張瑞棟 梁曉紅 劉 靜 南懷林 王頌宇 曹 雄

（山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所，030031，山西太原）

干旱脅迫被認為是全世界最具破壞性的非生物脅迫之一，是限制農(nóng)作物生產(chǎn)力提高的巨大障礙[1]。作物生長的任何階段都可能受到干旱脅迫的影響，種子萌發(fā)期是作物對干旱最敏感的時期。高粱起源于非洲，具有高光效和耐貧瘠等特點[2]，是世界上5億貧困人口的主食[3-4]，同時也是我國優(yōu)質(zhì)白酒的釀造原料。經(jīng)過長期的自然進化和人工選擇，高粱具有較強的抗逆性，廣泛種植于干旱和半干旱地區(qū)[5]。然而，高粱在不同生育階段對干旱的敏感性不同，萌發(fā)期是最敏感的時期[6]。春季土壤墑情不足時，高粱常出現(xiàn)發(fā)芽率低、出苗時間長和出苗不整齊等現(xiàn)象，萌發(fā)期干旱也是影響高產(chǎn)群體構(gòu)建和高粱產(chǎn)量提升的重要因素[7]。因此，提高萌發(fā)期抗旱能力是保證高粱高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。

種子引發(fā)（seed priming）是由Heydecker[8]提出的一項控制種子緩慢吸水和后期回干的技術(shù)。該技術(shù)主要經(jīng)過種子前處理，通過調(diào)節(jié)萌發(fā)早期階段的代謝活動，進而促進種子萌發(fā)，并且提高萌發(fā)穩(wěn)定率和整齊率的一種技術(shù)，具有經(jīng)濟、方便和高效等特點[9]。不同類型的引發(fā)劑處理，如水引發(fā)、生長調(diào)節(jié)劑引發(fā)、滲透勢引發(fā)和化學物質(zhì)引發(fā)等，被廣泛用于提高多種作物的耐旱性[10]。Patane等[11]研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇6000（PEG-6000）脅迫會降低種子內(nèi)部水勢，進而影響甜高粱的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，但引發(fā)處理可改善滲透脅迫對種子發(fā)芽的影響。Bismillah等[12]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下CaCl2引發(fā)的玉米種子具有較長的根和較高的產(chǎn)量。Jisha等[13]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸（salicylic acid，SA）引發(fā)可增加種子內(nèi)部滲透勢，提高萌發(fā)期的抗旱能力。郝西等[14]研究發(fā)現(xiàn)，種子引發(fā)可促進種子內(nèi)部淀粉和蛋白活化，進而提高作物的抗逆能力。盡管這些技術(shù)都可提高萌發(fā)期作物的抗逆萌發(fā)能力，但是不同引發(fā)劑在不同作物上的引發(fā)效果具有較大的差異[15]。

本研究以晉雜22和晉早5564為材料，明確高粱種子在不同引發(fā)劑處理后對干旱脅迫的響應，通過對形態(tài)指標和生理指標的研究，篩選提高高粱抗旱萌發(fā)的最佳引發(fā)劑，從滲透調(diào)節(jié)和抗旱氧化代謝角度，初步分析引發(fā)處理提高高粱耐旱性的可能機理，為種子引發(fā)技術(shù)在高粱上的應用提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以高粱品種晉雜22和晉早5564為研究材料，2個品種均由山西農(nóng)業(yè)大學高粱研究所提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2021年在山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所實驗室進行?；谡n題組前期試驗，設(shè)置5個處理，分別為PEG（150mmol/L PEG）、KCl（50mmol/L）、CaCl2（50mmol/L）、SA（0.1mmol/L）引發(fā)和未引發(fā)（NP），研究了在正常情況和干旱脅迫（PEG濃度為15%）下不同處理對種子發(fā)芽的影響。選擇顆粒飽滿、大小均勻的種子，用0.5%的NaClO消毒5min，然后用蒸餾水沖洗5遍。將消毒過的種子分別進行引發(fā)。種子與引發(fā)劑進行混合，比例為1:5（W/V），在25℃的黑暗環(huán)境中引發(fā)10h，期間進行3～4次輕輕攪拌，使種子與引發(fā)劑充分混勻。引發(fā)后，將種子風干至其原始含水量（13%，W/W），以未引發(fā)的種子用作對照（CK）。將不同處理的種子置于帶有雙層無菌濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15cm）中，加入10mL處理液（150mmol/L PEG）。將培養(yǎng)皿進行黑暗培養(yǎng)，溫度設(shè)定為25℃±1℃，相對濕度設(shè)定為70%，連續(xù)培養(yǎng)10d。為了保持恒定的處理溶液濃度，每天更新培養(yǎng)皿中的PEG溶液。每個處理重復3次，每盤放50粒種子，試驗采用完全隨機設(shè)計。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 發(fā)芽率 以芽長為種子長度的50%視為發(fā)芽，在處理后的0、6、12、24和48h調(diào)查發(fā)芽率。

1.3.2 形態(tài)指標 在處理后的第5天，測定不同處理的芽長、根長、芽鮮重和根鮮重。

1.3.3 過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）、可溶性糖、脯氨酸（Pro）含量及抗氧化酶活性 在處理后的第5天，用液氮取樣，置于-80℃的冰箱保存，用于測定生理指標。分別稱取不同處理的高粱芽0.5g，加入5mL的50mmol/L pH 7.2磷酸緩沖液，在冰浴環(huán)境中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到10mL的離心管中，在15 000轉(zhuǎn)/min下離心15min，取上清液用于測定H2O2、MDA含量及酶活性。按照Gong等[16]的方法測定H2O2含量；參照李合生[17]的方法，用蒽酮法測定可溶性糖含量，用硫代巴比妥酸法測定MDA含量；參照張憲政[18]的方法測定Pro含量；參照Zhang等[19]的方法測定SOD、POD和CAT活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel和SPSS 10.0處理系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，采用LSD法進行數(shù)據(jù)間的多重比較，采用Origin 8.0進行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子引發(fā)對萌發(fā)率的影響

由圖1可以看出，干旱脅迫48h后，晉雜22和晉早5564的發(fā)芽率分別下降了12.00%和10.80%，而在正常和干旱脅迫下引發(fā)處理均能提高高粱種子的發(fā)芽率。干旱脅迫下PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)后晉雜22的發(fā)芽率較NP處理分別提高了18.18%、12.72%、35.45%和31.82%。晉早5564的表現(xiàn)與晉雜22相似，PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)處理的發(fā)芽率分別比NP處理提高了20.18%、10.76%、26.91%和30.04%。

圖1 不同引發(fā)劑處理在正常和干旱脅迫下對高粱發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different priming treatments on the germination rate of sorghum under normal and drought stress conditions

2.2 種子引發(fā)對形態(tài)指標的影響

從表1可以看出，干旱脅迫嚴重抑制高粱種子生長，干旱脅迫下晉雜22的芽長、根長、芽鮮重和根鮮重分別比正常降低69.69%、46.27%、65.89%和19.33%，晉早5564分別比正常降低58.40%、62.41%、67.15%和24.97%。種子引發(fā)可顯著提高種子萌發(fā)指標，在干旱脅迫下引發(fā)效果更加明顯。干旱脅迫下，CaCl2和SA引發(fā)在晉雜22上效果較好，芽長分別比NP處理增加267.07%和271.95%，根長分別比NP處理增加了231.94%和355.56%。在晉早5564上，CaCl2引發(fā)的效果最好，根長和芽長分別比NP處理增加了195.96%和206.60%。

表1 不同引發(fā)處理對高粱苗形態(tài)指標的影響Table 1 The effects of different priming treatments on the germination morphological indicators of sorghum seedlings

2.3 種子引發(fā)對H2O2和MDA含量的影響

從圖2可以看出，干旱脅迫后種子芽的H2O2和MDA含量顯著升高，晉雜22芽的H2O2和MDA含量分別較正常增加了237.55%和99.91%，晉早5564分別較正常增加了191.23%和117.68%。干旱脅迫下種子引發(fā)可顯著降低種子芽的H2O2和MDA含量，PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)后，晉雜22的種子芽的H2O2含量分別下降了39.74%、31.82%、51.88%、49.33%，MDA含量分別下降了35.26%、28.57%、40.92%、43.40%；晉早5564也有類似的結(jié)果，芽的H2O2含量分別下降了46.41%、36.33%、53.29%、46.29，MDA含量分別下降了36.81%、33.38%、46.08%、44.65%，差異均達到顯著水平。

圖2 不同引發(fā)處理對高粱芽H2O2和MDA含量的影響Fig.2 The effects of different priming treatments on H2O2and MDA contents in sorghum shoots

2.4 種子引發(fā)對抗氧化酶活性的影響

種子引發(fā)可顯著提高種子芽的抗氧化酶活性，干旱脅迫下更加明顯。干旱脅迫下，PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)處理，晉雜22的SOD活性分別比NP處理提高了21.75%、25.50%、40.95%和37.68%（圖3a），POD活性分別比NP處理提高了20.33%、9.02%、16.53%和34.43%（圖3c），CAT活性分別比NP處理提高了29.65%、42.42%、56.40%和61.46%（圖3e）。種子引發(fā)后晉早5564的抗氧化酶活性表現(xiàn)出與晉雜22類似的變化趨勢（圖 3b、d、f）。

圖3 不同引發(fā)處理對高粱抗氧化酶活性的影響Fig.3 The effects of different priming treatments on antioxidant enzyme activities in sorghum

2.5 種子引發(fā)對可溶性糖和Pro含量的影響

干旱脅迫后，高粱種子芽的可溶性糖含量顯著增加，干旱脅迫下晉雜22和晉早5564的可溶性糖含量分別比正常情況增加了48.97%和40.49%。種子引發(fā)可顯著降低脅迫環(huán)境下種子芽的可溶性糖含量，干旱脅迫下PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)處理，晉雜22的可溶性糖含量與NP處理相比分別降低了17.69%、15.44%、22.79%、22.69%，晉早5564與NP處理相比分別降低12.04%、16.50%、12.80%、16.58%（圖4a、b）。種子引發(fā)顯著提高了種子芽的Pro含量，干旱脅迫下，PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)處理，晉雜22的Pro含量分別比NP處理提高了15.01%、13.22%、28.77%、28.85%，晉早5564的Pro含量分別比NP處理提高了17.84%、16.20%、29.24%、28.46%（圖 4c、d）。

圖4 不同引發(fā)處理對高粱可溶性糖和Pro含量的影響Fig.4 The effects of different priming treatments on the soluble sugar and proline contents of sorghum

3 討論

干旱脅迫是限制作物生產(chǎn)力提高的主要障礙，預計在未來1個世紀內(nèi)干旱的嚴重程度和發(fā)生頻率仍將增加，提高作物的抗旱能力仍是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要課題[20]。春季干旱造成高粱出苗困難的現(xiàn)象是制約高粱產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要瓶頸。本研究通過PEG模擬干旱進行脅迫處理，為了使研究結(jié)果更有普遍性，選取了山西主栽高粱品種晉雜22和最新審定品種晉早5564作為試驗材料。研究結(jié)果顯示，萌發(fā)期干旱顯著降低了2個高粱品種的萌發(fā)率，而且萌發(fā)期干旱顯著抑制了高粱芽和根的伸長。前人[10,13,21]研究表明，種子引發(fā)技術(shù)在植物應對逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，種子引發(fā)可顯著提高作物的抗旱、耐鹽及耐低溫等能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，PEG、KCl、CaCl2和SA引發(fā)均可提高2個高粱品種在干旱脅迫下的萌發(fā)能力，從晉雜22的發(fā)芽率上看，引發(fā)效果為CaCl2＞SA＞PEG＞KCl，在晉早5564上，引發(fā)效果為SA＞CaCl2＞PEG＞KCl。從萌發(fā)的形態(tài)指標上看，CaCl2和SA引發(fā)與其他處理相比，均能顯著提高干旱脅迫下2個高粱品種的芽長和根長，但是這2個處理之間許多指標差異不顯著。因此，本研究認為，CaCl2和SA引發(fā)為較好的處理。

活性氧（ROS）是細胞響應逆境重要的調(diào)節(jié)分子，而且ROS與種子萌發(fā)密切相關(guān)[22]。有研究[23]指出，ROS可以松弛細胞壁，活化淀粉層，為胚根突破種皮提供了必要調(diào)節(jié)。然而，在組織中ROS積累也可加劇脂質(zhì)過氧化和膜退化，并影響植物中生物分子的功能。干旱脅迫會誘導ROS的產(chǎn)生，例如超氧自由基（·O2–）、羥基自由基（·OH）和 H2O2。在本研究中，干旱脅迫造成種子芽的H2O2和MDA含量顯著升高，Bai等[24]研究發(fā)現(xiàn)，棉花種子在干旱條件下萌發(fā)，種子體內(nèi)的H2O2和MDA也會大量積累，說明干旱脅迫已對高粱種子造成一定的膜脂過氧化損傷，這也可能是干旱脅迫抑制種子生長的一個重要因素。在本研究中，種子引發(fā)可顯著降低干旱脅迫下種子胚芽內(nèi)H2O2和MDA含量，而且CaCl2和SA引發(fā)效果較好，說明CaCl2和SA引發(fā)的高粱種子在干旱脅迫下膜脂過氧化程度最低，這也可能是CaCl2和SA引發(fā)在干旱脅迫下具有較高發(fā)芽率和較好形態(tài)指標的重要原因。正常情況下，植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，干旱等逆境脅迫是打破這個平衡的重要因子[25-26]。為了減輕ROS過度積累對膜脂的傷害，植物體內(nèi)形成了一套ROS的酶清除系統(tǒng)，其中SOD、POD和CAT是重要的活性氧清除酶。本研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)的種子在干旱脅迫下表現(xiàn)出較強的抗氧化酶活性。Kanto等[27]和Farhoudi等[28]發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。這可能是因為種子引發(fā)通過前期吸水，提前完成了種子內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)的修復和代謝相關(guān)酶的活化。同時，也可能是引發(fā)劑的化學調(diào)控成分能夠激發(fā)種子內(nèi)部的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，增強抗氧化酶活性。

種子發(fā)芽受多種貯藏產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，可溶性糖為種子發(fā)芽提供能量的同時也作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物體內(nèi)起重要作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)后的種子在干旱脅迫后具有較高的可溶性糖含量，可溶性糖含量增加有助于降低高粱胚芽組織內(nèi)的滲透勢，提高其在高滲透環(huán)境下的耐受力。Khan等[30]研究表明，種子引發(fā)可提高種子胚乳內(nèi)α淀粉酶活性，促使淀粉水解，增加糖的供應。本研究發(fā)現(xiàn)，種子引發(fā)后可溶性糖含量下降，這可能是種子引發(fā)促進了糖的代謝，為種子的抗旱萌發(fā)提供了能量。但是，種子引發(fā)如何調(diào)節(jié)糖代謝以及能量代謝還有待進一步研究。Pro也是植物應對滲透脅迫的一種重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，種子引發(fā)可顯著提高干旱脅迫下高粱芽內(nèi)Pro含量。積累的Pro除了作為植物細胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細胞氧化還原等方面起著重要作用[31]。種子引發(fā)引起Pro增加也是高粱種子對干旱脅迫的一種重要適應機制。

4 結(jié)論

萌發(fā)期干旱脅迫顯著降低高粱種子發(fā)芽率，抑制種子胚芽和胚根的伸長。種子引發(fā)可顯著提高高粱種子在干旱脅迫下的萌發(fā)率，促進種子萌發(fā)，其中CaCl2和SA引發(fā)效果較好。其主要原因可能是由于種子引發(fā)提高了胚芽內(nèi)抗氧化酶活性，減輕了膜脂過氧化對胚芽的損傷；同時種子引發(fā)促進了胚芽內(nèi)糖的代謝，提高了Pro含量，緩解了干旱脅迫對種子萌發(fā)的抑制效應。