胡千慧，曹睿，凌云，郁盛雪

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)遼寧省糖尿病感知功能障礙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000)

糖尿病全球發(fā)病率逐年升高，流行病學(xué)研究表明：到2030年，糖尿病的患病率將增加到7.7%，影響4.39億成年人[1-2]。糖尿病并發(fā)癥主要包括神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病變及大血管并發(fā)癥，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)屬于微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者視力明顯下降或視野缺失，重者可致失明[3-4]。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜細(xì)胞中最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與視網(wǎng)膜血管和視網(wǎng)膜神經(jīng)元密切接觸，主要作用包括神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血流、維持血視網(wǎng)膜屏障，控制視網(wǎng)膜代謝及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，并與DR密切相關(guān)[5]。

漆黃素(FIS)是一種黃酮醇，主要存在于水果、蔬菜、堅(jiān)果、豆類中，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、抗血管生成、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)[6]等多種生物學(xué)特性。漆黃素可通過上調(diào)還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、SOD水平及減少M(fèi)DA含量發(fā)揮抗氧化作用，從而改善帕金森小鼠腦組織氧化損傷[7]。在小鼠肝缺血再灌注損傷模型中，漆黃素能夠減輕IL-1β、IL-18、TNF-α及NLRP3炎癥小體表達(dá)，增加肝組織中p-GSK3β、p-AMPK蛋白表達(dá)來減輕肝缺血再灌注損傷[8]。漆黃素還與Akt-GSK3β信號通路密切相關(guān)，它通過調(diào)節(jié)PTEN-Akt-GSK3β信號通路抑制三陰性乳腺癌、肺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲[9]。

有研究證實(shí)漆黃素通過抑制 β 淀粉樣蛋白生成和Tau蛋白磷酸化等，減輕神經(jīng)毒性損傷，改善記憶功能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；漆黃素在PD模型中提高M(jìn)PTP 小鼠腦組織的GSH、SOD、T-AOC 水平，降低MDA 含量，改善 MPTP 誘導(dǎo)的 PD小鼠腦內(nèi)ROS產(chǎn)生與清除之間的失衡，改善 MPTP 小鼠腦組織的氧化損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。目前尚不清楚漆黃素是否對DR起治療作用。本研究以視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞為研究對象，旨在探討漆黃素對高糖條件下Müller的潛在影響及作用，包括ROS的產(chǎn)生、抗氧化應(yīng)激作用及炎癥因子的表達(dá)及其分子機(jī)制，為漆黃素治療DR提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

Müller細(xì)胞系(上海賓穗生物科技)，漆黃素(純度>98%，成都曼思特生物科技)。DME/F12培養(yǎng)液(Hyclone)，胎牛血清(Aus GeneX)，青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(索萊寶)，二甲基亞砜(Sigma)，增強(qiáng)型細(xì)胞增殖活力(CCK-8)檢測試劑盒(上海尚寶生物科技)，活性氧檢測試劑盒、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔、BCA法蛋白檢測試劑盒、ECL顯影劑、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛含量試劑盒、JC-1檢測試劑盒(索萊寶)，通用型高靈敏度染料法定量PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)，(IL-β、IL-6 、TNF-α)mRNA(華大基因)，單克隆抗β-Actin(華美生物)，磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(p-Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶-3 (p-GSK-3β)(Affinity),HRP標(biāo)記二抗(protein-tech)。細(xì)胞微孔板成像系統(tǒng)cytation5(美國Biotek)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，電泳儀(北京六一)、NANO DROP 2000C(Thermo)、熒光定量PCR儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一部分通過CCK8明確漆黃素生物安全性，確定高糖模型濃度及漆黃素有效濃度。首先在含有Müller細(xì)胞的培養(yǎng)基中分別加入不同濃度漆黃素(0、25、50、75、100 μmol/L)作用48 h檢測細(xì)胞增殖活力；其次分別加入(0、25、50、100 mmol/L)濃度的葡萄糖作用48 h檢測細(xì)胞增殖活力，確定最終高糖模型濃度；最后分別加入(25、50、75、100 mmoL/L)濃度漆黃素預(yù)處理2 h后再加入確定后高糖的濃度培養(yǎng)48 h檢測細(xì)胞增殖活力,確定漆黃素有效濃度。第二部分實(shí)驗(yàn)分為4組，分別是正常對照組(Control)、高糖組(HG)、漆黃素組(FIS)以及TCBN抑制劑組。Control組：正常培養(yǎng)Müller細(xì)胞；HG組：培養(yǎng)基中加入 100 mmol/L高糖培養(yǎng)作用48 h；FIS組：培養(yǎng)基中分別加入75 μmol/L 漆黃素預(yù)處理2 h后加入 100 mmol/L高糖培養(yǎng)48 h；TCBN抑制劑組：培養(yǎng)基中加入漆黃素 75 μmol/L+ 1 μmol/L TCBN預(yù)處理2 h，然后加入100 mmol/L 高糖培養(yǎng)48 h。以上細(xì)胞處理時(shí)間及TCBN濃度根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)確定。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性

取對數(shù)生長期Müller細(xì)胞，接種于96孔板中，密度調(diào)整至每孔1×105個(gè)細(xì)胞，每孔100 μL,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后向各孔加入10 μL不同濃度的葡萄糖和漆黃素，同時(shí)設(shè)置空白對照組，以每個(gè)濃度為1組，每組分別設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔。將96孔培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入10 μL增強(qiáng)型CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱孵育2 h，用Cytation5測定490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/ [A(對照)-A(空白)]×100%。

根據(jù)細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果，最終確定濃度100 mmol/L為高糖模型，75 μmol/L漆黃素是藥物最佳濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

檢測MDA含量和SOD活性，各組Müller細(xì)胞給藥處理48 h后收集細(xì)胞，超聲波破碎，離心取上清液。采用硫代巴比妥酸比色法測定 MDA 含量，黃嘌呤氧化酶法測定 SOD 活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明方法進(jìn)行操作，使用細(xì)胞微孔板成相系統(tǒng)(Cytation5)405 nm 處測定各孔(A)值，表示MDA含量及SOD活性。

DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，各組Müller細(xì)胞給藥處理48 h后，加入終濃度10 mmol/L DCFH-DA，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，使其與細(xì)胞充分接觸，后用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，調(diào)節(jié)488 nm激發(fā)波長，Cytation5觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)強(qiáng)度，放大倍數(shù)20倍。同一實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

JC-1法檢測線粒體膜電位(MMP)，各組Müller細(xì)胞重懸后接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后按照各組要求處理48 h，之后棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，將含有Jc-1探針的空白培養(yǎng)基(1 μg/mL)加入24孔培養(yǎng)板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min ，調(diào)節(jié)激發(fā)波長為488 nm和543 nm，Cytation5觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)強(qiáng)度。

檢測線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放水平，各組Müller細(xì)胞重懸后接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后按照各組要求處理48 h，之后棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗2次。按照檢測試劑盒分別加入適當(dāng)體積染色工作液，放入37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育40 min。之后更換成新鮮的37 ℃預(yù)熱的培養(yǎng)基，再次放入37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，之后棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，最后加入檢測緩沖液，調(diào)節(jié)激發(fā)波長為488 nm，Cytation5觀察細(xì)胞線mPTP開放水平。

1.5 免疫熒光檢測IL-1、IL-6、TNF-α炎癥因子表達(dá)

各組Müller細(xì)胞給藥處理48 h后，PBS沖洗3次；4%多聚甲醛固定25 min，PBS沖洗3次；0.1%TritonX-100通透細(xì)胞30 min，PBS沖洗3次；0.1%BSA。

室溫封閉60 min。加入IL-1、IL-6、TNF-α抗體(1∶500)4 ℃過夜，取出后室溫復(fù)溫放置60 min，PBS沖洗3次，加入二抗anti-mouse,488-conjugated，fluor 647-conjugated anti-rabbit(1∶500)室溫放置2 h，PBS避光沖洗3次，最后用含DAPI染色劑封片。Cytation5觀察細(xì)胞內(nèi)IL-1、IL-6、TNF-α熒光表達(dá)水平并拍照。

1.6 qPCR 法檢測各組細(xì)胞中IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)

各組Müller細(xì)胞給藥處理48 h后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測定總RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增，配制20 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系。PCR設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、 55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)。每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增完畢后，采用2-△△Ct 法計(jì)算IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的相對表達(dá)量。引物序列如下：

表1 qPCR所用引物系列

1.7 免疫印跡法測定IL-1、IL-6、TNF-α、 p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)

各組Müller細(xì)胞給藥處理48 h后，進(jìn)行相應(yīng)蛋白測定。RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞全蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)含量，取蛋白樣20 μg與上樣緩沖液混合后100 ℃煮沸10 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì),濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% BSA封閉，放入一抗IL-1、IL-6、TNF-α、 p-Akt、p-GSK3β(1∶1000)4 ℃雜交過夜。將硝酸纖維素膜經(jīng)TBST沖洗3次后放入二抗(1∶5000)孵育1～2 h。沖洗后吸去多余液體，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測，化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀成像,以β-actin作為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 漆黃素對高糖誘導(dǎo) Müller細(xì)胞增殖活力的影響

CCK8結(jié)果顯示，與對照組相比，100 μmol/L漆黃素降低細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，100 μmol/L以下是安全劑量范圍，見圖1(a)；與對照組相比，100 mmol/L葡萄糖可明顯降低細(xì)胞增殖活力(P<0.01)，見圖1(b)；本研究選用100 mmol/L葡萄糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與HG組比較，25、50 μmol/L的漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞增殖活力沒有作用(P>0.05)；75 μmol/L漆黃素能夠抑制高糖誘導(dǎo)后Müller細(xì)胞增殖活力降低(P<0.05)；而100 μmol/L的漆黃素組反而降低Müller細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，見圖1(c)。以上結(jié)果提示75 μmol/L漆黃素能夠抑制高糖誘導(dǎo)后Müller細(xì)胞增殖活力下降。

**P<0.01 vs Control，## P<0.01vs HG

2.2 漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

2.2.1 漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞MDA及SOD含量的影響

丙二醛(MDA)含量是反映機(jī)體抗氧化能力的參數(shù)，以及體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接的反映出機(jī)體組織及細(xì)胞過氧化損傷的程度。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，其活性可反應(yīng)出機(jī)體抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞MDA和SOD水平比較，結(jié)果顯示HG組MDA含量明顯高于與對照組，SOD活性明顯低于對照組(P<0.05)，漆黃素組MDA含量明顯低于HG組，SOD活性明顯高于HG組(P<0.05)，TCBN組MDA含量明顯高于漆黃素組，SOD活性明顯低于漆黃素組(P<0.05)，見圖2。

**P<0.01vs Control，##P<0.01vs HG，&& P<0.01vs FIS

2.2.2 漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞ROS水平的影響

ROS參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，病理?xiàng)l件下ROS的產(chǎn)生和清除失去了正常平衡，ROS 濃度持續(xù)升高或持續(xù)時(shí)間過長會引起蛋白質(zhì)損傷和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，HG組ROS熒光強(qiáng)度明顯高于與對照組,漆黃素組ROS熒光強(qiáng)度明顯低于HG組，TCBN組ROS熒光強(qiáng)度明顯高于漆黃素組，見圖3。

(a)：熒光圖(20×)；(b)：平均光密度分析

2.2.3 漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞mPTP的影響

mPTP開放導(dǎo)致線粒體損傷及細(xì)胞凋亡，綠色熒光越強(qiáng)，說明mPTP開放程度越低，相反綠色熒光越弱，開放程度越高。結(jié)果顯示，HG組mPTP綠色熒光強(qiáng)度明顯低于對照組,漆黃素組mTPT綠紅色熒光強(qiáng)度明顯高于HG組，TCBN組mPTP綠色熒光強(qiáng)度明顯低于漆黃素組，見圖4。

(a)：熒光圖(20×)；(b)：平均光密度分析

2.2.4 漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞MMP水平的影響

MMP的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。當(dāng)MMP較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)MMP較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示，HG組紅色熒光強(qiáng)度低于對照組，而綠色熒光強(qiáng)度明顯高于與對照組，漆黃素組紅色熒光強(qiáng)度高于HG組，綠色熒光強(qiáng)度明顯低于HG組，TCBN組紅色熒光強(qiáng)度低于漆黃素組，綠色熒光強(qiáng)度明顯高于漆黃素組，見圖5。以上結(jié)果提示漆黃素通過降低高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞MDA含量、抑制ROS產(chǎn)生、穩(wěn)定MMP、抑制MPTP開放及增加SOD活性來抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，而這種作用能被Akt抑制劑TCBN所阻斷，我們推測漆黃素可能通過Akt/GSK3β信號通路發(fā)揮抗氧化作用。

2.3 漆黃素對高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α炎癥因子水平表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，HG組Müller細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組；漆黃素組各炎癥因子熒光強(qiáng)度比HG組明顯減弱；TCBN組各炎癥因子熒光強(qiáng)度比漆黃素組增強(qiáng)，見圖6。

(a～c)：熒光圖(20×)；(d～f)：IL-1β、IL-6、TNF-α平均光密度分析

qPCR和Western Blot結(jié)果顯示，HG組IL-1、IL-6、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)比對照組明顯增加(P<0.05)；漆黃素組各炎癥因子mRNA及蛋白表達(dá)比HG組明顯降低(P<0.05)；TCBN組各炎癥因子mRNA及蛋白比漆黃素組明顯表達(dá)增加(P<0.05)，見圖7。以上結(jié)果提示漆黃素能夠減少高糖誘導(dǎo)誘導(dǎo)Müller細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平，而這種作用能被Akt抑制劑TCBN所阻斷。

(a)：各組細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)；(b～c)：各組細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)及半定量分析

2.4 漆黃素對高糖誘導(dǎo)Müller細(xì)胞p-Akt、p-GSK3β蛋白水平表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，HG組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)；漆黃素組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)明顯高于HG組增加(P<0.05)；TCBN組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)較漆黃素組明顯減少(P<0.05)，見圖8。以上結(jié)果提示漆黃素可能通過激活A(yù)kt/GSK3β信號通路發(fā)揮抗氧抗炎作用，而這種作用能被Akt抑制劑TCBN所阻斷。

(a)：各組細(xì)胞p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)；(b)：各組細(xì)胞p-Akt、p-GSK3β半定量分析

3 討 論

慢性炎癥和氧化應(yīng)激是DR發(fā)病重要因素，其特征是血管和視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性[11]。高血糖能引起體內(nèi)細(xì)胞ROS產(chǎn)生增多，當(dāng)過度ROS的產(chǎn)生與內(nèi)源性抗氧化因子清除ROS的能力不平衡時(shí)，就會發(fā)生氧化應(yīng)激，其特征是ROS誘導(dǎo)的促炎因子和促血管生成因子的過表達(dá)，這些因子會損傷神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，造成組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能障礙，進(jìn)而影響整個(gè)視網(wǎng)膜[12]。因Müller細(xì)胞貫穿于視網(wǎng)膜全層，且與DR發(fā)病密切相關(guān)，所以本研究選用高糖刺激Müller細(xì)胞做為體外模型來研究漆黃素在高糖環(huán)境下對Müller細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示，高糖刺激后Müller細(xì)胞MDA含量大幅度增加，SOD活性明顯下降及產(chǎn)生大量ROS，說明高糖刺激后Müller細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，ROS量升高超出機(jī)體的清除能力,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜系統(tǒng)受到損傷。

mPTP是跨越線粒體內(nèi)外膜的通道，是由蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，當(dāng)線粒體內(nèi)Ca2+超載、過度氧化應(yīng)激，ROS的大量產(chǎn)生時(shí)會導(dǎo)致mPTP呈不可逆性高水平開放，導(dǎo)致線粒體腫脹，線粒體跨膜電位降低，釋放促凋亡因子及抑制BCL-2抗凋亡因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。有研究報(bào)道天麻素抑制氧化應(yīng)激時(shí)心肌細(xì)胞mPTP開放，穩(wěn)定MMP，從而發(fā)揮抗氧化作用保護(hù)心肌細(xì)胞[14]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖損傷后ROS大量產(chǎn)生，導(dǎo)致mPTP開放，而漆黃素干預(yù)后抑制Müller細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制mPTP開放，隨后應(yīng)用JC-1染色觀察MMP，發(fā)現(xiàn)高糖組mPTP開放時(shí)可以導(dǎo)致MMP顯著下降，漆黃素干預(yù)后可有效的抑制mPTP開放，維持MMP相對穩(wěn)定，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。炎癥-免疫反應(yīng)也是近幾年來DR治療的熱點(diǎn)，越來越多的證據(jù)表明炎癥是DR發(fā)生的關(guān)鍵因素。Müller細(xì)胞參與構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障，也是IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的主要來源。糖尿病狀態(tài)下激活NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子，導(dǎo)致Müller細(xì)胞發(fā)生活化，活化的細(xì)胞胞體肥大腫脹，肥大的胞體及突觸進(jìn)入已閉合血管內(nèi)形成瘢痕，晚期又參與其它血管的生成。因此，早期干預(yù)Müller細(xì)胞抑制其活化很有必要。有文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α促進(jìn)活化的Müller細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥反應(yīng)，從而加重青光眼RGC的損傷[15]。另有研究報(bào)道非增殖型DR患者眼部組織中各種炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1水平升高，激活的膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的這些細(xì)胞因子的增加，突出了這些炎癥細(xì)胞因子在DR早期的活性增加，這些炎癥介質(zhì)的積累是糖尿病患者視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞的早期死亡的原因之一?，F(xiàn)階段臨床上使用非甾體類抗炎藥如阿司匹林來治療DR，臨床效果穩(wěn)定且良好，這也從臨床方面證實(shí)了炎癥反應(yīng)在DR發(fā)病中的作用。本研究結(jié)果顯示高糖刺激后IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子表達(dá)增多，漆黃素處理后表達(dá)顯著下降，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

Akt/GSK-3β信號通路在細(xì)胞生長、存活、細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，Akt是絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過抑制凋亡信號從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)是活化的Ser/Thr 蛋白激酶，可調(diào)節(jié)糖原代謝和細(xì)胞凋亡[16]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，激活A(yù)kt 信號通路可保護(hù)氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的小鼠原代神經(jīng)元凋亡；提高磷酸化 GSK 3β(Ser9)，從而保護(hù)線粒體免受鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[17]。本研究結(jié)果顯示漆黃素能夠抑制高糖刺激Müller細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥因子表達(dá)，增加p-Akt及p-GSK 3β蛋白表達(dá)。而加入Akt抑制劑TCBN后結(jié)果顯示漆黃素的抗氧化應(yīng)激及抗炎作用被阻斷，p-Akt及p-GSK 3β蛋白表達(dá)下降，所以我們推測漆黃素是通過激活A(yù)kt/GSK 3β發(fā)揮作用。

綜上所述，在高糖刺激氧化應(yīng)激損傷模型中，漆黃素通過降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量、增加SOD活性、抑制ROS產(chǎn)生、mTPT開放來維持MMP穩(wěn)定，減少炎癥因子表達(dá)從而減輕氧化應(yīng)激損傷，這種作用與激活A(yù)kt/GSK 3β信號通路有關(guān)。但漆黃素對高糖刺激后氧化應(yīng)激和炎癥與線粒體深入機(jī)制還需深入研究。