魏舒生，馬帥，吳成玉，吳水蕓，許克慶，陶鈞

(1.安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院(淮南市第一人民醫(yī)院)骨科，安徽 淮南 232000；2.安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241000)

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(NONFH)是一種罕見的致殘性骨科疾病，通常因股骨頭細(xì)胞壞死，導(dǎo)致關(guān)節(jié)面塌陷最終引起髖關(guān)節(jié)破壞[1]。NONFH的病因和發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，主要包括血運(yùn)障礙、骨內(nèi)壓增高、脂質(zhì)代謝紊亂及免疫因素等學(xué)說。NONFH典型的病變過程骨壞死發(fā)生—死骨吸收—新骨形成，在骨修復(fù)和重建過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡失調(diào)，破骨細(xì)胞數(shù)量及活性均強(qiáng)于成骨細(xì)胞，骨的吸收大于骨的再生，最終引起股骨頭塌陷變形。

免疫細(xì)胞與骨細(xì)胞有共同的起源，可直接或間接的通過RANKL/RANK/OPG通路影響骨分化，而這樣的影響又與免疫細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子和局部因素等有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)T、B細(xì)胞均與NONFH相關(guān)，對NONFH的進(jìn)展起到促進(jìn)或抑制的作用。然而，尚未查到關(guān)于NK細(xì)胞在NONFH中的作用機(jī)制相關(guān)性研究?；诖耍瑢Ρ妊芯縉ONFH患者與無股骨頭壞死對照組外周血及關(guān)節(jié)液中NK細(xì)胞表型變化，并測定RANKL/RANK/OPG通路表達(dá)變化，確定NK細(xì)胞在NONFH的進(jìn)展過程中，起到一定的作用，豐富NONFH的免疫學(xué)機(jī)制，為早期診斷及治療NONFH提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年2月至2021年12月于安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院擬行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)NONFH患者10例為實(shí)驗(yàn)組，其中男性6例，女性4例，平均年齡(64.70±13.63)歲，所有患者均符合NONFH診斷標(biāo)準(zhǔn)，且術(shù)后均行病理學(xué)檢查。對照組為10例同期無NONFH病史股骨骨折患者，其中男性5例，女性5例，平均年齡(58.60±15.59)歲，并經(jīng)高年資主任醫(yī)師確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)髖關(guān)節(jié)細(xì)菌性感染患者；(2)類風(fēng)濕患者；(3)血沉、類風(fēng)濕因子以及抗“O”升高患者；(4)合并自身免疫疾病患者；(5)近2周內(nèi)曾服用過非甾體類抗炎藥物患者；(6)癌癥患者。本研究通過安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2020-倫審-012)，所有實(shí)驗(yàn)對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑：FITC anti-human CD3、PE anti-human CD56、APC anti-human CD337、PerCP/Cyanine5.5 anti-human HLA-DR(人類白細(xì)胞抗原-DR)(均購自BioLend公司)，人骨保護(hù)素(OPG)ELISA檢測試劑盒(上海邦奕生物)，人核因子κB受體激活因子(RANK)ELISA檢測試劑盒(上海邦奕生物)，人核因子κB受體激活因子配體(RANKL)ELISA檢測試劑盒(上海邦奕生物)。

1.2.2 設(shè)備：BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，振蕩器(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 儀器型號：352型)，洗 板 機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems 儀器型號：AC8)，離心機(jī)：微量高速離心機(jī)(國產(chǎn)儀器型號：TG16W)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產(chǎn)儀器型號：GNP-9080型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集：(1)外周血采集：對照組及實(shí)驗(yàn)組外周血在獲得患者本人同意后于手術(shù)日當(dāng)日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集；(2)關(guān)節(jié)液標(biāo)本采集：①實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液標(biāo)本于手術(shù)時(shí)采集，打開皮膚及皮下組織后，在進(jìn)入關(guān)節(jié)腔前以細(xì)針穿刺抽吸關(guān)節(jié)液；②對照組關(guān)節(jié)液在腰麻起效后局部嚴(yán)格消毒，在C臂機(jī)引導(dǎo)下，以腰麻包導(dǎo)管針穿刺抽取。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)的制備：從乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)二鉀鹽(EDTAK2)管中抽取20 μL外周血，加入CD3、CD56、CD337及Anti-HLA-DR單克隆抗體共孵育，隨后加入1 mL破紅液破紅，平衡液清洗多余單克隆抗體及破紅液后待測。

1.3.3 關(guān)節(jié)液PBMC的制備：將關(guān)節(jié)液標(biāo)本經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾后離心機(jī)2800 r/min離心5 min去除上清液，加入CD3、CD56、CD337及HLA-DR單克隆抗體共孵育，隨后加入1 mL破紅液破紅，平衡液清洗多余單克隆抗體及破紅液后待測。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群的分布及表型特征：將待測樣本順序經(jīng)BD Calibur流式細(xì)胞儀檢測,采用Beckman Coulter(美國)公司Kaluza 2.1版流式分析軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 ELISA檢測:ELISA實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，樣本孔，空白對照孔。具體步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)品：將6個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中，每孔各50 μL；(2)樣本：在樣本孔中加入樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；(3)每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL；(4)37 ℃溫育60 min；(5)棄去液體，置于洗板機(jī)中洗板后甩干，重復(fù)3次；(6)每孔先后加入顯色劑A及顯色劑B各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃下避光放置15 min；(7)各孔加50 μL終止液；(8)測定：通過空白孔進(jìn)行調(diào)零，在450 nm波長處測量各孔的吸光度(OD值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NONFH組和對照組之間的數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NONFH組NK細(xì)胞比例增加

首先我們分別對比分析10例NONFH患者與對照組外周血及髖關(guān)節(jié)液中CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)，見圖1A、圖1C,圖2A、圖2C。

2.2 NONFH組NK細(xì)胞表面天然毒性受體NKp30(CD337)表達(dá)下降

為明確NK細(xì)胞是否參與NONFH病程中免疫行為，我們測定NK細(xì)胞表面受體NKp30的表達(dá)情況，對比分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組NKp30表達(dá)較對照組明顯下降(P<0.05)，見圖1B、圖1D、圖2B、圖2D。

2.3 NONFH組NK細(xì)胞表面活化分子HLA-DR表達(dá)升高

為進(jìn)一步了解NK細(xì)胞在NONFH中的活化情況，我們測定表面活化分子HLA-DR表達(dá)情況，對比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組表面活化分子HLA-DR表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，見圖1B、圖1D、圖2B、圖2D。

ABCD

ABCD

2.4 NONFH組NK細(xì)胞表面OPG/RANK/RANKL通路表達(dá)情況

為了解NK細(xì)胞在NONFH病程中的作用機(jī)制，通過ELISA測定兩組外周血及髖關(guān)節(jié)液中OPG/RANK/RANKL的表達(dá)情況對比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組外周血OPG表達(dá)較對照組表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而關(guān)節(jié)液中表達(dá)無明顯變化，RANK及RANKL表達(dá)較對照組表達(dá)明顯升高(P<0.05 )見表1、表2。

表1 外周血標(biāo)本RANK、RANKL及OPG對比結(jié)果

表2 關(guān)節(jié)液標(biāo)本RANK、RANKL及OPG對比結(jié)果

3 討 論

NK細(xì)胞作為天然免疫的第一道防線被人熟知，其在腫瘤、感染及自身免疫性疾病中的作用被大量研究，我們查閱到NK細(xì)胞在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中促進(jìn)炎癥及關(guān)節(jié)破壞等相關(guān)報(bào)道，尚未查到關(guān)于NK細(xì)胞在NONFH中的作用機(jī)制相關(guān)性研究；但同樣作為免疫細(xì)胞的T、B細(xì)胞均與NONFH相關(guān)，對NONFH的進(jìn)展起到促進(jìn)或抑制的作用；基于此，我們對比研究NONFH患者與健康對照組外周血及關(guān)節(jié)液中NK細(xì)胞表型變化，并測定RANKL/RANK/OPG通路表達(dá)變化，以探尋NK細(xì)胞與NONFH的相關(guān)性。首先，我們通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)測定NONFH患者與無NONFH對照組外周血及關(guān)節(jié)液中NK細(xì)胞表型和其功能受體的表達(dá)情況，結(jié)果顯示NONFH組CD3-CD56+NK細(xì)胞表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)，這表明NK細(xì)胞在NONFH的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用，這與之前報(bào)的NK細(xì)胞在骨性關(guān)節(jié)炎(OA)中的結(jié)果相一致[3]。NK細(xì)胞根據(jù)其表面標(biāo)記物不同，可分為CD56Bright和CD56Dim兩個(gè)亞群；其中CD56DimNK細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而CD56BrightNK細(xì)胞則可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如干擾素γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[4]。我們的結(jié)果顯示NONFH組CD56+NK細(xì)胞較健康對照組顯著升高，這表明在NONFH體內(nèi)NK細(xì)胞可能以分泌細(xì)胞因子的方式促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而影響著NONFH的進(jìn)展。

HLA-DR作為NK細(xì)胞的晚期活化標(biāo)志，在健康者外周血中表達(dá)較少，而在肝臟中大量表達(dá)，當(dāng)處于慢性炎癥狀態(tài)如人類免疫缺陷病毒引起的免疫缺陷、多發(fā)性硬化癥、IgA 腎病[5]時(shí)，其表達(dá)量會顯著增加；HLA-DR與其他非主要組織相容性抗原復(fù)合體II(major histocompatibility complexII，MHC-II)型分子一樣，參與抗原呈遞，所以其在抗原呈遞細(xì)胞中高度表達(dá)，如：巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及B細(xì)胞[6]。我們的檢測結(jié)果顯示NONFH患者NK細(xì)胞表面HLA-DR較健康對照組明顯升高，這表明NONFH體內(nèi)NK細(xì)胞處于激活狀態(tài)。

NK細(xì)胞在免疫過程中，無需抗原提前刺激，在自身表面抑制性及刺激性免疫受體的復(fù)雜的整合調(diào)節(jié)下與靶細(xì)胞直接進(jìn)行免疫反應(yīng)。激活性受體通過識別靶細(xì)胞表面MHC-I調(diào)控NK細(xì)胞活性，其主要包括天然細(xì)胞毒性受體(NCRs)(NKp30，NKp46和NKp44)，c型凝集素受體(NKG2C，NKG2D)[7]。NK細(xì)胞表面激活性受體被刺激后，可有效增強(qiáng)NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷能力，因此我們對比檢測了NONFH患者與對照組NK細(xì)胞表面刺激性受體NKp30的表達(dá)情況，然而，我們的結(jié)果顯示NONFH組NKp30的表達(dá)較對照組明顯下調(diào)，這與NK細(xì)胞在晚期腫瘤患者的免疫過程是相似的。在腫瘤早期免疫中，當(dāng)靶細(xì)胞表面MHC-I表達(dá)量下降或活化性配體表達(dá)量增加，會引起干擾素及細(xì)胞因子等趨化因子的分泌增加，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞NKp30表達(dá)增加、活性增強(qiáng)，使其以不同形式對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向殺傷，其中以穿孔素/顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用為最有效的途徑[8]。穿孔素可穿透腫瘤細(xì)胞膜，有利于絲氨酸蛋白酶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部分解大分子物質(zhì)進(jìn)而發(fā)揮其生理作用，從而引起腫瘤細(xì)胞的壞死溶解[9];在晚期腫瘤免疫過程中,腫瘤細(xì)胞似乎進(jìn)化出多種逃避免疫的途徑，如下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面激活性配體的表達(dá)量、下調(diào)NK細(xì)胞表面天然毒性受體的表達(dá)量，從而達(dá)到逃避NK細(xì)胞免疫攻擊的目標(biāo)，近年來有多項(xiàng)研究證明NKp30的表達(dá)的減少程度與腫瘤嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[10-11]。我們的結(jié)果同樣顯示NKp30在NONFH患者中表達(dá)下調(diào)，這是否說明在NONFH中是否也存在“免疫逃逸”相似的機(jī)制，有待我們進(jìn)一步的研究發(fā)掘。

骨細(xì)胞壞死、吸收及新骨形成，不斷的發(fā)生在NONFH的疾病過程中，但是新骨形成的速度無法與壞死吸收達(dá)到平衡，最終造成股骨頭塌陷變形。RANK主要表達(dá)于破骨細(xì)胞前體、成熟破骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞，其與配體RANKL結(jié)合后促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和成熟，OPG可以結(jié)合RANKL，抑制破骨細(xì)胞分化，這意味著上調(diào)OPG/RANKL比值可以阻止破骨細(xì)胞的發(fā)生[12]。骨保護(hù)素又稱破骨細(xì)胞抑制因子，屬于腫瘤壞死因子家族，研究發(fā)現(xiàn)局部產(chǎn)生的OPG對骨骼、胸腺和腸道系統(tǒng)穩(wěn)定，起到至關(guān)重要的作用，其可抑制所有通過1,25(OH)2D3，PTH和IL-11刺激的3個(gè)不同信號通路誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成[13]，在對骨平衡的維持中起到至關(guān)重要的作用。RANKL同樣屬于腫瘤壞死因子家族成員，可直接與破骨細(xì)胞祖細(xì)胞結(jié)合，對破骨細(xì)胞的分化、融合、存活和活化至關(guān)重要。免疫細(xì)胞與骨細(xì)胞有共同的起源，可直接或間接的通過RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)影響骨分化，而這樣的影響又與免疫細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子和局部因素等有關(guān)[14]。2000年Arron 及Choi通過對既往研究的總結(jié)，首次提出針對骨骼細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及相關(guān)因子和通路的骨免疫學(xué)的概念，用以闡述生理及病理狀態(tài)下骨骼與免疫系統(tǒng)的相互作用及機(jī)制[15]。破骨細(xì)胞受到多種信號通路調(diào)控，包括RANKL/RANK/OPG通路、Wnt/β-catenin通路等,其中以RANKL/RANK/OPG通路最為重要，T、B 淋巴細(xì)胞均可通過RANKL/RANK/OPG通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化發(fā)育。同樣，NK細(xì)胞表面也表達(dá)RANKL/RANK/OPG通路[16]，尚未見到關(guān)于NK細(xì)胞在NOFNH中的作用機(jī)制的研究。因此我們對比分析了NONFH患者與健康對照組外周血及關(guān)節(jié)液中RANK、RANKL及OPG的表達(dá)情況，結(jié)果顯示NONFH組OPG表達(dá)較對照組表達(dá)明顯降低，RANK及RANKL表達(dá)較對照組表達(dá)明顯升高。這與早期相關(guān)性研究的結(jié)果一致[17]，這說明在NONFH的疾病發(fā)生發(fā)展中RANK/RANKL/OPG同樣起到至關(guān)重要的作用。然而遺憾的是，我們并沒能夠?qū)K細(xì)胞敲除而定量分析NONFH患者NK細(xì)胞表達(dá)RANK/RANKL/OPG對其疾病發(fā)生發(fā)展的影響，這仍需我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入的探討。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示NONFH患者外周血及關(guān)節(jié)液中NK細(xì)胞比例明顯增加，且以中CD3-CD56+NK細(xì)胞為主，同時(shí)其HLA-DR的表達(dá)量明顯上調(diào)，提示在NONFH中NK細(xì)胞處于激活狀態(tài)，其殺傷行為增加，加速股骨頭塌陷；而NKp30表達(dá)下調(diào)，提示NONFH在病程進(jìn)展過程中存在與惡性腫瘤相似的免疫逃逸情況；同時(shí)在 RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)中，OPG表達(dá)明顯下調(diào)，RANK、RANKL表達(dá)上調(diào)，這表明在NONFH的病程進(jìn)展過程中破骨細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，骨平衡被打破，骨細(xì)胞死亡分解增加，促進(jìn)骨質(zhì)破壞吸收，加速股骨頭塌陷。從我們的研究中可以發(fā)現(xiàn)，NK 細(xì)胞在NONFH患者中起到了加速疾病進(jìn)展的作用，那么我們是否可以相關(guān)技術(shù)人為或藥物，靶向NK細(xì)胞，降低其殺傷活性，或者上調(diào)OPG、下調(diào)RANK、RANKL的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的活性，從而達(dá)到抑制股骨頭中骨細(xì)胞的壞死與吸收，最終達(dá)到延緩股骨頭壞死、塌陷、變形的目的。