潘浩磊，張凱赟，李楠，張佳博，賀武斌

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

胃癌是十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)躍居第二位[1]。在一些偏遠(yuǎn)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和胃癌早期篩查普及率低的地區(qū)，胃癌發(fā)病率和死亡率已經(jīng)超過(guò)了肺癌[2]。胃癌由于早期癥狀不明顯不能被早期診斷，往往出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)到醫(yī)院診斷已是晚期，導(dǎo)致治愈率大大降低。同時(shí)，胃癌患者的生存期由于其術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移受到嚴(yán)重制約。因此，侵襲轉(zhuǎn)移也是胃癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)，胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的大致過(guò)程包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、偽足形成、促侵襲轉(zhuǎn)移因子分泌等[3]。

EZH2是PcG基因家族中一種果蠅zeste基因增強(qiáng)子(E(z))的人類同源物[4]。研究表明，EZH2過(guò)表達(dá)于如肺癌、腸癌、多發(fā)性骨髓瘤、 頭頸部癌等腫瘤組織中,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。EZH2的高表達(dá)能增加胃癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力[6]。EPZ-6438作為一種有效的選擇性EZH2抑制劑，能抑制野生型和突變型EZH2，有研究報(bào)道，EZH2抑制劑能通過(guò)抑制EZH2來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。在結(jié)直腸癌中，EZH2抑制劑EPZ-6438通過(guò)抑制EZH2介導(dǎo)的STAT3啟動(dòng)子上的H3K27me3水平，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[8]。GSK126 通過(guò)阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑抑制干細(xì)胞樣骨髓瘤細(xì)胞的增殖，并通過(guò)在異種移植小鼠模型中使用RPMI8226細(xì)胞證實(shí)GSK126的體內(nèi)抗腫瘤作用[9]。由于EZH2抑制劑的研究多是圍繞EZH2來(lái)展開(kāi)研究的，其非抑制EZH2方面的研究報(bào)道較少。因此，我們用EZH2抑制劑EPZ-6438來(lái)研究其對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并初步從EMT的角度解釋其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

人胃癌細(xì)胞株HGC-27、MKN-28、MGC-803、MKN-45、AGS細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清、胰酶、1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，EPZ-6438(純度：99.84%,selleck，美國(guó))，8 μm孔徑Transwell培養(yǎng)小室、基質(zhì)膠(美國(guó)康寧公司)，DMSO(二甲基亞砜)購(gòu)自天津佰倫斯生物科技有限公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9和β-actin抗體(CST,美國(guó))，辣根標(biāo)記的二抗(中國(guó)中杉金橋公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HGC-27、MKN-28、MGC-803、MKN-45、AGS細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，置于5% CO237 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理

將EPZ-6438按照說(shuō)明書用DMSO配置后進(jìn)行分裝，長(zhǎng)期保存于-80 ℃冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)取分裝母液用DMSO 進(jìn)行稀釋，Control組溶劑對(duì)照組，加入同等體積的DMSO。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按每孔5000個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后按照給藥不同濃度加入EPZ-6438，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以每孔20 μL的體積加入MTT溶液，孵育4 h。取出96孔板，吸掉含MTT的培養(yǎng)基，加DMSO 150 μL溶解，室溫放搖床震蕩至結(jié)晶完全溶解。在490 nm 波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD(吸光度值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

(1)將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)先更換為無(wú)血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；(2)按照說(shuō)明書將培養(yǎng)基與基質(zhì)膠以1∶6的比例配置成可鋪板的基質(zhì)膠，注入Transwell小室的上室，緩慢吸出，勿產(chǎn)生氣泡，鋪好膠的小室放入培養(yǎng)箱中待其凝固；(3)將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后接入小室上室中，置于與小室對(duì)應(yīng)大小的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中提前加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，即小室下室浸泡在10%胎牛血清的1640培養(yǎng)中；(4)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；(5)取出培養(yǎng)板，用棉簽小心擦去小室上室內(nèi)層殘余細(xì)胞，經(jīng)過(guò)3次PBS浸泡清洗后4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸泡清洗3次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS浸泡清洗3次，待干；(6)倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)3個(gè)視野細(xì)胞數(shù)，計(jì)算侵襲率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析并制圖。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

(1)將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞重懸為單細(xì)胞懸液后進(jìn)行鋪板；(2)細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿90%時(shí)，用10 μL無(wú)菌槍頭以培養(yǎng)板孔的中間標(biāo)記作為參照沿培養(yǎng)板蓋進(jìn)行劃痕，一次劃痕，勿重復(fù)，盡可能使劃痕均勻，用PBS浸洗掉漂浮細(xì)胞后，無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(3)分別于0、24 h拍照；(4)根據(jù)0、24 h細(xì)胞劃痕圖片用image J軟件分析計(jì)算遷移率，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western Blot實(shí)驗(yàn)

(1)收集實(shí)驗(yàn)細(xì)胞樣品,提取蛋白,按照BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量,制成相同蛋白濃度的樣品；(2)蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，4 ℃一抗孵育過(guò)夜；(3)二抗常溫孵育1 h，顯影，保存圖片并進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖，計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并篩選高侵襲力的胃癌細(xì)胞

我們將 HGC-27、MKN-28、MGC-803、MKN-45、AGS細(xì)胞重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以相同數(shù)量的細(xì)胞用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行侵襲能力檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，4種胃癌細(xì)胞中，HGC-27細(xì)胞的侵襲力最高，見(jiàn)圖1。因此，我們選擇HGC-27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞系的侵襲力

2.2 EPZ-6438對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖的影響

EPZ-6438的濃度在20 μmol/L以下時(shí)，對(duì)HGC-27細(xì)胞的增殖影響不大，為了排除EPZ-6438對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖的影響，我們后續(xù)試驗(yàn)選擇EPZ-6438的濃度范圍為0～20 μmol/L，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度EPZ-6438對(duì)HGC-27細(xì)胞毒性的影響

2.3 EPZ-6438對(duì)HGC-27細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇EPZ-6438的作用濃度為0、5、10、15 μmol/L，用含0、5、10、15 μmol/L的EPZ-6438的無(wú)血清培養(yǎng)基處理24 h，Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的逐漸增加，EPZ-6438能明顯抑制HGC-27細(xì)胞的侵襲(F=28.812，P<0.05)，見(jiàn)圖3。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依濃度遞增，EPZ-6438能明顯抑制HGC-27細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(F=44.621，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01

與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01

2.4 Western Blot檢測(cè)EPZ-6438對(duì)HGC-27細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)

與對(duì)照組相比，EPZ-6438能明顯降低HGC-27細(xì)胞中N-cadherin(F=47.761,P<0.05)和Vimentin(F=100.52，P<0.05)的表達(dá)，并促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)(F=16.613,P<0.05)，見(jiàn)圖5。

注與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01

2.5 Western Blot檢測(cè)EPZ-6438對(duì)HGC-27細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)

與對(duì)照組相比，EPZ-6438能明顯降低HGC-27細(xì)胞中MMP-2(F=24.472,P<0.05)和MMP-9(F=35.611，P<0.05)的表達(dá)，見(jiàn)圖6。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01

3 討 論

胃癌在我國(guó)消化系統(tǒng)腫瘤中的發(fā)病率居高不下，除了與感染幽門螺桿菌和EB病毒有關(guān)外，還與過(guò)量食用紅肉等不良的飲食習(xí)慣以及吸煙、酗酒相關(guān)[10]。此外，遺傳易感性也被認(rèn)為是胃癌發(fā)生和發(fā)展的主要原因[11]。EZH2是是多梳抑制復(fù)合物2的核心催化亞基,是一種能夠催化組蛋白H3的27號(hào)位點(diǎn)賴氨酸3甲基化(H3K27me3)的甲基轉(zhuǎn)移酶[12]。研究證實(shí)，EZH2在胃癌等多種腫瘤組織及細(xì)胞中存在高表達(dá)[13]。以往對(duì)EZH2抑制劑的研究均是圍繞EZH2對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡的研究，其非抑制EZH2的功能方面的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)中，我們用EZH2的抑制劑EPZ-6438，并選擇高侵襲力的HGC-27細(xì)胞作為研究對(duì)象，來(lái)研究EPZ-6438對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。根據(jù)MTT結(jié)果，EPZ-6438在20 μmol/L以下時(shí)，對(duì)HGC-27細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性，因此后續(xù)試驗(yàn)我們選擇EPZ-6438的濃度范圍為0～20 μmol/L。

通常，胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的異常生物學(xué)進(jìn)程包括原癌基因的異常激活、抑癌基因發(fā)生突變或失活、DNA堿基發(fā)生錯(cuò)配以及修復(fù)功能失調(diào)、表觀遺傳學(xué)修飾、EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)等[14]。EMT是上皮極性細(xì)胞由于受周圍環(huán)境改變發(fā)生生理或病理變化后轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)型特征的細(xì)胞的過(guò)程，形態(tài)學(xué)改變主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)由多邊形變?yōu)樗笮?，EMT被證實(shí)在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、炎癥以及癌癥進(jìn)展中存在異常激活[15]。既往研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，因獲得間質(zhì)表型而具有更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力及細(xì)胞外基質(zhì)降解能力，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上皮細(xì)胞通過(guò)EMT過(guò)程獲得單個(gè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)而脫離原發(fā)灶進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶轉(zhuǎn)移到其他組織器官后，進(jìn)行MET轉(zhuǎn)換，從間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有上皮表型的細(xì)胞，真正形成轉(zhuǎn)移灶[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在EMT激活的腫瘤細(xì)胞過(guò)程中往往伴隨著N-鈣粘蛋白、波形蛋白等蛋白的表達(dá)升高，E-鈣粘蛋白和密封蛋白等蛋白的表達(dá)降低[17]。基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 是蛋白酶家族成員之一，主要由蛋白酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞表面受體以及黏附分子等構(gòu)成。研究證實(shí)，大多數(shù)癌癥的進(jìn)展與MMP活性相關(guān)[18]。其中，作為MMP家族一類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9被認(rèn)為與癌癥侵襲、血管生成等密切相關(guān)[19]。N-鈣黏著蛋白能與FGF受體發(fā)生作用，促進(jìn)MMP-9 的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)增強(qiáng)EMT進(jìn)程促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，EPZ-6438能明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且呈濃度依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EPZ-6438能明顯降低HGC-27細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，并促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)。為了證實(shí)N-cadherin和Vimentin減少是否會(huì)影響基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，對(duì)EPZ-6438處理的胃癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9表達(dá)減少，這與前面侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，該結(jié)果表明EPZ-6438能明顯抑制胃癌細(xì)胞HGC-27的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與EPZ-6438抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

綜上所述，EPZ-6438能明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。EPZ-6438調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移的具體分子信號(hào)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。