馬曉春,李建設(shè),高艷明,柴阿麗,王曉敏,閆海靜,王嘉欣
(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)
【研究意義】隨著番茄(Solanumlycopersicum)種植面積的增加以及貿(mào)易往來日趨頻繁,番茄病毒病也隨之加重。番茄病毒病具有較強的爆發(fā)性和毀滅性,在我國的各個番茄主栽區(qū)頻繁發(fā)生,對我國的番茄產(chǎn)業(yè)造成較大沖擊。因此,明確侵染我國各個地區(qū)的番茄病毒病種類,篩選適宜各地抗病毒品種,對預(yù)防番茄病毒病的發(fā)生以及減輕病毒病對番茄產(chǎn)業(yè)帶來的危害意義重大?!厩叭搜芯窟M展】番茄病毒癥狀分為花葉型、蕨葉型、條斑型以及黃色花葉型[1]。目前,國內(nèi)外報道的可侵染番茄的病毒至少有136種[2],且35種番茄病毒在我國已報道,包括23種RNA病毒和11種DNA病毒[3-4]。其中番茄黃化曲葉病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),DNA病毒。TYLCV于20世紀30年代末在以色列首次發(fā)現(xiàn)[5],于2006年在我國首次檢出[6],隨著媒介煙粉虱在全國范圍內(nèi)暴發(fā),在我國番茄主產(chǎn)區(qū)以從南到北的趨勢擴展開來[7],造成番茄大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。此外,寧夏于2011年在賀蘭縣首次發(fā)現(xiàn)TYLCV,隨后該病毒向全寧夏區(qū)域蔓延[8]。番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)屬長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus),單鏈RNA病毒。1998年,ToCV在美國佛羅里達州被首次發(fā)現(xiàn)并報道,之后在全球30多個國家陸續(xù)報道[9]。ToCV于2004年在我國臺灣首次報道,現(xiàn)已擴散至河北、廣東、天津等多個省份[10-11]。被ToCV侵染后的植株表現(xiàn)出嚴重的褪綠和黃化,極似營養(yǎng)失調(diào)癥,曾被人們一度認為是植株營養(yǎng)生理失調(diào)或農(nóng)藥藥害所致,因此常因誤判而不能夠及時準確防治[12-15]。番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus,TSWV)屬番茄斑萎病毒科(Tospovirus),番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus),RNA病毒。TSWV于1915年在澳大利亞被首次報道[16],現(xiàn)已流行于世界各地。1989年,自我國首次在廣州報道TSWV以來[17],在我國南北方地區(qū)包括云南、寧夏等地亦大面積發(fā)生[18-19],成為制約番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的又一重要病害。TSWV的主要傳播媒介為西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)[20]。受不同環(huán)境、不同番茄品種以及栽培管理和農(nóng)事操作等因素的影響,不同地區(qū)的番茄病毒種類不同[21]?!颈狙芯壳腥朦c】番茄病毒病危害不斷加重,目前針對番茄病毒復(fù)合侵染的相關(guān)報道較少,缺少對寧夏地區(qū)番茄主要病毒種類的系統(tǒng)研究?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在寧夏銀川周邊進行田間調(diào)查,利用分子檢測鑒定手段,從田間采集不同品種疑似番茄病毒樣本,進一步確定寧夏地區(qū)侵染番茄的主要病毒種類以及復(fù)合侵染的類型,旨在為寧夏設(shè)施栽培番茄篩選出較好的抗性品種,以及為田間生產(chǎn)指導(dǎo)提供理論依據(jù)。
供試番茄品種于2021年6月29日和7月15日采用穴盤育苗方式在寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園植物工廠播種,待幼苗生長至3葉1心時定植,‘盛世1號’‘澳粉1號’‘施華洛’‘美粉969’‘豐收’‘豐冠’‘京采6號’‘伊亞’共8個大果番茄品種于2021年7月21日在產(chǎn)業(yè)園2號、13號日光溫室內(nèi)定植,‘TY1602’‘普羅旺斯’‘京番308’‘甜脆脆’‘1號’‘味多美2號’‘原味1號’‘亞蔬12號’‘櫻桃番茄香妃9號’‘阿魯’于2021年8月7日在玻璃溫室定植。
日光溫室每個品種定植38~39株,株行距42.0 cm×75.0 cm;玻璃溫室每個品種定植50株,株行距20.0 cm×80.0 cm。定植前安裝滴灌系統(tǒng),并用利爾康(泡騰消毒片Ⅱ型)對基質(zhì)土壤進行消毒,定植時每棵番茄苗穴施1 g 5%的噻蟲嗪顆粒劑,定植后按常規(guī)方法施肥和管理,番茄均采用單桿整枝。
2021年9月8日在寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園2號、13號日光溫室(2號溫室為基質(zhì)培,13號溫室為土培)和A3玻璃溫室對大紅番茄、粉果番茄和櫻桃番茄植株進行田間調(diào)查,并分別采集18個番茄品種共366份疑似發(fā)病植株葉片,拍照后分別裝在采集袋中,標明采集時間、地點、品種、癥狀,帶回實驗室,次日進行病毒病鑒定,剩余樣品標記后存入-80 ℃保存?zhèn)溆谩悠凡杉瘯r溫室內(nèi)番茄病毒病均自然發(fā)病,取樣期間不使用任何化學(xué)農(nóng)藥。
表1 引物序列信息
1.4.1 番茄葉片總DNA提取 稱取0.1 g番茄葉片樣品,加入液氮充分研磨成粉末,采用Tiangen DNA提取試劑盒,按照操作說明提取DNA,用于后續(xù)試驗。
1.4.2 番茄總RNA的提取及cDNA的合成 稱取0.1 g番茄葉片樣品,加入液氮充分研磨成粉末,采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒,按照操作說明進行提取RNA,反轉(zhuǎn)錄采用Vazyme生物公司的 Hiscript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper),以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系和步驟參照Vazyme生物公司產(chǎn)品說明書進行。cDNA合成:加入2 μL RNA,用RNase Free ddH2O補足到8 μL,65 ℃加熱5 min,迅速置于冰上驟冷,靜置2 min;然后加入5×gDNA wiper Mix 2 μL,用移液器輕輕吹打混勻,42 ℃ 2 min;第一鏈cDNA合成反應(yīng):10 μL 2×RT Mix,2 μL Hiscript Ⅲ Enzyme Mix,1 μL Radom hexamers,RNase Free ddH2O 25 ℃ 5 min,37 ℃ 45 min,85 ℃ 5 s,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5.1 常規(guī)PCR檢測 利用TYLCV特異性引物(表1)按照說明書進行常規(guī)PCR擴增,擴增體系(20 μL):2×TaqMaster Mix (Dye Plus)10 μL,TYLCV-F/TYLCV-R引物各0.5 μL,模板2 μL,ddH2O 7 μL 。擴增條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,34個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,-20 ℃保存。
1.5.2 RT-PCR檢測 分別利用特異性引物(表1)按照說明書步驟進行RT-PCR擴增,擴增體系(20 μL):2×TaqMaster Mix(Dye Plus) 10 μL,ToCV-F/ToCV-R、TSWV-F/TSWV-R、STV-F/STV-R引物各0.5 μL,模板2 μL,ddH2O 7 μL 。擴增條件同PCR擴增。擴增結(jié)束后,分別取5 μL PCR/RT-PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測,并用全自動凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。
參照許向陽等[22]的方法,調(diào)查每株番茄的發(fā)病情況,計算病株率并根據(jù)分級方法評估抗性等級,分別予以記錄。
病株率(%)=病株數(shù)/調(diào)查總株×100
病情指數(shù)=Σ(各級病株數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高嚴重度代表值)×100
分級標準。免疫:病情指數(shù)為0,植株不帶毒;高抗:0<病情指數(shù)≤ 2;抗?。?<病情指數(shù)< 15;耐?。?5<病情指數(shù)< 30;感?。翰∏橹笖?shù)>30。
寧夏保護地栽培番茄在夏季和秋季病毒病發(fā)生十分嚴重,主要發(fā)病癥狀表現(xiàn)為開花期植株頂端葉片黃化,葉脈明顯但葉肉發(fā)黃,心葉畸形、褶皺,葉邊緣卷曲變形,葉背面葉脈變粗,植株矮化(圖1-A);部分植株表現(xiàn)為上部葉片縮小微卷,生長點壞死,部分葉片黃化,有些葉片除了主葉脈其余部分均出現(xiàn)黑色斑塊,有的葉柄也可見較淺黑色條斑(圖1-B);另外,植株表現(xiàn)為頂端葉片黃化、白化、褪綠,植株長勢衰弱(圖1-C);有些植株同時表現(xiàn)為頂部葉片黃化、卷曲、皺縮,葉面凹凸不平,葉邊緣輻射至葉脈處出現(xiàn)古銅色斑點或斑塊(圖1-D);除此之外,有些番茄植株呈叢生狀,植株近一半表現(xiàn)出心葉葉片嚴重黃化卷曲,葉片變硬變脆,節(jié)間縮短,葉片甚至干枯脫落,莖稈的支撐力減弱,植株生長停滯(圖1-E);植株生長至結(jié)果期,前期發(fā)病的植株仍表現(xiàn)出上部葉片黃化卷曲,底部葉片葉肉褪綠變紫,此癥狀逐漸向上部發(fā)展,且果實較健康植株小(圖1-F)。說明,寧夏番茄無土栽培田間病毒病整體發(fā)生嚴重且呈暴發(fā)趨勢,且在番茄不同品種間、不同生育期發(fā)病程度均表現(xiàn)不一,因此,番茄病毒病不僅僅有單一侵染,同時,復(fù)合侵染的情況也較多。
圖1 番茄病樣田間癥狀Fig.1 Field symptoms of tomato disease
利用TYLCV、ToCV、TSWV、STV、ToMV、CMV和TMV特異性引物對采自田間的366份番茄疑似病樣進行PCR/RT-PCR檢測,結(jié)果表明,所檢測樣本的特異性引物TYLCV-F/TYLCV-R、ToCV-F/ToCV-R、TSWV-F/TSWV-R和STV-F/STV-R在相應(yīng)處均擴增出648、450、425、681 bp的單一條帶。而ToMV、CMV、TMV和陰性對照未能擴增出目的條帶。4個目的條帶亮度有所差異,尤其與ToCV病毒所對應(yīng)的條帶較其他微弱,考慮到4種病毒存在營養(yǎng)和空間的競爭。另外,通過田間調(diào)查不同品種番茄感病癥狀,選取寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園主栽品種‘TY1602’的病葉再次提取總RNA/DNA,并利用已經(jīng)檢測出的病毒種類的特異性引物進行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示所對應(yīng)特異性引物均擴增出450、425、681和648 bp大小的特異性條帶(圖2),與預(yù)期目的條帶大小相符。說明,番茄品種‘TY1602’同時被TYLCV、ToCV、TSWV和STV侵染。
從表2可看出,病毒病復(fù)合侵染情況在產(chǎn)業(yè)園普遍發(fā)生,且在不同品種間和不同栽培基質(zhì)間均表現(xiàn)出差異。檢測結(jié)果顯示,有單一病毒侵染的品種,也有2種病毒復(fù)合侵染的樣品,部分品種同時被3種病毒所侵染。此外,檢測發(fā)現(xiàn),有的品種植株樣本檢測出4種病毒的存在。
產(chǎn)業(yè)園2號溫室和13號溫室主要品種為大果硬果番茄,主要表現(xiàn)出2種病毒復(fù)合侵染的癥狀,而A3玻璃溫室主栽品種為水果番茄和櫻桃番茄,病毒病發(fā)生較2號和13號溫室嚴重且侵染的病毒種類為2種或2種以上,其中以3種復(fù)合侵染為主。另外,3個溫室中的番茄品種無論抗TYLCV與否,都檢出TYLCV病毒,檢出率為100%;4種病毒在不同結(jié)構(gòu)溫室均有發(fā)生,除感染TYLCV病毒外,ToCV和STV在不同溫室也普遍分布;此外,玻璃溫室的番茄樣本大多可檢測到TSWV病毒。在18種番茄品種中,單一病毒侵染的品種有硬果番茄‘盛世1號’和櫻桃番茄‘香妃9號’,這2個品種在田間相較于其他品種長勢較好;其他品種均存在復(fù)合侵染。從檢測結(jié)果中同樣可得出,TYLCV病毒單一侵染占采集總樣本的10.38%;復(fù)合侵染樣本數(shù)為328份,占比為81.69%,2種病毒復(fù)合侵染占總復(fù)合侵染的72.95%,其中占比較多的是TYLCV+ToCV病毒,復(fù)合侵染率占40.44%,TYLCV+STV病毒復(fù)合侵染以及TYLCV+TSWV病毒復(fù)合侵染分別占22.68%和6.01%;3種病毒復(fù)合侵染占總復(fù)合侵染的8.47%,侵染類型有TYLCV+ToCV+STV、TYLCV+ToCV+TSWV、TYLCV+STV+TSWV,其中TYLCV+ToCV+STV、TYLCV+ToCV+TSWV復(fù)合侵染情況相當,分別占總侵染率的3.83%和3.28%,另外,占比較少的侵染類型為TYLCV+STV+TSWV;4種病毒復(fù)合侵染占總復(fù)合侵染樣本的0.27%,為TYLCV+ToCV+STV+TSWV。可見,番茄病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象已在該園區(qū)大面積發(fā)生。
M.分子質(zhì)量標準 DL5000 DNA Marker;1. 番茄褪綠病毒;2. 番茄斑萎病毒;3. 南方番茄病毒;4. 番茄黃化曲葉病毒;5. 番茄花葉病毒;6. 黃瓜花葉病毒;7. 煙草花葉病毒;8~10.陰性對照M. Molecular mass standard DL5000 DNA Marker; 1. TSWV; 2. ToCV; 3. STV; 4. TYLCV; 5. ToMV; 6. CMV; 7. TMV; 8-10. Negative control圖2 部分番茄樣品的PCR檢測凝膠電泳結(jié)果Fig.2 PCR detection GEL electrophoresis results of some tomato samples
表2 不同品種番茄病毒病檢測鑒定
不同番茄品種對病毒病的抗性表現(xiàn)不同(表3),在所有品系番茄中,除‘豐冠’為感病品種外,其他品系番茄都表現(xiàn)出不同程度的抗性。其中,硬果番茄‘豐收’,口感番茄‘京采6號’‘1號’以及櫻桃番茄‘阿魯’和‘香妃9號’表現(xiàn)為高抗水平;抗性等級為抗病的品種有‘盛世1號’‘澳粉1號’‘施華洛’‘伊亞’‘美粉969’‘TY1602’‘普羅旺斯’‘亞蔬12號’‘甜脆脆’‘原味1號’‘京番308’‘味多美2號’,這幾個品種的病情指數(shù)最高,達到14.0,其中‘澳粉1號’的病指最低,為2.3。高抗品種占參試總品種的27.78%,而大多數(shù)為抗性品系,占總品系的66.67%。
本研究利用分子技術(shù)手段,對采自寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園疑似感染病毒的番茄植株樣品進行RT-PCR檢測,鑒定出4種病毒,分別為TYLCV、ToCV、STV和TSWV。檢測分析顯示,采集的366份樣本中,TYLCV檢出率為100%,而且TY抗性品種部分感染了TYLCV病毒,這可能是棚室溫度高于35 ℃,抗TY品種抗性減弱所致,也有可能是由于TYLCV擁有單鏈DNA病毒容易變異的屬性,導(dǎo)致抗性不穩(wěn)定[23]。另外,被ToCV和STV侵染的樣本,分別占總采集樣本的40.44%和22.68%。其中,以煙粉虱為主要傳播媒介的病毒TYLCV和ToCV,自被寧夏報道[8,24]以來,已發(fā)展為該地區(qū)的優(yōu)勢病毒種類。凡是我國番茄主栽區(qū),TYLCV和ToCV同樣為侵染番茄的主要病原[21]。高溫和干旱是病毒病發(fā)病的有利條件,粉虱的發(fā)生情況與病毒的發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系[25]。因為采樣時期(8、9月)正值煙粉虱高發(fā)季,加之今年夏季整體溫度較高,降雨少,棚室內(nèi)粉虱大量聚集,為粉虱的發(fā)生和繁殖創(chuàng)造了有利條件。除此之外,番茄發(fā)病程度與其發(fā)育階段也有密切聯(lián)系[26],采樣地區(qū)番茄定植時期為7、8月,沒有避開番茄易感病期,且遇粉虱高發(fā)期,因此出現(xiàn)大面積侵染TYLCV和ToCV。
表3 不同品系番茄病毒病抗性評價
自然條件下,出現(xiàn)2種或2種以上病毒復(fù)合侵染植物的情況已司空見慣,當不同病毒復(fù)合侵染時,作物更多表現(xiàn)出協(xié)生作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn),寧夏地區(qū)番茄復(fù)合侵染現(xiàn)象已不足為奇,復(fù)合侵染的樣本占總樣本數(shù)量的81.69%,復(fù)合侵染形式以TYLCV與ToCV、STV以及TSWV復(fù)合侵染為主,其中2種病毒復(fù)合侵染占多數(shù),且TYLCV和ToCV病毒復(fù)合侵染為樣本采集地區(qū)的侵染優(yōu)勢種,占總復(fù)合侵染率的40.44%。我國山東[28]、云南[29]、江蘇[30]、河南[31]、河北[32]等多個地區(qū)也有TYLCV和ToCV復(fù)合侵染的相關(guān)報道[33],這可能是由于昆蟲獲毒、傳毒效率與病毒互作所致[34],也有可能是感染其中一種病毒的植株失去抵御另外一種病毒的能力。另外,本研究檢測到ToCV與TSWV病毒復(fù)合侵染,這是因為2種病毒之間存在協(xié)生作用[35]。除此以外,也檢測到STV與TYLCV、ToCV、TSWV其中的1種甚至2種或3種復(fù)合侵染。研究指出,STV通常與其他病毒復(fù)合感染,在山東,有STV與TYLCV、CMV、TOCV復(fù)合侵染的報道[36];新疆出現(xiàn)STV、CMV、PVY、ToMV復(fù)合侵染的現(xiàn)象[37];北京也檢測到STV與TYLCV、ToCV復(fù)合侵染[38]??梢?,種傳病毒STV不容小覷,應(yīng)引起重視。
通過田間病毒病發(fā)生情況調(diào)查以及分子檢測發(fā)現(xiàn),本研究所有參試品種中,大果紅果早熟番茄‘豐收’和櫻桃番茄‘阿魯’表現(xiàn)出高抗番茄病毒病,且在田間長勢良好,植株總體健康,其次為粉果番茄‘澳粉1號’‘京采6號’和鮮食番茄‘1號’‘亞蔬12號’‘原味1號’,這幾個品種在田間總體表現(xiàn)良好,并且病毒侵染率也較其他品種低?!S冠’‘味多美2號’‘京番308’植株病毒侵染率高達74%~78%。就目前的抗病毒品種而言,學(xué)者們通過不同方法選育了一些抗性較高的品種。邵秀麗等[39]將‘牟番38’進行了不同區(qū)域和不同茬次種植,進行植物學(xué)性狀評價和田間抗病性評估,得出此品種田間抗番茄TY病毒?。慌撂峁披悺ぐ鼓就欣萚40]通過抗病性、植株生物學(xué)、果實品質(zhì)和產(chǎn)量綜合分析,篩選出‘歐瑞斯’‘奧力奧’‘新達利’優(yōu)質(zhì)品種。另外,李亞茹等[41]提出對抗性表現(xiàn)較好的基因采用聚合育種,從而提高品種抗性能力。
初步判定‘豐收’‘阿魯’‘澳粉1號’‘京采6號’‘1號’‘亞蔬12號’‘原味1號’這幾個品種為抗病毒品種,但缺少品種與多種病毒靶標對峙抗性,后期可進一步驗證抗病毒品種。此次在寧夏采樣范圍和采樣時間均有局限,檢測到的病毒種類并不完全,下一步可在不同時間段對寧夏地區(qū)各市縣進行番茄病毒病調(diào)查以及采樣鑒定,為寧夏番茄產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。
番茄病毒病復(fù)合侵染在寧夏地區(qū)已大面積發(fā)生,且呈暴發(fā)趨勢,應(yīng)當引起高度重視和警惕,為寧夏地區(qū)番茄病毒病預(yù)警、檢測及防治奠定理論依據(jù)。