劉旺，陳梅，肖經(jīng)華，許芝彬

(1.廣州市番禺區(qū)第五人民醫(yī)院內(nèi)科；2.廣州市番禺區(qū)第五人民醫(yī)院超聲科，廣東 廣州 510000；3.馬來西亞拉曼大學(xué)理學(xué)院，馬來西亞 坎帕爾50744)

肝臟涉及能量代謝及膽汁的生成，且具有組織損傷后重建的能力。小鼠模型的研究表明，將70%肝臟切除后，在第7～10天其重量和體積完全恢復(fù)。組織學(xué)層面的肝再生涉及多種因素[1]。例如：細(xì)胞因子、信號通路、生長因子等。microRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)參與許多生物學(xué)過程[2]。越來越多的證據(jù)表明miRNAs在肝臟再生中起著關(guān)鍵作用[3-6]。

有報道稱mir-21促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的翻譯，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展；還發(fā)現(xiàn)mir-21/PTEN軸可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號促進(jìn)肝細(xì)胞增殖[7-8]。與此相反，在大鼠肝組織中mir-127在部分肝切除術(shù)后出現(xiàn)下調(diào)，mir-127的過度表達(dá)抑制了大鼠肝brl-3a細(xì)胞的增殖，阻滯了G2/M期細(xì)胞周期[9]。然而，miRNA在肝再生中的作用是什么？尚待進(jìn)一步研究證實。

細(xì)胞外轉(zhuǎn)運蛋白和脂肪的mRNA的循環(huán)。外泌體或胞外囊泡由多種細(xì)胞分泌，廣泛存在于體液中，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運miRNAs、蛋白質(zhì)和mRNAs[11]。此前研究結(jié)果表明，外源性mir-10可以通過調(diào)節(jié)肝切除大鼠肝細(xì)胞增殖，抑制EphA4的出現(xiàn)，促進(jìn)肝再生[12]。外源性miRNAs也被證明可以作為良惡性肝病的診斷生物標(biāo)志[13]。本研究的目的是探討促進(jìn)肝移植術(shù)后肝再生的可能機(jī)制，探討肝切除術(shù)后介入治療的新靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔飼養(yǎng)成年雄性SPF級SD大鼠，10～12 周齡，總共126只，體重約250～300 g。室溫應(yīng)控制在20～25 ℃，常規(guī)清潔飼養(yǎng)，清潔飼料應(yīng)定期更換；將大鼠的飼養(yǎng)室溫保持在20～25 ℃，并創(chuàng)造一個有規(guī)律的晝夜交替周期。本實驗需嚴(yán)格遵守實驗基本原則，對實驗動物進(jìn)行合理合法的處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立70%大鼠肝臟動物模型：制備的hucMSCs懸浮液用PBS洗滌2次，并在無血清和低葡萄糖的LG-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。在1000 g下離心20 min，然后繼續(xù)分別2000 g下離心20 min、10 000 g下離心20 min。將濃縮的上清液裝載在5 mL 30%蔗糖/D2O緩沖液，然后在100 000g下超速離心60 min。收集微泡的濃縮部分，并用PBS稀釋，純化的胞外體漂浮在無核酸酶的水中，-80 °C下儲存以備將來分析。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠肝細(xì)胞BRL-3A細(xì)胞在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：mir-124模擬物、mir-124激動劑、mir-124抑制劑和相對陰性對照(基因藥物)。將Foxg1的開放閱讀框插入pcDNA3 Foxg1過表達(dá)載體，該載體由1個載體(USA，invitrogen)的多個克隆位點構(gòu)建。使用異丁烯6轉(zhuǎn)染試劑(USA,Promega)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率通過隨后的qPCR或Western Blot印跡分析進(jìn)行驗證。

1.2.4 CCK-8測定：使用細(xì)胞計數(shù)對細(xì)胞生長的估計將不同處理的細(xì)胞培養(yǎng)特定時間，然后將10%的細(xì)胞添加到培養(yǎng)基，2 h后，使用微孔板讀取器(USA,bio-TEK)測量450 nm的吸光度。

1.2.5 BrdU檢測：混合法檢測細(xì)胞增殖將經(jīng)不同處理的大鼠肝臟中的Brl-3a細(xì)胞與BrdU溶液(10 μM)混合，在37 °C下培養(yǎng)30 min。BrdU標(biāo)記和檢測試劑盒(USA,sigma-Aldrich)用于分析BrdU的摻入。

1.2.6 實時定量PCR(qPCR):從大鼠肝組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA，并使用Trizol和super transcriptase III將其反轉(zhuǎn)錄為DNA。使用2-ΔCT法分析相對表達(dá)，并使用U6表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照。

1.2.7 免疫印跡：使用Ripa緩沖液和蛋白抑制劑雞尾酒從培養(yǎng)細(xì)胞或大鼠肝組織中分離總蛋白。通過SDS-PAGE分離相同量的蛋白質(zhì)，膜用5%脫脂乳密封，與一級抗體孵育，然后與相應(yīng)的二級抗體孵育。用于研究的主要抗體如下。Chtf8(1∶500、PA5-109543、透明質(zhì)原、USA)、Foxg1(1∶1000、PA5-26794、透明質(zhì)原、USA)和β-肌動蛋白(1∶5000，PA1-16889，透明質(zhì)原，USA)。

1.2.8 熒光素酶報告分析：克隆Foxg1野生型(WT)或突變型(MUT)3'-UTR，構(gòu)建在pGL3-LUC熒光素酶載體(USA，Promega)上。作為可顯色的特殊蛋白質(zhì)載體，將實驗對象的肝細(xì)胞和mir-124模擬物(可以選擇其他參照組)一起轉(zhuǎn)染。在記錄蛋白質(zhì)的相對活性48 h后，等待進(jìn)一步記錄酶的相應(yīng)測試結(jié)果。

1.2.9 納米顆粒追蹤分析和掃描電子顯微鏡：樣品在半瓦燈下干燥，然后在掃描電子顯微鏡下立即拍攝外泌體。

1.2.10 RNA提取：microRNA微陣列從pH或pH+exo組大鼠肝組織中分離總RNA，并用PURELINK miRNA分離試劑盒純化。上海漢工貿(mào)有限公司生產(chǎn)的AFM芯片和基因芯片構(gòu)建列陣差異表達(dá)的miRNA由sangerbox(http://www.sangerbox.com)分析。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中最常用的實驗技術(shù)。原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。

(1)質(zhì)粒構(gòu)建方式：質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣，常規(guī)的T4連接酶，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接；(2)質(zhì)粒載體的制備：質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，使載體的末端具有特異性，防止自連。

2 結(jié) 果

2.1 從參與肝再生的hucMSCs外顯體中鑒定miRNA

為了確認(rèn)參與肝臟再生的hucMSCs來源的外泌體miRNA，實驗采用了miRNA微陣列芯片來識別不同表達(dá)的miRNA。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在外泌體治療后，肝組織中的mir-193a、mir-124和mir-93顯著上調(diào)，而mir-204和mir-10a-5p則呈下降趨勢，見圖1。

*表示P<0.05的顯著性差異；**表示P<0.01的顯著性差異

mir-124和mir-93是促進(jìn)brl-3a細(xì)胞生長的有效模擬載體。通過qPCR分析各組前體miRNA的相對表達(dá)，并檢測各實驗組大鼠肝組織中前體miRNA的表達(dá)水平，以調(diào)查和解釋miRNA表達(dá)變化的來源。實驗結(jié)果顯示，70%肝切除術(shù)后，外泌體注射組和70%肝切除術(shù)后非外泌體注射組的pre-93和mir-193a顯著增加，外泌體注射組的pre-mir-204和pre-mir-10a-5p降低，在外體注射組和非注射組之間，前mir-124沒有顯著差異，見圖2右圖。

左圖：將miRNA模擬物或陰性對照(NC)轉(zhuǎn)染brl-3a大鼠肝細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖；右圖：各組前miRNA相對表達(dá)的qPCR分析圖-3 mir-193a的qPCR分析mir-204、mir-124、mir-93和mir-10a-5p在hucMSCs衍生的外泌體中的相對表達(dá)

通過qPCR分析mir-193a、mir-204、mir-124、mir-93和mir-10a-5p在hucMSCs衍生的外泌體中的相對表達(dá)。進(jìn)一步推測miRNA表達(dá)的變化可能來自來源于hucMSCs的外泌體。進(jìn)一步證實，hucMSCs分泌的mir-124的表達(dá)顯著高于對照組，見圖3，這也表明hucMSCs衍生的分泌的mir-124有可能促進(jìn)SD大鼠肝切除后的肝再生過程。

**表示P<0.01的顯著性差異

2.2 mir-124促進(jìn)大鼠肝臟再生，改善大鼠70%肝切除術(shù)后肝損傷

用agomir-124對各實驗組大鼠進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)因素為：治療過程是否使用agomir-124。對肝組織中的mir-124做qPCR分析。結(jié)果顯示，各組中mir-124差異具有統(tǒng)計學(xué)差異。表明agomir-124治療的介入效果確切。部分肝切除術(shù)增加了mir-124在循環(huán)和結(jié)締組織中的表達(dá)，進(jìn)一步提高了mir-124的表達(dá)，見圖4。在肝臟和血液循環(huán)，對不同時間節(jié)點肝臟/體重比記錄，mir-124的過度表達(dá)顯著增加了部分肝切除術(shù)后的肝臟/體重比，見圖5。對第3天肝組織切片進(jìn)行HE染色和PCNA染色檢測，見圖6、圖7。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，agomir-124還能改善肝壞死，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，降低血清ALT/AST水平，見圖8。由此可見mir-124對肝再生有正向調(diào)節(jié)作用。

*表示P<0.05的顯著性差異；**表示P<0.01的顯著性差異

**表示P<0.01的顯著性差異

**表示P<0.01的顯著性差異

**表示P<0.01的顯著性差異

2.3 mir-124直接靶向Foxg1調(diào)節(jié)大鼠肝細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步了解mir-124調(diào)節(jié)肝再生的機(jī)制，我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以預(yù)測mir-124的潛在靶點。利用miRDB、DIANA和TargetScan在線工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測mir-124的潛在靶點，發(fā)現(xiàn)了6個常見的目標(biāo)點(Chetf8、Pasp、CHSYS、Adam9、Strbp、Foxg1)，見圖9。

通過qPCR分析6個常見靶點(chtf8、PASP、chsy1、ADAM9、strbp和Foxg1)的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，mir-124模擬物顯著抑制chtf8和Foxg1的表達(dá)，見圖10。此外，使用mir-124模擬物或NC轉(zhuǎn)染brl-3a細(xì)胞，并通過Western Blot分析chtf8和Foxg1蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，mir-124的過度表達(dá)顯著降低了Foxg1蛋白的水平，但沒有改變chtf8蛋白的表達(dá)，見圖11。

*表示P<0.05的顯著性差異；**表示P<0.01的顯著性差異

2.4 外源性mir-124 Foxg1下調(diào)，肝部分切除后促進(jìn)大鼠肝再生

為了進(jìn)一步驗證mir-124和Foxg1在肝部分切除術(shù)后肝再生中的作用，進(jìn)一步比較了假手術(shù)組和肝部分切除組大鼠肝臟中Foxg1的蛋白表達(dá)水平。

Western Blot分析假手術(shù)組、pH組、假手術(shù)+exo組和pH+exo組大鼠肝臟中Foxg1蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH組Foxg1的表達(dá)低于假手術(shù)組，外源性干預(yù)進(jìn)一步促進(jìn)了Foxg1的表達(dá)，見圖12。

**表示P<0.01的顯著性差異

Western Blot分析假手術(shù)組Foxg1蛋白的表達(dá)sham+agomir-124和pH+agomir-124大鼠肝臟的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，見圖13。

3 討 論

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC)特別是人臍帶骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種新型的再生細(xì)胞資源再生療法。然而，MSCs生物學(xué)基礎(chǔ)需要深入了解。外泌體是一種重要的生物因子，其內(nèi)含物種類繁多，具有多種生物學(xué)功能。在當(dāng)前研究中，我們從臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中收集外泌體，并檢測其細(xì)胞保護(hù)作用，對組織修復(fù)的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，顯著富集的蛋白質(zhì)組分在代謝中發(fā)揮監(jiān)管作用。生理層面，MSC-Exo使脂聯(lián)素水平升高。此外，MSC-Ex顯著加速了干細(xì)胞的分化，huc-MSCs衍生外泌體可發(fā)揮與其代謝調(diào)節(jié)能力相關(guān)的組織再生作用。

在部分肝切除術(shù)后，殘肝組織在收到反饋信號的刺激后啟動增殖，從而恢復(fù)肝臟的生理功能，不同細(xì)胞因子的參與使這個過程復(fù)雜多樣[14]。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及其衍生的外體已被證明是治療肝纖維化、急性肝損傷和肝癌等肝臟疾病的新策略[15]。由大多數(shù)類型細(xì)胞分泌，被包裹在脂質(zhì)囊泡中直徑為40～100 nm的生物分子稱為外泌體[16]。據(jù)考證，mir-124作為一種基因調(diào)控分子，能有效改變Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，獲得信息反饋，改善缺血、營養(yǎng)不良等因素引起的肝細(xì)胞壞死或暫時性功能障礙[17]。另外來自于hucMSCs衍生的外泌體則能利用抗氧化電位減少因CCl4引起的肝硬化和糖尿病等疾病的發(fā)生[18]。最近的研究集中在MSC來源的外泌體在肝再生中的治療作用[19]。

本研究表明，hucMSCs衍生的外體可以保護(hù)大鼠肝部分切除后的肝損傷并促進(jìn)肝再生。使用大鼠肝組織進(jìn)行miRNA微陣列分析，無論是否進(jìn)行外體處理。多個失調(diào)的mirna已被發(fā)現(xiàn)，mir-124已顯示出促進(jìn)大鼠肝細(xì)胞增殖的能力。

microRNAs (miRNAs)是重要的富集分子，在組織中可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和連接小膠質(zhì)細(xì)胞極化相關(guān)通路的表達(dá)。在已知的miRNA中，mir-124是一個在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的特異性miRNA。在生理條件下，mir-124調(diào)控細(xì)胞在其休眠中起關(guān)鍵作用。在病理條件下，mir-124下調(diào)通過極化細(xì)胞進(jìn)入增加神經(jīng)炎癥M1表型，而mir-124上調(diào)通過將細(xì)胞極化成M2來減少炎癥表型。這些研究表明mir-124是否有潛力成為一種有效的微極化劑，細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型，從而促進(jìn)創(chuàng)傷性膿液神經(jīng)發(fā)生。這是一種很有前途的方向。將mir-124傳遞到組織并發(fā)揮其作用的是外泌體，在內(nèi)膜小體囊泡(30～100 nm)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和小分子核糖核酸。外泌體的優(yōu)點包括它通過血腦屏障(血腦屏障)的能力，mir-124修復(fù)損傷的可能性很大它的雙脂膜使其嵌入mir-124穩(wěn)定并在交付后發(fā)揮作用。值得注意的是，最新的研究表明，外泌體減少了損傷炎癥，促進(jìn)損傷后功能恢復(fù)和mir-124富集的外泌體(Exo-mir-124)促進(jìn)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的M2極化，體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生增強。然而,是否Exo-mir-124可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化及其基礎(chǔ)機(jī)制仍然未知。

為了排除大鼠肝細(xì)胞內(nèi)源性來源mir-124的可能性，檢測了mir-124整體的表達(dá)，未能找出mir-124的差異，但觀察結(jié)果顯示mir-124具有外泌體，有望成為臨床肝再生治療的新標(biāo)志物。mir-124普遍存在于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌等癌癥中，其本身具有抑癌作用。mir-124的特異性表現(xiàn)導(dǎo)致HCC中的表觀遺傳沉默。當(dāng)細(xì)胞周期素依賴的蛋白酶發(fā)育受到阻礙時，肝細(xì)胞組織萎縮甚至死亡的現(xiàn)象稱為mir-124的過度表達(dá)。

當(dāng)mir-124的肝臟環(huán)境發(fā)生變化時，其功能是不同的。肝臟疾病中mir-124過度表達(dá)的治療需要進(jìn)一步研究。FoxG1在卵巢癌細(xì)胞中有很高的表達(dá)。Foxg1還通過啟用Wnt信號啟用HCC-EMT。研究結(jié)論Foxg1是直接靶點，在下調(diào)作用下，F(xiàn)oxg1可以促進(jìn)pH后的肝再生。然而，外源性mir-124/Foxg1如何改善pH后大鼠的肝損傷尚不清楚。參與肝臟再生調(diào)節(jié)的信號通路及其與mir-124/Foxg1的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，由hucMSCs衍生的外泌體mir-124通過負(fù)性調(diào)節(jié)大鼠部分肝切除模型中的Foxg1，促進(jìn)肝再生，抑制肝損傷。這些發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)肝再生的新療法。