王興國，劉 霞，張 哲，黃 勛，鄧琳梅，許改換，蔣 杰，楊艷麗*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

由致病疫霉［Phytophthora infestans(Mont.)de Bary］引起的馬鈴薯晚疫病［1］，曾在歐洲引發(fā)“愛爾蘭大饑荒”，造成重大經(jīng)濟(jì)損失［2］。迄今為止，馬鈴薯晚疫病仍是一種全球范圍內(nèi)的毀滅性病害，我國馬鈴薯種植區(qū)均不同程度地受到晚疫病的危害，一般嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)10%~20%，特別嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%~70%，甚至絕收［3］。目前，馬鈴薯晚疫病仍以化學(xué)防治為主，而化學(xué)防治不僅會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，同時(shí)還會出現(xiàn)病原菌抗藥性的問題［4］。因此探索晚疫病菌侵染和危害的綠色防控技術(shù)尤為重要。

植物激活蛋白是從真菌或細(xì)菌中提取獲得的一種植物刺激劑，具有促進(jìn)植株生長、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)以及激發(fā)植物對病蟲害的抗性等作用，是一種環(huán)境友好型生物農(nóng)藥［5］。植物激活蛋白對番茄灰霉?。?］、煙草花葉?。?］、白術(shù)根腐?。?］等植物病害均具有良好的防治效果。大麗輪枝孢激活蛋白(Verticillium dahliae Asp-f2 Like，VdAL)是源于棉花黃萎菌的一種新型植物激活蛋白，通過葉面噴施后可調(diào)節(jié)植物激素的信號傳導(dǎo)途徑，通過調(diào)節(jié)植物鈣調(diào)蛋白（CaM）、脂氧合酶2（LOX2）等［9］來激活植物的免疫機(jī)制從而提升植物的抗性。VdAL也具有促進(jìn)植株生長、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等作用，研究表明，VdAL在馬鈴薯［10］、花椰菜［11］、水稻［12］、小麥［13］、青梗菜［14］、花生［15］和葡萄［16］上均表現(xiàn)出良好的促生作用，可增強(qiáng)草莓對白粉?。?］、楊梅［17］對肉蔥病的抗性。但VdAL對晚疫病菌的生物學(xué)特性是否有影響以及能否提高馬鈴薯植株對晚疫病的抗性等尚不明確。

鑒于此，本研究通過試驗(yàn)探究了VdAL對晚疫病菌生物學(xué)特性的影響，分析了經(jīng)過處理后的馬鈴薯植株中的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）等的活性變化，以及丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、可溶性蛋白（Soluble protein，SP）等與抗性相關(guān)物質(zhì)的含量變化以及與馬鈴薯晚疫病發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試馬鈴薯品種及菌株 供試品種為青薯9號，供試菌株為ZT10，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯病害研究室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 黑麥番茄培養(yǎng)基：黑麥75 g，瓊脂15 g，番茄汁100 mL，碳酸鈣1.0 g，蒸餾水850 mL，pH值6.5~7.0。

1.1.3 供試藥劑及試劑 10%氟噻唑吡乙酮OD（增威贏綠），由科迪華農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；大麗輪枝孢激活蛋白（Verticillium dahliae Asp-f2 Like，VdAL），由北京中捷四方生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 待晚疫病菌在黑麥番茄培養(yǎng)基上生長至第10天時(shí)，用耙式牙簽［18］刮取菌絲的同時(shí)使用少量無菌水沖洗培養(yǎng)平板，再用400目無菌網(wǎng)篩過濾，然后定容至10 mL；使用血球計(jì)數(shù)板將濾液的孢子濃度調(diào)至1×104個(gè)/mL［19］，于4 ℃冰箱內(nèi)釋放游動孢子40 min后用于接種［20］。

1.2.2 孢子囊懸浮液的制備 待晚疫病菌長滿平板表面時(shí)，用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，分別反貼于含有濃度為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L激活蛋白的培養(yǎng)平板中央，以無菌水為陰性對照，0.5 mL/L濃度的10%氟噻唑吡乙酮OD為陽性對照，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次，于20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)10 d，采用十字交叉法［4］測量菌落直徑；測量菌落直徑后將培養(yǎng)平板上的菌絲全部刮取下，稱量菌絲重量；再按照1.2.1中的方法將菌絲制成孢子囊懸浮液，使用血球計(jì)數(shù)板檢測孢子囊濃度。

1.2.3 孢子萌發(fā)率的測定 按1.2.2中的方法制作孢子囊懸浮液，將孢子囊懸浮液與藥劑按體積比1∶1混勻，VdAL濃度分別設(shè)為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L，以無菌水為陰性對照，0.5 mL/L濃度的10%氟噻唑吡乙酮OD為陽性對照，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。每個(gè)處理吸取30 μL混合液于干凈的凹玻片中，于4 ℃冰箱中培養(yǎng)4 h后觀察孢子囊的間接萌發(fā)情況，19 ℃培養(yǎng)24 h后觀察孢子囊的直接萌發(fā)情況，每個(gè)處理重復(fù)觀察100個(gè)孢子囊的萌發(fā)情況［21］。

1.2.4 盆栽試驗(yàn)方法

1.2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行。選取健康發(fā)芽的種薯，種植在含有蛭石和珍珠巖（體積比為1∶1）的花盆中，每盆1株，定期進(jìn)行水肥管理，保證馬鈴薯正常出苗和生長，在馬鈴薯植株出苗后第45天，將VdAL濃度分別設(shè)為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L，10%氟噻唑吡乙酮OD濃度設(shè)為0.5 mL/L，以無菌水為空白對照，使用以上濃度對植株進(jìn)行整株噴施，每株用量150 mL，再在噴施24 h后，每盆植株接種15 mL的晚疫病菌孢子囊懸浮液［19］，每個(gè)處理3盆，重復(fù)3次。分別于接種晚疫病菌后第0、1、3、5、7、9天采取植株第3~5葉位上的葉片，液氮速凍后于-80 ℃中保存，用于測定防御酶活性和抗性物質(zhì)含量。通過試驗(yàn)可知，當(dāng)VdAL濃度為20.0 mg/L時(shí)，晚疫病發(fā)病最輕。為探究VdAL對馬鈴薯晚疫病發(fā)生的影響機(jī)制，設(shè)置以下3個(gè)處理：20.0 mg/L VdAL處理24 h后接種晚疫病菌（T1）；0.5 mL/L 10%氟噻唑吡乙酮OD處理24 h后接種晚疫病菌（T2）；無菌水處理24 h后接種晚疫病菌（Q）。

1.2.4.2 病情指數(shù)和防治效果的測定 接種晚疫病菌后第10天觀察植株的發(fā)病情況，病情指數(shù)參考馬春暉等［22］的方法測定，病情指數(shù)和防治效果的計(jì)算公式分別為：

1.2.5 馬鈴薯葉片防御酶活性和抗性物質(zhì)含量的測定 PAL、POD、PPO、CAT活性的測定分別采用苯丙氨酸法、愈創(chuàng)木酚法、兒茶酚法和鉬酸銨法［23-25］； MDA、SP含量的測定分別采用硫代巴比妥酸法和考馬斯亮藍(lán)顯色法［26-27］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2007軟件和DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對晚疫病菌的菌絲生長、孢子囊形成以及孢子囊萌發(fā)的影響

由表1~表2可知，2種藥劑中僅10%氟噻唑吡乙酮OD能對病原菌生長產(chǎn)生顯著抑制作用，含有0.5 mg/L 10%氟噻唑吡乙酮OD的培養(yǎng)基平板中的晚疫病菌無法生長，晚疫病菌生長至10 d時(shí)的菌落直徑、菌絲重量以及孢子囊濃度均為0，表明10%氟噻唑吡乙酮OD可以有效抑制晚疫病菌菌絲的生長和孢子囊的形成，并且該處理還可有效抑制晚疫病菌孢子囊的萌發(fā)，孢子囊直接萌發(fā)率和間接萌發(fā)率均為0，與Q和T1處理達(dá)到顯著差異。含有5.0~25.0 mg/L VdAL的培養(yǎng)平板中的晚疫病菌正常生長，與無菌水處理相比，晚疫病菌在生長至10 d時(shí)的菌落直徑、菌絲重量以及孢子囊濃度無顯著差異；此外，不同濃度VdAL對晚疫病菌孢子囊的直接萌發(fā)率和間接萌發(fā)率均無影響，表明VdAL對晚疫病菌無抑制作用。

表1 不同處理對晚疫病菌菌絲生長及孢子囊濃度的影響

表2 不同處理對晚疫病菌孢子囊萌發(fā)率的影響

2.2 不同處理對馬鈴薯晚疫病的防治效果

由表3、圖1可知，與Q相比，不同濃度的T1均可顯著減輕馬鈴薯晚疫病的發(fā)病程度，且發(fā)病程度隨著濃度的增加而逐漸減輕，但濃度高于20 mg/L后其防治效果有所降低。在經(jīng)5.0~25.0 mg/L VdAL處理的植株中，其病情指數(shù)分別為47.73、42.46、41.76、38.47和40.72，可以看出20.0 mg/L是T1處理中的最佳作用濃度，其防治效果達(dá)到峰值，為39.14%，顯著高于其他濃度處理。T2處理后的病情指數(shù)為18.01，較Q顯著降低，其防治效果高達(dá)71.71%。雖然VdAL處理的防治效果低于10%氟噻唑吡乙酮OD處理的防治效果，但VdAL作為一種友好型生物農(nóng)藥也可有效地防治馬鈴薯晚疫病。

表3 不同處理對馬鈴薯晚疫病病情指數(shù)和防治效果的影響

表4 不同處理對馬鈴薯葉片PAL活性的影響 U/(g·min)

圖1 不同處理的馬鈴薯植株晚疫病發(fā)生情況

2.3 不同處理對馬鈴薯抗病防御酶活性的影響

2.3.1 不同處理對馬鈴薯葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響 由表4可知：噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，馬鈴薯植株的PAL活性隨即升高，在第5天時(shí)達(dá)到峰值，分別為175.26、162.69和148.53 U/（g·min），其中T1的PAL活性最高，較T2和Q分別提高了7.73%和18.00%；5~9 d，3個(gè)處理的PAL活性均下降，第9天時(shí)3個(gè)處理的PAL活性非常接近?？梢钥闯?，相較于T2和Q，T1能更加有效地提升馬鈴薯植株的PAL活性。

2.3.2 不同處理對馬鈴薯葉片過氧化氫酶（CAT）活性的影響 由表5可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）處理后接種晚疫病菌，T1的CAT活性在1~5 d內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢，且在接種第5天時(shí)CAT活性達(dá)到峰值，為31.94 U/(g·min)，較T2和Q分別提高了14.64%和15.77%；第5~9天T1的CAT活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但仍高于同時(shí)間T2和Q的；T2和Q的CAT活性在接種后整體上也呈現(xiàn)出先升高后逐漸降低的變化趨勢，但變化幅度較小。上述結(jié)果說明T1提高馬鈴薯植株葉片CAT活性的效果最好。

2.3.3 不同處理對馬鈴薯葉片多酚氧化酶（PPO）活性的影響 由表6可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，馬鈴薯植株的PPO活性均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，PPO活性在0~3 d內(nèi)明顯升高；第1天時(shí)，T1的PPO活性為167.48 U/(g·min)，分別比T2和Q提高了7.41%和11.27%；第3天時(shí)，T1的PPO活性達(dá)到最大，為187.84 U/(g·min)，分別比T2和Q提高了11.96%和11.34%；隨后3個(gè)處理的PPO活性總體上逐漸降低，第5天時(shí)T1的PPO活性顯著低于T2的，但在其他時(shí)間點(diǎn)T1的PPO活性都顯著高于T2和Q的，說明T1最能有效提高馬鈴薯植株的PPO活性。

表5 不同處理對馬鈴薯葉片CAT活性的影響 U/(g·min)

表6 不同處理對馬鈴薯葉片PPO活性的影響 U/(g·min)

2.3.4 不同處理對馬鈴薯葉片過氧化物酶（POD）活性的影響 由表7可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，T1的POD活性在1~3 d內(nèi)逐漸升高，第1天時(shí)，T1的POD活性為91.42 U/(g·min)，分別比T2和Q提高了17.54%和13.58%；第3天時(shí)，T1的POD活性達(dá)到最大，為93.37 U/(g·min)，分別為T2和Q的1.10倍和1.24倍；隨后T1的POD活性逐漸降低。T2和Q的POD活性總體呈現(xiàn)緩慢上升后逐漸減低的變化趨勢，但是變化幅度均小于T1的，說明T1最能有效提高馬鈴薯植株的POD活性。

表7 不同處理對馬鈴薯葉片POD活性的影響 U/(g·min)

2.4 不同處理對馬鈴薯抗病防御物質(zhì)的影響

2.4.1 不同處理對馬鈴薯葉片丙二醛（MDA）含量的影響 由表8可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，T2的植株MDA含量在較低水平范圍內(nèi)上下波動，T1的MDA含量呈現(xiàn)緩慢增加的變化趨勢，而Q的MDA含量迅速增加，且Q的MDA含量在整個(gè)處理期間均顯著高于T1和T2的，接種后第1天時(shí)，Q的MDA含量迅速升高，為36.27 mmol/g，分別比T1和T2提高了25.72%、36.56%；接種后第9天，Q的MDA 含量達(dá)到最高，為58.45 mmol/g，分別比T1和T2提高了26.98%、73.08%，說明T1和T2能有效降低馬鈴薯葉片中MDA的含量。

表8 不同處理對馬鈴薯葉片MDA含量的影響 mmol/g

2.4.2 不同處理對馬鈴薯植株可溶性蛋白（SP）含量的影響 由表9可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，T1和Q的SP含量在處理期間均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，而T2的SP含量變化較小且持續(xù)維持在較低水平。接種后第0~3 天，T1的SP含量明顯升高，且第3天時(shí)SP含量達(dá)到最高，為12.97 μg/g，分別為T2和Q的1.21倍和1.12倍；第3~9天T1的SP含量逐漸降低，但降幅較小，其SP含量仍高于T2和Q的，說明T1最能有效提高馬鈴薯植株的SP含量。

表9 不同處理對馬鈴薯植株SP含量的影響 μg/g

綜上，大麗輪枝孢激活蛋白（VdAL）不直接作用于晚疫病菌，對晚疫病菌無抑制作用，但對馬鈴薯植株噴施VdAL后，第1~5天作用效果明顯，顯著提高了植株中的PAL、CAT、PPO、POD活性和可溶性蛋白（SP）含量，增強(qiáng)了植株的苯丙烷類途徑代謝，提高了植株及時(shí)清除因晚疫病菌侵染而產(chǎn)生活性氧的能力以及醌類物質(zhì)合成的能力等；同時(shí)，VdAL處理能有效抑制植株的膜脂過氧化反應(yīng)，顯著降低植株的MDA含量，進(jìn)而增強(qiáng)馬鈴薯植株的抗性，減輕馬鈴薯晚疫病發(fā)生的程度，因此，利用VdAL來激發(fā)植株的抗病性，不僅可以有效緩解晚疫病的發(fā)生程度，還可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，在實(shí)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病防控的同時(shí)達(dá)到保護(hù)環(huán)境的目的。

3 討論

植物激活蛋白能激活作物體內(nèi)的生長和防御系統(tǒng)，在促進(jìn)生長的同時(shí)增強(qiáng)作物的抗病性［28］。利用VdAL防治病害的研究已有報(bào)道，如VdAL誘導(dǎo)草莓對白粉病的抗性，防治效果達(dá)30.33%［5］；VdAL能顯著降低楊梅肉蔥病的發(fā)病率［17］。本研究發(fā)現(xiàn)VdAL對馬鈴薯晚疫病也具有良好的防治效果，其中噴施20.0 mg/L VdAL對馬鈴薯晚疫病的防效最好，達(dá)到39.14%，有一定的田間應(yīng)用價(jià)值。

植物防御酶在植物抗病的生理反應(yīng)過程中具有重要的作用，如PAL、POD、PPO、CAT等可參與木質(zhì)素、植保素和總酚的合成、活性氧的清除等生理過程，從而達(dá)到增強(qiáng)植株抗病性的目的［29］。本研究發(fā)現(xiàn)噴施 20.0 mg/L VdAL后，可顯著提升馬鈴薯植株的PAL、CAT、POD、PPO等活性，增強(qiáng)馬鈴薯植株對晚疫病的抗性，這與李麗等［6,30］使用植物激活蛋白誘導(dǎo)植物提升抗病性的研究結(jié)果相似。

植物體內(nèi)的SP和MDA含量均是與植株抗病密切相關(guān)的生理生化指標(biāo)。植物體內(nèi)的SP大多是參與各種代謝的酶類，與植物抗病性密切相關(guān)［19］。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是反映植物生物膜受損傷程度的重要指標(biāo)之一［29］。本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯植株經(jīng)20.0 mg/L VdAL處理后，植株的SP含量顯著高于10%氟噻唑吡乙酮OD處理和無菌水處理的，這可能是因?yàn)閂dAL處理能有效提高植株的SP含量，具有增強(qiáng)植株抗病性的作用；同時(shí)，VdAL處理還可不同程度地降低馬鈴薯葉片的MDA含量，這可能是因?yàn)閂dAL處理能提高馬鈴薯植株中的POD、CAT活性，及時(shí)清除超過閾值的H2O2，減輕病原菌侵染對細(xì)胞膜的傷害，進(jìn)而減少M(fèi)DA的積累。

綜上所述，VdAL能夠有效地誘導(dǎo)馬鈴薯植株增強(qiáng)對晚疫病的抗性，從而減輕晚疫病的發(fā)生。但本研究尚未對其他抗病機(jī)制進(jìn)行深入研究，因此關(guān)于噴施VdAL后馬鈴薯植株防御基因的表達(dá)、防衛(wèi)信號的識別和傳遞、代謝通路等方面的研究將是下一步研究工作的重點(diǎn)。此外，VdAL在大田生產(chǎn)中的應(yīng)用技術(shù)也需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

大麗輪枝孢激活蛋白（VdAL）對馬鈴薯晚疫病菌的菌絲生長、菌絲重量、孢子囊形成以及孢子囊的萌發(fā)等均無影響，但VdAL對馬鈴薯晚疫病具有顯著的誘抗效果，可通過誘導(dǎo)植株提高防御酶活性和可溶性蛋白含量，降低植株的MDA含量，有效地增強(qiáng)馬鈴薯植株對晚疫病的抗性，可見VdAL能夠通過提高馬鈴薯植株的抗性來減輕晚疫病帶來的危害。