吳 芳，王小艷，王春暉，李文得，姜性堅(jiān)

（湖南省食用菌研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

靈芝屬擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）蘑菇綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）物種。依據(jù)現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)研究，目前常見(jiàn)栽培的靈芝主要有赤芝（G.lingzhi）、亮蓋靈芝（G.lucidum）、中華靈芝（G.sinense）以及通過(guò)現(xiàn)代育種手段選育的多孢靈芝等[1-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的日益革新，近幾十年來(lái)，靈芝種質(zhì)資源、栽培技術(shù)及其在抗腫瘤、抗氧化、保肝、助眠等醫(yī)藥和保健領(lǐng)域的研究和應(yīng)用廣受關(guān)注[5-9]。作為生產(chǎn)與應(yīng)用最為廣泛的藥用菌之一，靈芝存在分類(lèi)地位混亂、種質(zhì)資源來(lái)源不清晰，同物異名等多種現(xiàn)象。目前已有戴玉成教授等學(xué)者相繼對(duì)靈芝的分類(lèi)鑒定進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的總結(jié)[10-11]，但是在靈芝種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、選育創(chuàng)新與利用等方面尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。

單孢雜交育種能夠有效將不同來(lái)源親本的基因進(jìn)行重組，而野生菌株與地方栽培品種的結(jié)合有利于篩選地方適栽的優(yōu)良菌株[12-13]。這些是保障靈芝產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步健康發(fā)展的基礎(chǔ)。因此，筆者采用單孢雜交育種方式，將湖南省內(nèi)較優(yōu)的栽培品種與中華靈芝進(jìn)行雜交，經(jīng)生物學(xué)特性比較、出菇試驗(yàn)及雜交菌株分子鑒定，選育出2株生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定、生物轉(zhuǎn)化率高的雜交菌株，為豐富湖湘地區(qū)栽培靈芝種質(zhì)資源、開(kāi)發(fā)地方氣候適宜栽培品種提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 親本1為湖南省內(nèi)栽培較廣的商品菌株，具有菌絲生長(zhǎng)快、朵大、菇形圓整、產(chǎn)量高但抗病蟲(chóng)害能力較弱的特點(diǎn)。親本2的抗病蟲(chóng)害能力強(qiáng)，但產(chǎn)量較低。上述菌株均保存于湖南省食用菌研究所。

1.1.2 供試培養(yǎng)基及配方 母種培養(yǎng)基為常規(guī)PDA培養(yǎng)基，原種及栽培種培養(yǎng)基配方為木屑40%、棉籽殼40%、玉米粉18%、紅糖1%、石膏粉1%，含水量60%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單孢制備與雜交 單孢雜交參照于晶等[14]的方法，分別收集親本1和親本2的有性孢子，進(jìn)行單孢分離培養(yǎng)，制備孢子單核菌絲體作為雜交親本。

1.2.2 單-雙核及雜交子鑒定 顯微觀察檢驗(yàn)單孢菌絲及雜交菌株，觀察是否具有鎖狀聯(lián)合，將雜交菌株與親本置于同一培養(yǎng)皿培養(yǎng)觀察是否具有拮抗作用。

1.2.3 雜交子及親本分子鑒定 提取親本及獲得的雜交菌株的DNA，擴(kuò)增ITS片段進(jìn)行測(cè)序，比較分析序列堿基構(gòu)成與變異，并采用UPGMA法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。

1.2.4 雜交子篩選 （1）初篩：采用PDA平板培養(yǎng)法，從獲得的39個(gè)雜交菌株中挑選15個(gè)與親本具有明顯拮抗作用的菌株，比較觀察其菌絲生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)時(shí)間。（2）復(fù)篩：挑選初篩結(jié)果中菌絲生長(zhǎng)性狀較好的5個(gè)雜交菌株，通過(guò)栽培試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)當(dāng)?shù)卦耘嗔?xí)慣，每個(gè)雜交菌株制袋100個(gè)，規(guī)格為17 cm×33 cm，每袋裝干料500 g，含水量約為60%，出菇條件溫度為28～32℃，空氣相對(duì)濕度85%～95%。每個(gè)菌株選取20個(gè)菌包，觀察記錄各菌株現(xiàn)蕾時(shí)間，子實(shí)體顏色、質(zhì)地，菌肉厚度、產(chǎn)孢量等生物學(xué)性狀，并計(jì)算生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交子獲得與初篩

由圖1可知，單孢培養(yǎng)分別獲得親本1單核菌絲10個(gè)，親本2單核菌絲12個(gè)，兩兩雜交形成120個(gè)組合，通過(guò)單孢選育共獲得雜交菌株39株，經(jīng)顯微觀察均具有鎖狀聯(lián)合。由圖2可知，通過(guò)拮抗試驗(yàn)挑選與親本存在明顯拮抗作用的15株編號(hào)為GH01～GH15，并進(jìn)行菌絲生物學(xué)特性初篩。

圖1 親本與雜交子菌絲的顯微觀察結(jié)果

圖2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，15個(gè)雜交菌株中GH01、GH03、GH07、GH09、GH10菌絲生長(zhǎng)較快，活力長(zhǎng)勢(shì)佳，且具有較低的感雜率，其他菌株存在感雜率偏高或菌絲較弱的現(xiàn)象。

表1 雜交子初篩菌絲生長(zhǎng)與生物學(xué)特性

2.2 遺傳關(guān)系分析

提取15個(gè)雜交菌株的DNA，擴(kuò)增獲得ITS序列，并采用UPGMA法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖3所示，親本1與赤芝聚為一枝，親本2與中華靈芝（黑芝）聚為一枝，雜交菌株與2個(gè)親本形成獨(dú)立分枝，支持率均大于95%，可信度高，且雜交菌株與親本01號(hào)表現(xiàn)出相對(duì)較近的親緣關(guān)系。

圖3 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（UPGMA法）

2.3 雜交子復(fù)篩

經(jīng)菌絲生物學(xué)特性初篩，選擇GH01、GH03、GH07、GH09、GH10這5株性狀較優(yōu)的菌株進(jìn)行栽培試驗(yàn)。結(jié)果表明，雜交菌株更多表現(xiàn)為親本1的形態(tài)性狀，如菌蓋顏色、產(chǎn)孢情況等，但雜交菌株菌柄較短；其中，GH07和GH09表現(xiàn)出較高的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)孢量，且均略高于2個(gè)親本?？傮w來(lái)看，雜交菌株原基形成時(shí)間和菌蓋形成時(shí)間較早，具有一定的雜交優(yōu)勢(shì)，但GH01、GH03菌株的生物轉(zhuǎn)化率低于其他雜交菌株，且出芝比例也較低，具體原因有待進(jìn)一步探索研究。

2.4 主要栽培技術(shù)

2.4.1 菌袋制作與培養(yǎng) 采用17 cm×33 cm×0.05 cm聚丙烯塑料袋，裝料量500 g（干重）。栽培基質(zhì)配方為雜木屑78%、麥麩20%、石膏粉1%、石灰1%，含水量60%，采用高壓蒸汽滅菌，121℃，2 h。無(wú)菌操作接種，于恒溫24℃、空氣相對(duì)濕度70%～75%、遮光培養(yǎng)。培菌期每天通風(fēng)2次，每次30 min，保持環(huán)境清潔干凈，空氣清新。經(jīng)24～26 d培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)全袋后，再后熟培養(yǎng)7～10 d，至完全成熟。

2.4.2 開(kāi)袋催蕾 當(dāng)菌袋口開(kāi)始吐黃水時(shí)，取下套環(huán)，揭開(kāi)袋口。置于溫度26～28℃，空氣相對(duì)濕度80%～85%，光照100～200 lx環(huán)境條件下，培養(yǎng)6～7 d后，菌袋口開(kāi)始現(xiàn)白色菇蕾，此時(shí)，應(yīng)注意保溫保濕，并保持空氣清新，幼蕾逐漸長(zhǎng)大，9～10 d后幼蕾頂部開(kāi)始分化出黃褐色菌蓋，2～3 d后再分化出菌柄至芝體成形。

2.4.3 出菇期管理 出菇環(huán)境應(yīng)保持溫度28～32℃，空氣相對(duì)濕度85%～95%，光照強(qiáng)度200～400 lx。每天定時(shí)覆蓋薄膜，通風(fēng)透氣，保持空氣清新。當(dāng)芝體長(zhǎng)高至12 cm以上、菌蓋直徑≥8 cm時(shí)，芝體進(jìn)入成熟期，此時(shí)，孢子便會(huì)從菌背面菌孔中彈射出來(lái)。為盡量減少孢子粉散失，宜用透氣紗布或尼龍網(wǎng)布蓋住，保持空氣通暢，以免影響孢子彈射，當(dāng)孢子粉大量彈射時(shí)，空氣相對(duì)濕度降至80%左右，可采用地面灑水增濕，不能向芝體表面噴水，通氣不良或濕度過(guò)大會(huì)阻礙孢子彈射。當(dāng)大量孢子聚集在蓋表面，形成一層1～2 cm厚的孢子粉時(shí)，可用干凈毛刷或吸塵機(jī)一次性收集。收集前3 d，停止施水降低濕度。收集后，應(yīng)及時(shí)曬干，陰雨天應(yīng)烘干至含水量≤11%，用塑料袋密封保存。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單孢雜交技術(shù)成功選育了赤芝與中華靈芝的雜交菌株，且通過(guò)篩選，獲得生物學(xué)特性與產(chǎn)量較優(yōu)的GH07和GH09雜交菌株，這2個(gè)菌株具有菌柄較短、正品率高、生物轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)孢量高等特點(diǎn)，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用與開(kāi)發(fā)潛力，能夠?yàn)榈胤届`芝種質(zhì)資源提供新的選擇。

表2 不同雜交菌株農(nóng)藝性狀比較

何橋蘭[15]在赤芝與黑芝雜交的研究中，發(fā)現(xiàn)雜交后代在不同雜交菌株間，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率和藥用成分等存在明顯差異，優(yōu)勢(shì)并沒(méi)有集中體現(xiàn)在同一雜交菌株上。Liu等[16]用2個(gè)商業(yè)靈芝品種進(jìn)行雜交選育的研究也表明，不同擔(dān)孢子萌發(fā)形成的單核菌絲，其菌絲生長(zhǎng)，多糖、三萜等含量均具有明顯差異，且雜合子栽培形成的子實(shí)體后代在生物學(xué)轉(zhuǎn)化率、菌蓋顏色、形狀以及多糖、三萜等生物活性物質(zhì)含量等方面均表現(xiàn)出非常顯著的差異。

另外，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，研究手段日新月異，真菌全基因組測(cè)序以及各種組學(xué)研究得以實(shí)現(xiàn)，如Chen等[17]利用新一代測(cè)序技術(shù)和光學(xué)制圖技術(shù)對(duì)靈芝的基因組序列進(jìn)行了研究，分析揭示了大量可能參與次生代謝與調(diào)控的基因或基因簇以及三萜和多糖類(lèi)等生物活性物質(zhì)的合成基因及調(diào)控表達(dá)基因，但其具體的代謝過(guò)程以及遺傳發(fā)育等機(jī)理尚不明確。

該研究中，通過(guò)對(duì)親本及雜交菌株進(jìn)行ITS片段的擴(kuò)增測(cè)序，能有效驗(yàn)證其遺傳關(guān)系，但無(wú)法區(qū)分不同雜交菌株的遺傳多樣性，而在菌絲生長(zhǎng)與復(fù)篩農(nóng)藝性狀過(guò)程中不同雜交子表現(xiàn)出較為顯著的差異。因此，在靈芝選育栽培、藥理開(kāi)發(fā)等研究領(lǐng)域，仍需進(jìn)一步從交配型基因、雜交菌株特異性，或活性成分、生理生化與雜交機(jī)理等方面深入研究與探討[18-20]。