馬曉春，李建設(shè)，高艷明，柴阿麗，王曉敏，閆海靜，王嘉欣

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

【研究意義】隨著番茄(Solanumlycopersicum)種植面積的增加以及貿(mào)易往來日趨頻繁，番茄病毒病也隨之加重。番茄病毒病具有較強的爆發(fā)性和毀滅性，在我國的各個番茄主栽區(qū)頻繁發(fā)生，對我國的番茄產(chǎn)業(yè)造成較大沖擊。因此，明確侵染我國各個地區(qū)的番茄病毒病種類，篩選適宜各地抗病毒品種，對預(yù)防番茄病毒病的發(fā)生以及減輕病毒病對番茄產(chǎn)業(yè)帶來的危害意義重大?！厩叭搜芯窟M展】番茄病毒癥狀分為花葉型、蕨葉型、條斑型以及黃色花葉型[1]。目前，國內(nèi)外報道的可侵染番茄的病毒至少有136種[2]，且35種番茄病毒在我國已報道，包括23種RNA病毒和11種DNA病毒[3-4]。其中番茄黃化曲葉病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，DNA病毒。TYLCV于20世紀30年代末在以色列首次發(fā)現(xiàn)[5]，于2006年在我國首次檢出[6]，隨著媒介煙粉虱在全國范圍內(nèi)暴發(fā)，在我國番茄主產(chǎn)區(qū)以從南到北的趨勢擴展開來[7]，造成番茄大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。此外，寧夏于2011年在賀蘭縣首次發(fā)現(xiàn)TYLCV，隨后該病毒向全寧夏區(qū)域蔓延[8]。番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)屬長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)，單鏈RNA病毒。1998年，ToCV在美國佛羅里達州被首次發(fā)現(xiàn)并報道，之后在全球30多個國家陸續(xù)報道[9]。ToCV于2004年在我國臺灣首次報道，現(xiàn)已擴散至河北、廣東、天津等多個省份[10-11]。被ToCV侵染后的植株表現(xiàn)出嚴重的褪綠和黃化，極似營養(yǎng)失調(diào)癥，曾被人們一度認為是植株營養(yǎng)生理失調(diào)或農(nóng)藥藥害所致，因此常因誤判而不能夠及時準確防治[12-15]。番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)屬番茄斑萎病毒科(Tospovirus)，番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)，RNA病毒。TSWV于1915年在澳大利亞被首次報道[16]，現(xiàn)已流行于世界各地。1989年，自我國首次在廣州報道TSWV以來[17]，在我國南北方地區(qū)包括云南、寧夏等地亦大面積發(fā)生[18-19]，成為制約番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的又一重要病害。TSWV的主要傳播媒介為西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)[20]。受不同環(huán)境、不同番茄品種以及栽培管理和農(nóng)事操作等因素的影響，不同地區(qū)的番茄病毒種類不同[21]?！颈狙芯壳腥朦c】番茄病毒病危害不斷加重，目前針對番茄病毒復(fù)合侵染的相關(guān)報道較少，缺少對寧夏地區(qū)番茄主要病毒種類的系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在寧夏銀川周邊進行田間調(diào)查，利用分子檢測鑒定手段，從田間采集不同品種疑似番茄病毒樣本，進一步確定寧夏地區(qū)侵染番茄的主要病毒種類以及復(fù)合侵染的類型，旨在為寧夏設(shè)施栽培番茄篩選出較好的抗性品種，以及為田間生產(chǎn)指導(dǎo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試番茄品種

供試番茄品種于2021年6月29日和7月15日采用穴盤育苗方式在寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園植物工廠播種，待幼苗生長至3葉1心時定植，‘盛世1號’‘澳粉1號’‘施華洛’‘美粉969’‘豐收’‘豐冠’‘京采6號’‘伊亞’共8個大果番茄品種于2021年7月21日在產(chǎn)業(yè)園2號、13號日光溫室內(nèi)定植，‘TY1602’‘普羅旺斯’‘京番308’‘甜脆脆’‘1號’‘味多美2號’‘原味1號’‘亞蔬12號’‘櫻桃番茄香妃9號’‘阿魯’于2021年8月7日在玻璃溫室定植。

1.2 試驗場地描述

日光溫室每個品種定植38～39株，株行距42.0 cm×75.0 cm；玻璃溫室每個品種定植50株，株行距20.0 cm×80.0 cm。定植前安裝滴灌系統(tǒng)，并用利爾康(泡騰消毒片Ⅱ型)對基質(zhì)土壤進行消毒，定植時每棵番茄苗穴施1 g 5%的噻蟲嗪顆粒劑，定植后按常規(guī)方法施肥和管理，番茄均采用單桿整枝。

1.3 待測番茄樣品采集

2021年9月8日在寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園2號、13號日光溫室(2號溫室為基質(zhì)培，13號溫室為土培)和A3玻璃溫室對大紅番茄、粉果番茄和櫻桃番茄植株進行田間調(diào)查，并分別采集18個番茄品種共366份疑似發(fā)病植株葉片，拍照后分別裝在采集袋中，標明采集時間、地點、品種、癥狀，帶回實驗室，次日進行病毒病鑒定，剩余樣品標記后存入-80 ℃保存?zhèn)溆谩悠凡杉瘯r溫室內(nèi)番茄病毒病均自然發(fā)病，取樣期間不使用任何化學(xué)農(nóng)藥。

表1 引物序列信息

1.4 番茄病樣總DNA/RNA提取

1.4.1 番茄葉片總DNA提取 稱取0.1 g番茄葉片樣品，加入液氮充分研磨成粉末，采用Tiangen DNA提取試劑盒，按照操作說明提取DNA，用于后續(xù)試驗。

1.4.2 番茄總RNA的提取及cDNA的合成 稱取0.1 g番茄葉片樣品，加入液氮充分研磨成粉末，采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，按照操作說明進行提取RNA，反轉(zhuǎn)錄采用Vazyme生物公司的 Hiscript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)，以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和步驟參照Vazyme生物公司產(chǎn)品說明書進行。cDNA合成：加入2 μL RNA，用RNase Free ddH2O補足到8 μL，65 ℃加熱5 min，迅速置于冰上驟冷，靜置2 min；然后加入5×gDNA wiper Mix 2 μL，用移液器輕輕吹打混勻，42 ℃ 2 min；第一鏈cDNA合成反應(yīng)：10 μL 2×RT Mix，2 μL Hiscript Ⅲ Enzyme Mix，1 μL Radom hexamers，RNase Free ddH2O 25 ℃ 5 min，37 ℃ 45 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 不同品種番茄病樣RT-PCR檢測

1.5.1 常規(guī)PCR檢測 利用TYLCV特異性引物(表1)按照說明書進行常規(guī)PCR擴增，擴增體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix (Dye Plus)10 μL，TYLCV-F/TYLCV-R引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL 。擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，34個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存。

1.5.2 RT-PCR檢測 分別利用特異性引物(表1)按照說明書步驟進行RT-PCR擴增，擴增體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix(Dye Plus) 10 μL，ToCV-F/ToCV-R、TSWV-F/TSWV-R、STV-F/STV-R引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL 。擴增條件同PCR擴增。擴增結(jié)束后，分別取5 μL PCR/RT-PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，并用全自動凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.6 不同品種番茄抗病性鑒定

參照許向陽等[22]的方法，調(diào)查每株番茄的發(fā)病情況，計算病株率并根據(jù)分級方法評估抗性等級，分別予以記錄。

病株率(%)=病株數(shù)/調(diào)查總株×100

病情指數(shù)=Σ(各級病株數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高嚴重度代表值)×100

分級標準。免疫：病情指數(shù)為0，植株不帶毒；高抗：0<病情指數(shù)≤ 2；抗?。?<病情指數(shù)< 15；耐?。?5<病情指數(shù)< 30；感?。翰∏橹笖?shù)>30。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄的田間癥狀

寧夏保護地栽培番茄在夏季和秋季病毒病發(fā)生十分嚴重，主要發(fā)病癥狀表現(xiàn)為開花期植株頂端葉片黃化，葉脈明顯但葉肉發(fā)黃，心葉畸形、褶皺，葉邊緣卷曲變形，葉背面葉脈變粗，植株矮化(圖1-A)；部分植株表現(xiàn)為上部葉片縮小微卷，生長點壞死，部分葉片黃化，有些葉片除了主葉脈其余部分均出現(xiàn)黑色斑塊，有的葉柄也可見較淺黑色條斑(圖1-B)；另外，植株表現(xiàn)為頂端葉片黃化、白化、褪綠，植株長勢衰弱(圖1-C)；有些植株同時表現(xiàn)為頂部葉片黃化、卷曲、皺縮，葉面凹凸不平，葉邊緣輻射至葉脈處出現(xiàn)古銅色斑點或斑塊(圖1-D)；除此之外，有些番茄植株呈叢生狀，植株近一半表現(xiàn)出心葉葉片嚴重黃化卷曲，葉片變硬變脆，節(jié)間縮短，葉片甚至干枯脫落，莖稈的支撐力減弱，植株生長停滯(圖1-E)；植株生長至結(jié)果期，前期發(fā)病的植株仍表現(xiàn)出上部葉片黃化卷曲，底部葉片葉肉褪綠變紫，此癥狀逐漸向上部發(fā)展，且果實較健康植株小(圖1-F)。說明，寧夏番茄無土栽培田間病毒病整體發(fā)生嚴重且呈暴發(fā)趨勢，且在番茄不同品種間、不同生育期發(fā)病程度均表現(xiàn)不一，因此，番茄病毒病不僅僅有單一侵染，同時，復(fù)合侵染的情況也較多。

圖1 番茄病樣田間癥狀Fig.1 Field symptoms of tomato disease

2.2 番茄病樣RT-PCR鑒定分析

利用TYLCV、ToCV、TSWV、STV、ToMV、CMV和TMV特異性引物對采自田間的366份番茄疑似病樣進行PCR/RT-PCR檢測，結(jié)果表明，所檢測樣本的特異性引物TYLCV-F/TYLCV-R、ToCV-F/ToCV-R、TSWV-F/TSWV-R和STV-F/STV-R在相應(yīng)處均擴增出648、450、425、681 bp的單一條帶。而ToMV、CMV、TMV和陰性對照未能擴增出目的條帶。4個目的條帶亮度有所差異，尤其與ToCV病毒所對應(yīng)的條帶較其他微弱，考慮到4種病毒存在營養(yǎng)和空間的競爭。另外，通過田間調(diào)查不同品種番茄感病癥狀，選取寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園主栽品種‘TY1602’的病葉再次提取總RNA/DNA，并利用已經(jīng)檢測出的病毒種類的特異性引物進行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示所對應(yīng)特異性引物均擴增出450、425、681和648 bp大小的特異性條帶(圖2)，與預(yù)期目的條帶大小相符。說明，番茄品種‘TY1602’同時被TYLCV、ToCV、TSWV和STV侵染。

2.3 不同品種番茄病毒病復(fù)合侵染分析

從表2可看出，病毒病復(fù)合侵染情況在產(chǎn)業(yè)園普遍發(fā)生，且在不同品種間和不同栽培基質(zhì)間均表現(xiàn)出差異。檢測結(jié)果顯示，有單一病毒侵染的品種，也有2種病毒復(fù)合侵染的樣品，部分品種同時被3種病毒所侵染。此外，檢測發(fā)現(xiàn)，有的品種植株樣本檢測出4種病毒的存在。

產(chǎn)業(yè)園2號溫室和13號溫室主要品種為大果硬果番茄，主要表現(xiàn)出2種病毒復(fù)合侵染的癥狀，而A3玻璃溫室主栽品種為水果番茄和櫻桃番茄，病毒病發(fā)生較2號和13號溫室嚴重且侵染的病毒種類為2種或2種以上，其中以3種復(fù)合侵染為主。另外，3個溫室中的番茄品種無論抗TYLCV與否，都檢出TYLCV病毒，檢出率為100%；4種病毒在不同結(jié)構(gòu)溫室均有發(fā)生，除感染TYLCV病毒外，ToCV和STV在不同溫室也普遍分布；此外，玻璃溫室的番茄樣本大多可檢測到TSWV病毒。在18種番茄品種中，單一病毒侵染的品種有硬果番茄‘盛世1號’和櫻桃番茄‘香妃9號’，這2個品種在田間相較于其他品種長勢較好；其他品種均存在復(fù)合侵染。從檢測結(jié)果中同樣可得出，TYLCV病毒單一侵染占采集總樣本的10.38%；復(fù)合侵染樣本數(shù)為328份，占比為81.69%，2種病毒復(fù)合侵染占總復(fù)合侵染的72.95%，其中占比較多的是TYLCV+ToCV病毒，復(fù)合侵染率占40.44%，TYLCV+STV病毒復(fù)合侵染以及TYLCV+TSWV病毒復(fù)合侵染分別占22.68%和6.01%；3種病毒復(fù)合侵染占總復(fù)合侵染的8.47%，侵染類型有TYLCV+ToCV+STV、TYLCV+ToCV+TSWV、TYLCV+STV+TSWV，其中TYLCV+ToCV+STV、TYLCV+ToCV+TSWV復(fù)合侵染情況相當，分別占總侵染率的3.83%和3.28%，另外，占比較少的侵染類型為TYLCV+STV+TSWV；4種病毒復(fù)合侵染占總復(fù)合侵染樣本的0.27%，為TYLCV+ToCV+STV+TSWV。可見，番茄病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象已在該園區(qū)大面積發(fā)生。

M.分子質(zhì)量標準 DL5000 DNA Marker；1. 番茄褪綠病毒；2. 番茄斑萎病毒；3. 南方番茄病毒；4. 番茄黃化曲葉病毒；5. 番茄花葉病毒；6. 黃瓜花葉病毒；7. 煙草花葉病毒；8～10.陰性對照M. Molecular mass standard DL5000 DNA Marker; 1. TSWV; 2. ToCV; 3. STV; 4. TYLCV; 5. ToMV; 6. CMV; 7. TMV; 8-10. Negative control圖2 部分番茄樣品的PCR檢測凝膠電泳結(jié)果Fig.2 PCR detection GEL electrophoresis results of some tomato samples

表2 不同品種番茄病毒病檢測鑒定

2.4 不同品系番茄病毒病抗性分析

不同番茄品種對病毒病的抗性表現(xiàn)不同(表3)，在所有品系番茄中，除‘豐冠’為感病品種外，其他品系番茄都表現(xiàn)出不同程度的抗性。其中，硬果番茄‘豐收’，口感番茄‘京采6號’‘1號’以及櫻桃番茄‘阿魯’和‘香妃9號’表現(xiàn)為高抗水平；抗性等級為抗病的品種有‘盛世1號’‘澳粉1號’‘施華洛’‘伊亞’‘美粉969’‘TY1602’‘普羅旺斯’‘亞蔬12號’‘甜脆脆’‘原味1號’‘京番308’‘味多美2號’，這幾個品種的病情指數(shù)最高，達到14.0，其中‘澳粉1號’的病指最低，為2.3。高抗品種占參試總品種的27.78%，而大多數(shù)為抗性品系，占總品系的66.67%。

3 討 論

本研究利用分子技術(shù)手段，對采自寧夏賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園疑似感染病毒的番茄植株樣品進行RT-PCR檢測，鑒定出4種病毒，分別為TYLCV、ToCV、STV和TSWV。檢測分析顯示，采集的366份樣本中，TYLCV檢出率為100%，而且TY抗性品種部分感染了TYLCV病毒，這可能是棚室溫度高于35 ℃，抗TY品種抗性減弱所致，也有可能是由于TYLCV擁有單鏈DNA病毒容易變異的屬性，導(dǎo)致抗性不穩(wěn)定[23]。另外，被ToCV和STV侵染的樣本，分別占總采集樣本的40.44%和22.68%。其中，以煙粉虱為主要傳播媒介的病毒TYLCV和ToCV，自被寧夏報道[8,24]以來，已發(fā)展為該地區(qū)的優(yōu)勢病毒種類。凡是我國番茄主栽區(qū)，TYLCV和ToCV同樣為侵染番茄的主要病原[21]。高溫和干旱是病毒病發(fā)病的有利條件，粉虱的發(fā)生情況與病毒的發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系[25]。因為采樣時期(8、9月)正值煙粉虱高發(fā)季，加之今年夏季整體溫度較高，降雨少，棚室內(nèi)粉虱大量聚集，為粉虱的發(fā)生和繁殖創(chuàng)造了有利條件。除此之外，番茄發(fā)病程度與其發(fā)育階段也有密切聯(lián)系[26]，采樣地區(qū)番茄定植時期為7、8月，沒有避開番茄易感病期，且遇粉虱高發(fā)期，因此出現(xiàn)大面積侵染TYLCV和ToCV。

表3 不同品系番茄病毒病抗性評價

自然條件下，出現(xiàn)2種或2種以上病毒復(fù)合侵染植物的情況已司空見慣，當不同病毒復(fù)合侵染時，作物更多表現(xiàn)出協(xié)生作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)番茄復(fù)合侵染現(xiàn)象已不足為奇，復(fù)合侵染的樣本占總樣本數(shù)量的81.69%，復(fù)合侵染形式以TYLCV與ToCV、STV以及TSWV復(fù)合侵染為主，其中2種病毒復(fù)合侵染占多數(shù)，且TYLCV和ToCV病毒復(fù)合侵染為樣本采集地區(qū)的侵染優(yōu)勢種，占總復(fù)合侵染率的40.44%。我國山東[28]、云南[29]、江蘇[30]、河南[31]、河北[32]等多個地區(qū)也有TYLCV和ToCV復(fù)合侵染的相關(guān)報道[33]，這可能是由于昆蟲獲毒、傳毒效率與病毒互作所致[34]，也有可能是感染其中一種病毒的植株失去抵御另外一種病毒的能力。另外，本研究檢測到ToCV與TSWV病毒復(fù)合侵染，這是因為2種病毒之間存在協(xié)生作用[35]。除此以外，也檢測到STV與TYLCV、ToCV、TSWV其中的1種甚至2種或3種復(fù)合侵染。研究指出，STV通常與其他病毒復(fù)合感染，在山東，有STV與TYLCV、CMV、TOCV復(fù)合侵染的報道[36]；新疆出現(xiàn)STV、CMV、PVY、ToMV復(fù)合侵染的現(xiàn)象[37]；北京也檢測到STV與TYLCV、ToCV復(fù)合侵染[38]?？梢?，種傳病毒STV不容小覷，應(yīng)引起重視。

通過田間病毒病發(fā)生情況調(diào)查以及分子檢測發(fā)現(xiàn)，本研究所有參試品種中，大果紅果早熟番茄‘豐收’和櫻桃番茄‘阿魯’表現(xiàn)出高抗番茄病毒病，且在田間長勢良好，植株總體健康，其次為粉果番茄‘澳粉1號’‘京采6號’和鮮食番茄‘1號’‘亞蔬12號’‘原味1號’，這幾個品種在田間總體表現(xiàn)良好，并且病毒侵染率也較其他品種低?！S冠’‘味多美2號’‘京番308’植株病毒侵染率高達74%～78%。就目前的抗病毒品種而言，學(xué)者們通過不同方法選育了一些抗性較高的品種。邵秀麗等[39]將‘牟番38’進行了不同區(qū)域和不同茬次種植，進行植物學(xué)性狀評價和田間抗病性評估，得出此品種田間抗番茄TY病毒?。慌撂峁披悺ぐ鼓就欣萚40]通過抗病性、植株生物學(xué)、果實品質(zhì)和產(chǎn)量綜合分析，篩選出‘歐瑞斯’‘奧力奧’‘新達利’優(yōu)質(zhì)品種。另外，李亞茹等[41]提出對抗性表現(xiàn)較好的基因采用聚合育種，從而提高品種抗性能力。

初步判定‘豐收’‘阿魯’‘澳粉1號’‘京采6號’‘1號’‘亞蔬12號’‘原味1號’這幾個品種為抗病毒品種，但缺少品種與多種病毒靶標對峙抗性，后期可進一步驗證抗病毒品種。此次在寧夏采樣范圍和采樣時間均有局限，檢測到的病毒種類并不完全，下一步可在不同時間段對寧夏地區(qū)各市縣進行番茄病毒病調(diào)查以及采樣鑒定，為寧夏番茄產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

番茄病毒病復(fù)合侵染在寧夏地區(qū)已大面積發(fā)生，且呈暴發(fā)趨勢，應(yīng)當引起高度重視和警惕，為寧夏地區(qū)番茄病毒病預(yù)警、檢測及防治奠定理論依據(jù)。