王翠瑤，單良，岳金金，龐一心，張秀梅

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧 錦州 121000)

葡萄糖是正常組織細胞的最重要能源，在細胞內(nèi)有兩條主要的產(chǎn)能途徑：無氧氧化和有氧氧化。正常細胞在有氧環(huán)境中通常依靠有氧氧化來供能，只有在缺氧條件下以無氧氧化來供能，糖的無氧氧化又稱糖酵解，是一條低效的產(chǎn)能途徑，因此正常細胞有氧氧化通常抑制無氧氧化，被稱為巴斯德效應(yīng)。但已有研究證實：腫瘤細胞為滿足其快速增殖的需要，需要消耗大量的葡萄糖，即使在氧氣充足的條件下，也主要依靠無氧氧化供能，這種代謝特征被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[1]。有氧糖酵解為腫瘤細胞的生長提供以下優(yōu)勢：一是迅速產(chǎn)生能量；二是為腫瘤細胞生物大分子的合成提供原料。有氧糖酵解作為腫瘤標志性特征被廣泛接受，目前靶向糖酵解的抗腫瘤藥物正在研制中[2]。糖無氧氧化的代謝過程是將葡萄糖經(jīng)6-磷酸葡萄糖等一系列代謝轉(zhuǎn)變最后生成乳酸。己糖激酶(hexokinase,HK)是糖無氧氧化的第一個關(guān)鍵酶，催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖的反應(yīng)。HK 催化的反應(yīng)中間產(chǎn)物也是調(diào)節(jié)糖代謝和其他生物合成途徑的一個焦點。因此HK成為調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要靶點。目前發(fā)現(xiàn)己糖激酶存在4種同工酶(HKⅠ、HKⅡ、HKⅢ和HKⅣ)，在這些同工酶中，HKⅡ在多種腫瘤中過量表達，并與不良預(yù)后密切相關(guān)[3-6]。本研究旨在探討HKⅡ調(diào)控乳腺癌細胞葡萄糖消耗、生長增殖及其在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織樣本中的表達情況，并分析其表達水平與預(yù)后的相關(guān)性，從而為揭示乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制并為乳腺癌的臨床診療提供詳實的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

MCF7和MDA-MB-231細胞是本實驗室自有細胞，浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織芯片(包括138例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織芯片和69例相應(yīng)的癌旁組織芯片)購自上海芯超公司，并委托上海芯超公司完成免疫組織化學(xué)實驗及后期統(tǒng)計工作。HKⅡ干擾RNA購自上海吉瑪公司，葡萄糖檢測試劑盒購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

MCF7和MDA-MB-231細胞在RPMI-1640完全培養(yǎng)液中進行傳代培養(yǎng)。細胞狀態(tài)良好時接種于6孔板或12孔板中，待細胞密度至60%～70%開始轉(zhuǎn)染HKⅡ-shRNA和shRNA-control，其序列分別為shRNA-HKⅡ#1：5'-CTGGCTAACTTCATGGATA-3'，shRNA-HKⅡ#2：5'-TGAGTTTGACCAGGAGATT-3'，shRNA-HKⅡ#3：5'-CTGTGAAGTTGGCCTCATT-3'，shRNA-control：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。

1.2.2 采用Western Blot法檢測HKⅡ蛋白的表達水平

轉(zhuǎn)染過程同上，于換液后36 h時棄去培養(yǎng)液收集細胞。采用IP裂解液裂解細胞提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白樣品加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液 (5×Loading Buffer)，煮沸變性5 min，冷卻后進行SDS-PAGE電泳，電泳后75 V轉(zhuǎn)膜2.5 h。TBST稍加漂洗PVDF膜后放在封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中室溫封閉1 h，用HKⅡ和Actin抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后用二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL發(fā)光，Western Blot成像系統(tǒng)采集圖象。

1.2.3 檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度

轉(zhuǎn)染過程同上，MCF7和MDA-MB-231轉(zhuǎn)染30 h后收集并更換1次完全培養(yǎng)液，換液6 h后再分別收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度。

1.2.4 MTT實驗檢測細胞增殖情況

將處于對數(shù)生長期的細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，分組情況同前。待細胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)染shRNA-HKⅡ。轉(zhuǎn)染72 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃避光孵育4 h后，棄去液體，每孔再加入150 μL DMSO，震蕩2 min使結(jié)晶完全溶解后檢測490 nm波長處的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次。細胞增殖抑制率=實驗組A490/對照組A490×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 HKⅡ在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織和癌旁組織中的表達水平

A：HKⅡ在癌旁組織的表達情況；B：HKⅡ在乳腺導(dǎo)管癌中的表達情況

表1 HKⅡ在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌及癌旁組織中的差異表達(%)

2.2 浸潤性乳腺導(dǎo)管癌中HKⅡ的表達水平與臨床特征的關(guān)系

采用Spearman檢驗分析138例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者中HKⅡ的表達與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的年齡、性別、TNM分期、病理分期等臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示HKⅡ的表達與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的年齡、性別、TNM分期和病理分期均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 HKⅡ的表達與臨床病理特征相關(guān)性

2.3 HKⅡ表達水平與乳腺癌患者生存的關(guān)系

我們首先在138例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者中進一步分析HKⅡ的表達水平與乳腺癌患者生存的相關(guān)性。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線和采用Log-rank進行檢驗后發(fā)現(xiàn)，HKⅡ的表達水平與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的總生存期(P<0.001)顯著相關(guān)，Kaplan-Meier生存曲線趨勢提示HKⅡ高表達的乳腺癌患者生存期低于HKⅡ低表達患者，見圖2A。這些結(jié)果提示：HKⅡ的表達水平與浸潤性乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，HKⅡ高表達不利于浸潤性乳腺導(dǎo)管癌的預(yù)后。接下來我們又進一步對選自KMPLOT 數(shù)據(jù)庫的3951位乳腺癌患者HKⅡ的表達水平與其生存期的相關(guān)性進行分析，Kaplan-Meier生存曲線趨勢也提示HKⅡ高表達的乳腺癌患者生存期也明顯低于HKⅡ低表達患者，見圖2B。

A:138例浸潤性乳腺癌患者的Kaplan-Meier分析；B：KMPLOT 數(shù)據(jù)庫的3951位乳腺癌患者的Kaplan-Meier分析

2.4 乳腺癌患者生存影響因素

采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行單因素分析后的結(jié)果表明：HKⅡ的表達情況影響乳腺癌患者的總生存期，HKⅡ高表達是影響乳腺癌患者總生存期的危險因素。多因素分析顯示，HKⅡ的表達水平是影響乳腺癌患者總生存期的獨立危險因素，HKⅡ高表達的乳腺癌患者的總生存期(P=0.001；HR=3.333，95%CI：1.630～6.816)較低表達患者更短，見表3。綜上所述，HKⅡ高表達提示浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的預(yù)后不良。

表3 乳腺癌患者總生存期影響因素的比例風(fēng)險回歸模型

2.5 HKⅡ促進乳腺癌細胞葡萄糖消耗和生長增殖

HKⅡ是糖酵解途徑的第一個關(guān)鍵酶，催化糖酵解途徑的第一步不可逆反應(yīng)，即將葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，故推測沉默HKⅡ可能影響乳腺癌細胞對葡萄糖的攝取。首先我們采用shRNA-HKⅡ和shRNA-control轉(zhuǎn)染MCF7和MDA-MB-231細胞，并通過Western Blot驗證轉(zhuǎn)染效率，見圖3A。接下來采用葡萄糖檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，結(jié)果顯示：沉默HKⅡ后細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度明顯增加，見圖3B，這表明HKⅡ促進葡萄糖的攝取。那么HKⅡ是否通過葡萄糖代謝進而影響乳腺癌細胞的生長增殖？我們接下來采用MTT法檢測干擾HKⅡ后乳腺癌細胞的增殖情況，結(jié)果顯示：沉默HKⅡ后，乳腺癌細胞的增殖明顯減慢，結(jié)果提示：HKⅡ通過促進糖代謝進而促進細胞增殖，見圖3C。

A:HKⅡ干擾效率；B:HKⅡ干擾后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度；C:HKⅡ干擾后細胞增殖情況；*P<0.05，#P>0.05

3 討 論

目前乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后雖然已經(jīng)取得了比較明顯的進展，但長期生存率仍不令人滿意。因此，發(fā)現(xiàn)并深入研究更有效的乳腺癌早期診斷的分子靶標是改善乳腺癌患者生存質(zhì)量及提高其生存率的關(guān)鍵[7-11]。HKⅡ作為HK組織特異性同工酶亞型之一，是催化糖無氧氧化的第一個關(guān)鍵酶，該酶催化的葡萄糖分解代謝途徑中最上游的反應(yīng)，其活性的增加對于將葡萄糖轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞的磷酸戊糖途徑等分支途徑中至關(guān)重要。已有研究證實HKⅡ在多種腫瘤中表達異常升高，葡萄糖無氧氧化的流量亦顯著增加[12-13]。腫瘤細胞中過度的無氧氧化產(chǎn)生大量乳酸造成腫瘤微環(huán)境的酸化，也是腫瘤進展的關(guān)鍵誘因，HKⅡ過表達可促進糖酵解及腫瘤細胞的生長增殖或侵襲轉(zhuǎn)移過程。本研究發(fā)現(xiàn)，在69對乳腺癌病理樣本中，浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者癌組織中HKⅡ的表達水平明顯高于癌旁組織。HKⅡ在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌中可能是扮演癌基因的角色。同時提示其可能與臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，HKⅡ的表達水平與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的生存期存在相關(guān)性。單因素生存分析提示，相較于HKⅡ低表達患者，高表達患者總體生存期更短。多因素生存分析提示，HKⅡ高表達是浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的獨立危險因素。以上結(jié)果為探索浸潤性乳腺導(dǎo)管癌的病理機制提供一定參考，也可能為乳腺癌的臨床診斷和治療提供靶點。已有研究證實HKⅡ是喉鱗狀細胞癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤和胃腺癌的潛在預(yù)后標志物,與我們的實驗結(jié)果一致。

已有研究證實HKⅡ高表達與膽囊腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后顯著相關(guān)，抑制HKⅡ的表達可顯著抑制膽囊癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時大大降低了細胞對葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量[14]。在肝細胞癌中的研究也發(fā)現(xiàn)：敲除HKⅡ可以抑制肝癌細胞的糖酵解水平而促進氧化磷酸化并增加腫瘤細胞對二甲雙胍的敏感性[15]。因此本研究在細胞水平探討HKⅡ?qū)θ橄侔┘毎咸烟窍暮图毎鲋车挠绊?。我們在MCF7和MDA-MB-231中沉默HKⅡ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞消耗的葡萄糖明顯減少，這說明抑制HKⅡ的表達可以抑制糖酵解的流量，減少細胞對葡萄糖的攝取。有研究表明腫瘤細胞通過增加糖酵解的流量為其快速增殖所需的生物大分子的合成提供原料[16-19]。那么在乳腺癌細胞中干擾HKⅡ的表達是否能夠抑制細胞增殖？本研究結(jié)果顯示，在MCF7和MDA-MB-231細胞中干擾HKⅡ的表達顯著抑制細胞增殖。因此我們的研究證實在乳腺癌細胞中通過抑制HKⅡ的基因表達抑制了細胞對葡萄糖的攝取，進而抑制乳腺癌細胞的增殖。

綜上所述，HKⅡ促進乳腺癌細胞糖酵解及生長增殖，參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，而且是乳腺癌預(yù)后不良的獨立危險因素，具體作用機制還需進一步深入研究?？傊ㄟ^抑制HKⅡ表達來降低糖酵解水平可為靶向HKⅡ進行乳腺癌治療提供理論指導(dǎo)。