[4]。氣是構(gòu)成也是維持人體生命活動(dòng)重要的物質(zhì)，氣一旦失常，可引起各種病理反應(yīng)，如氣虛血郁、氣虛痰郁、氣滯毒瘀等。因此在臨床治療時(shí)，大多醫(yī)家以“扶正解毒”為大法治療肝癌患者，皆取得較好的療效[5-6]，同時(shí)在中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)中醫(yī)治療可大大降低西藥治療的不良反應(yīng)[7-8]。

針對(duì)肝癌的核心病機(jī)，臨床醫(yī)家常用黃芪扶正治肝癌[9]。黃芪性甘微溫，質(zhì)輕升浮，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、補(bǔ)脾益肝等功效?！侗静菥V目》記載“黃芪甘溫純陽(yáng)，其用有五：補(bǔ)諸虛不足，一也；益元?dú)?，二也；壯脾胃，三也……活血生血”，由此可?jiàn)黃芪乃“補(bǔ)氣之長(zhǎng)”。此外重用黃芪還有利于增強(qiáng)肝的疏泄功效，名醫(yī)張錫純?cè)凇夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中講到“肝屬木而應(yīng)春令，其氣溫而性喜條達(dá)，黃芪之性溫而上升，以之補(bǔ)肝原有同氣相求之妙用”。在黃芪扶正基礎(chǔ)上加用丹參治療肝癌之“毒”，丹參性苦，微寒，具有活血祛瘀、消腫止痛等功效。前人有“一味丹參，功同四物”之說(shuō)，可見(jiàn)其活血而不傷正氣，用其治療肝癌本虛有瘀毒者最為合適，再者黃芪配合丹參，可以使黃芪補(bǔ)而不滯。黃芪和丹參治療肝癌以及其他腫瘤的藥理學(xué)研究較多[10-12]，但是黃芪和丹參藥對(duì)是如何發(fā)揮抗肝癌的作用機(jī)制仍未闡明，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以黃芪-丹參-肝癌為研究對(duì)象，構(gòu)建中藥藥對(duì)、化學(xué)成分、基因靶點(diǎn)、相關(guān)通路之間的關(guān)聯(lián)性，初步揭示黃芪-丹參治療肝癌的作用機(jī)制，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞HepG2,由中國(guó)科學(xué)院基因所饋贈(zèng)，并由上海富衡生物科技有限公司鑒定，鑒定編號(hào):20171012-01。

1.1.2 藥物 黃芪-丹參藥對(duì)藥液：黃芪30 g、丹參20 g。均購(gòu)自三九藥業(yè)，批號(hào)分別為：2101002W、2012007W。取稱(chēng)量紙一張，用電子天平稱(chēng)取0.5 g黃芪-丹參顆粒溶解于10 mL細(xì)胞高糖培養(yǎng)基中，用10 mL注射器與0.22 μm除菌過(guò)濾器將溶解好的液體過(guò)濾至新的15 mL離心管中，即為黃芪-丹參藥對(duì)藥液，存于4 ℃冰箱。

1.1.3 試劑與儀器 澳洲胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó)，批號(hào)：1009-141、C11995500BT)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA)(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GP3108-100ML)；Cell Counting Kit-8(北京蘭博利德生物公司，批號(hào)：CK001-500T)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒[凱基生物(KeyGEN)公司，批號(hào)：KGA108-1]；實(shí)時(shí)PCR試劑盒(中國(guó)全式金公司，批號(hào)：AQ131-01)；超凈工作臺(tái)(廣州展晨生物科技有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1FD)；CO2培養(yǎng)箱(三洋電機(jī)株式會(huì)社，日本，型號(hào)：SANYOXD-101)，細(xì)胞流式儀(BD公司，美國(guó),型號(hào)：C6)；PCR儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，型號(hào)：C1000]。

1.2 方法

1.2.1 黃芪-丹參藥對(duì)的活性成分收集 本研究依據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp)以Herb name檢索方式搜集黃芪、丹參藥對(duì)的活性成分[13]。并依據(jù)成分毒藥物動(dòng)力學(xué)(Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME)將搜集到的活性進(jìn)行篩選，篩選條件為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18。除此之外查閱相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)的不足。

1.2.2 建立黃芪-丹參藥對(duì)活性成分基因靶點(diǎn)庫(kù)及相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出來(lái)黃芪-丹參有效成分分別帶入TCMSP平臺(tái)的Related Target中，搜集相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白名。隨后利用Unitprot(https://ebi14.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和基因名，并對(duì)黃芪-丹參藥對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行相應(yīng)的基因匹配。

1.2.3 肝癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集 在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com)、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)、治療性靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database，TTD)、人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https://www.genecards.org)系統(tǒng)中以“Liver Cancer”為檢索詞查詢肝癌疾病基因靶點(diǎn)，將上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的基因靶點(diǎn)匯總并刪除重復(fù)值。

1.2.4 核心靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將黃芪-丹參藥對(duì)與肝癌疾病的交集靶點(diǎn)上傳至String 11.0(http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，調(diào)制物種名為“Homo Sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置選項(xiàng)設(shè)為默認(rèn)值后進(jìn)行藥物成分蛋白和疾病蛋白的相互作用分析，隨后將得到的PPI通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件達(dá)到網(wǎng)絡(luò)的可視化，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

1.2.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 使用Metascape(http://metascape.org)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃芪-丹參藥對(duì)作用于肝癌的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG富集分析，設(shè)置閾值P<0.05，初步預(yù)測(cè)黃芪-丹參藥對(duì)治療肝癌的相關(guān)作用機(jī)制。運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，從生物過(guò)程(Biological Processes，BP)、分子功能(Molecular Functions，MF)、細(xì)胞組分(Cellular Components,BC)3個(gè)方面對(duì)黃芪-丹參藥對(duì)治療肝癌的交集基因進(jìn)行CO功能富集分析。

1.2.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將96孔板分為9組，每組6個(gè)復(fù)孔。第1組為無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照，第2組為無(wú)藥液的純細(xì)胞對(duì)照組，黃芪-丹參藥液對(duì)應(yīng)的余下8組分別為：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、400 mg/L。隨后用已孵育48 h的細(xì)胞計(jì)數(shù)種板，每孔1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞于100 μL培養(yǎng)基，每組先配制好該組所需要孔數(shù)的細(xì)胞懸液和藥液再進(jìn)行種板。96孔板種好后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。48 h后，將提前融化好的CCK-8溶液于每孔中加入10 μL，于培養(yǎng)箱中孵育2～4 h；2～4 h后，用熒光化學(xué)發(fā)光儀中的Ascent Software Version 2.6軟件在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，進(jìn)行熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的讀取和保存。

1.2.7 Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化2 nim，隨后用含血清培養(yǎng)基終止胰酶消化，以1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min后棄上清，并用1 mL磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗1～2次，再次以1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min后棄上清液；用1 mL 1×結(jié)合緩沖液Binding Buffer加入離心管并重懸細(xì)胞,使細(xì)胞的密度達(dá)到1×106個(gè)/mL。隨后向預(yù)先標(biāo)記好的流式管中加入100 μL細(xì)胞(1×105個(gè))，并依次向流式管內(nèi)加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光后再加入10 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide,PI)，室溫避光，染色5 min，最后向管內(nèi)加入PBS保證每個(gè)流式管的含細(xì)胞液體體積為500 μL，輕輕混勻。在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因 根據(jù)樣本數(shù)計(jì)算所需板孔，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。稀釋樣本：稀釋5倍，加DEPC水80 μL于逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA中并混勻。引物稀釋?zhuān)喊凑找镎f(shuō)明書(shū)稀釋引物。配制混合物：每孔：前引物1 μL，后引物1 μL，TBGreen 10 μL，H2O 6 μL，共18 μL。根據(jù)排板，每孔加入2 μL cDNA樣本和18 μL上述配好的混合物。震蕩混勻，上機(jī)反應(yīng)、檢測(cè)。使用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)量為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物序列見(jiàn)下表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 黃芪丹參藥對(duì)活性成分篩選結(jié)果 得到黃芪有效成分20個(gè)，黃芪活性成分22個(gè)。丹參活性成分65個(gè)，其中黃芪無(wú)靶點(diǎn)活性成分5個(gè)，丹參無(wú)靶點(diǎn)活性成分6個(gè)，最終篩選得到76個(gè)活性成分。見(jiàn)表2。隨后利用Cytoscape繪制中藥-成分-靶點(diǎn)圖，繪制過(guò)程計(jì)算Degree值，通過(guò)比較Degree值大小后發(fā)現(xiàn)槲皮素、毛蕊異黃酮、沒(méi)食子酸酯、丹參新醌為主要活性成分。見(jiàn)圖1。

表2 黃芪-丹參主要活性成分及OB和DL值

續(xù)表2 黃芪-丹參主要活性成分及OB和DL值

續(xù)表2 黃芪-丹參主要活性成分及OB和DL值

圖1 黃芪-丹參有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 黃芪-丹參藥對(duì)治療肝癌的靶標(biāo)篩選 刪除重復(fù)靶點(diǎn)后黃芪丹參藥對(duì)共216個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)多個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)以“Liver Cancer”為檢索詞檢索共獲得1 310個(gè)靶點(diǎn)。最后通過(guò)構(gòu)建韋恩圖，從中獲得黃芪-丹參藥對(duì)和肝癌疾病共同靶點(diǎn)118個(gè)，即核心靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪-丹參藥對(duì)與肝癌疾病的韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 共形成283個(gè)PPI關(guān)系對(duì)，平均連接度為6.99。見(jiàn)圖3。處于節(jié)點(diǎn)度前10位的蛋白為AKT1、JUN、MAPK1、MAPK8、IL6、MAPK14、FOS、ESR1、EGFR、CCND1。這些靶蛋白可能是黃芪-丹參藥對(duì)治療肝癌的最為緊要的核心靶點(diǎn)。

圖3 黃芪-丹參藥對(duì)與肝癌疾病核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能富集分析 黃芪-丹參藥對(duì)主要參與的生物過(guò)程為對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)的應(yīng)答過(guò)程(Apoptotic Signaling Pathway)、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的應(yīng)答(Response to Inorganic Substance)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的應(yīng)答(Cellular Response to Organic Cyclic Compound)、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)(Response to Toxic Substance)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的應(yīng)答(Cellular Response to Lipid)。分子功能集中在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合方面(Transcription Factor Binding)，其細(xì)胞組分主要集中在膜筏(Membrane Raft)和轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor Complex)。見(jiàn)圖4。

圖4 GO(BP、CC、MF)功能富集分析柱狀圖

2.5 KEGG富集分析 結(jié)果顯示黃芪-丹參藥對(duì)主要通過(guò)作用于癌癥相關(guān)通路(Pathways in Cancer)、乙型肝炎相關(guān)通路(Hepatitis B)、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K-AKT通路、HIF-1信號(hào)通路等治療肝癌。見(jiàn)圖5。

圖5 KEGG分析富集氣泡圖

2.6 黃芪-丹參藥對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞活力影響 48 h后的細(xì)胞活力除25 mg/L、50 mg/L組對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響外，其余組均有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖6。其中150 mg/L組以后細(xì)胞活力均小于50%，故選用150 mg/L、300 mg/L作為黃芪-丹參藥對(duì)低和高劑量。

圖6 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)HepG2細(xì)胞活力48 h的影響(n=6)

2.7 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡影響 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)HepG2細(xì)胞的48 h凋亡率的影響通過(guò)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)，與空白組發(fā)現(xiàn)黃芪-丹參藥對(duì)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡率具有藥量依賴性.見(jiàn)表3、圖7。

表3 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率(%,n=3)

圖7 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡48 h的影響

2.8 黃芪-丹參藥對(duì)PI3K、AKT基因的影響 通過(guò)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)分析黃芪-丹參藥對(duì)干預(yù)48 h后對(duì)HepG2細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因PI3K及AKT的mRNA表達(dá)的影響。與空白組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，黃芪-丹參藥對(duì)低劑量和高劑量預(yù)均可下調(diào)PI3K及AKT的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)

3 討論

隨著肝癌的患病率、病死率逐年增高[1]，針對(duì)“肝癌”的相關(guān)研究越來(lái)越多，中醫(yī)學(xué)具有悠久的歷史，且在實(shí)踐治療中起到了非常重要的作用，備受研究者重視。中藥成分具有抗癌的作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-丹參藥對(duì)在治療肝癌中發(fā)揮作用的主要成分是槲皮素、毛蕊異黃酮、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、丹參新醌。周孟等[15]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，槲皮素可抑制體內(nèi)外HepG2肝癌細(xì)胞的增殖并會(huì)促進(jìn)其發(fā)生凋亡，除此之外還發(fā)現(xiàn)槲皮素的不良反應(yīng)幾乎為零。陳麗等[16]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯通過(guò)下調(diào)肝癌細(xì)胞的自噬從而有效抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。毛蕊異黃酮、丹參新醌同樣也被證實(shí)有抗癌的作用[12]。除此之外，本研究篩選后得到黃芪丹參藥對(duì)治療肝癌的靶點(diǎn)共118個(gè)，體現(xiàn)了黃芪丹參藥對(duì)治療肝癌具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

通過(guò)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)對(duì)118個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)黃芪丹參藥對(duì)治療肝癌的基因靶點(diǎn)相互作用密切，主要參與的基因靶點(diǎn)包括：AKT1、JUN、MAPK1、MAPK8、IL-6、MAPK14、FOS、ESR1、EGFR、CCND1。AKT1是一類(lèi)蛋白激酶，主要影響細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，研究表明其具有調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的功效[17]。白細(xì)胞介素-6作為炎癥介質(zhì)，除參與炎癥反應(yīng)外，近幾年研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6通過(guò)參與肝癌微環(huán)境構(gòu)成、調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子、激活相關(guān)通路等影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，據(jù)此也成為肝癌靶向治療的一個(gè)熱點(diǎn)[18]。MAPK1、MAPK8、MAPK14均為MAPK家族的一員，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)通路，不僅參與正常組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過(guò)程，而且也參與各種腫瘤的病理過(guò)程[19]。JUN、ESR1皆為染色體上的基因，JUN編碼一種與病毒蛋白高度相似的蛋白，在我國(guó)慢性乙型肝炎病毒感染是肝癌的主要病因，研究發(fā)現(xiàn)，85%肝癌患者乙型肝炎病毒感染陽(yáng)性[20]。ESR1編碼雌激素受體，研究表明肝臟中雌激素在與雌激素受體結(jié)合后才具有抗氧化、抗肝纖維化、抗癌等功效[21]。表皮生長(zhǎng)因子受體是人表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體過(guò)表達(dá)可引起肝癌，西妥昔單抗通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體及其受體結(jié)合發(fā)揮抗腫瘤作用。此外體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明黃芪丹參藥對(duì)可以抑制HepG2細(xì)胞活力。因此，黃芪丹參藥對(duì)可能主要通過(guò)影響肝癌細(xì)胞增殖以及促進(jìn)相關(guān)受體結(jié)合發(fā)生抗肝癌的作用。

GO富集分析后發(fā)現(xiàn)：黃芪丹參藥對(duì)主要細(xì)胞組成集中在膜筏和轉(zhuǎn)錄因子上，而分子功能也集中在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合方面，主要參與了細(xì)胞凋亡信號(hào)的應(yīng)答過(guò)程。KEGG通路富集分析結(jié)果提示黃芪丹參藥對(duì)主要通過(guò)癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎相關(guān)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等發(fā)揮抗癌作用。研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪丹參藥對(duì)治療肝癌的核心靶點(diǎn)包括促分裂原活化的蛋白激酶1、促分裂原活化的蛋白激酶8、促分裂原活化的蛋白激酶14，皆參與細(xì)胞的增殖、凋亡，同時(shí)還參與了腫瘤的病理過(guò)程，這恰恰與KEGG富集結(jié)果中黃芪丹參藥對(duì)通過(guò)癌癥相關(guān)通路起效相互印證。Jun激酶編碼病毒蛋白，或許黃芪丹參藥對(duì)正是通過(guò)乙型肝炎相關(guān)通路抑制Jun激酶的作用降低乙型肝炎病毒感染發(fā)揮作用，這樣在抗肝癌的治療過(guò)程中還可以起到抗病毒的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)二者可以抗乙型肝炎病毒[23]。PI3K/AKT信號(hào)通路近年來(lái)被視為調(diào)節(jié)腫瘤的主要通路[24]，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪丹參藥對(duì)可以減少PI3K和AKTmRNA的表達(dá)，由此可見(jiàn)黃芪丹參藥對(duì)發(fā)揮抗腫瘤作用與該通路密切相關(guān)。

總之，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析后，黃芪丹參藥對(duì)治療肝癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，可以確定中藥療效的客觀性。經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步明確黃芪丹參藥對(duì)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且與PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān)。但是仍需要進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)該藥對(duì)成分以及其他靶點(diǎn)、通路進(jìn)行驗(yàn)證，為中藥治療肝癌提供更加有力的證據(jù)，以便使中藥更好地運(yùn)用于腫瘤治療中。