丁小麗，李 娜，陶宏衛(wèi)

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

0 引言

禽流感（Avian Influenza，AI）是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，是指由A型流感病毒引起的一種家禽、野鳥和部分哺乳動(dòng)物發(fā)病的人獸共患傳染病[1]。禽流感病毒分為高致病性和低致病性兩大類，低致病病毒感染家禽后癥狀不明顯，容易被忽視，因此得以長(zhǎng)期、廣泛的分布，周而復(fù)始的循環(huán)及變異使其不斷適應(yīng)當(dāng)下養(yǎng)殖環(huán)境，進(jìn)而演化成為具有耐藥性及跨種屬感染的新型毒株[2]。因此，在低致病性禽流感流行季節(jié)，對(duì)病毒的分離、鑒定能夠正確診斷該病，從而有效地防控該病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與毒株

筆者在蘇北地區(qū)某公司合作農(nóng)戶雞場(chǎng)采集疑似 H9亞型禽流感發(fā)病雞群病料5份，分別為HF-1、HF-2、JT-1、JT-2、JT-3，采樣時(shí)間為2022年春。

1.1.2 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)抗原：H9禽流感診斷抗原，由國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威客生物工程有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)抗體：H9亞型禽流感病毒特異性血清、禽流感（H5、H7 亞型）陽(yáng)性血清、雞新城疫陽(yáng)性血清、減蛋綜合征陽(yáng)性血清，均有由國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威客生物工程有限公司提供。

相關(guān)試劑：SuperScript? Ⅱ Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶及其Buffer和E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；DL2000 Marker購(gòu)自Takara 公司。

根據(jù)流感病毒H9的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物F與下游引物R，由通用生物（安徽）有限公司合成（表1）。

表1 引物具體序列信息

1.1.4 儀器設(shè)備

單人雙面凈化工作臺(tái)（S W-C J-1 F），購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；全自動(dòng)核酸提取純化儀（Purifier32），購(gòu)自濟(jì)凡生物科技有限公司；基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀（Genesy 96T），購(gòu)自西安天隆科技有限公司；電子天平（Fall04n），購(gòu)自上海菁海儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162），購(gòu)自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；病毒核酸提取盒，購(gòu)自濟(jì)凡生物科技（常州）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集

樣本的采樣是根據(jù)雞群的健康狀況來(lái)采集，因發(fā)病死亡的雞采集組織病料裝密封袋低溫保存。樣本信息具體如表2。

表2 樣品信息

1.2.2 樣本處理

根據(jù)小學(xué)數(shù)學(xué)人教版教材的編排特點(diǎn)、知識(shí)發(fā)展、學(xué)生年齡的特點(diǎn)，從數(shù)學(xué)教材的四個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行分析培訓(xùn)，幫助教師明確每個(gè)部分學(xué)生需要形成哪種類型的基本數(shù)學(xué)活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)等專題培訓(xùn)，幫助教師針對(duì)數(shù)學(xué)活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)對(duì)教材有比較準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。

采集發(fā)病或病死雞只的肝脾肺等內(nèi)臟組織，用高壓滅菌的剪刀將病料充分剪碎，然后將病料裝入裝有三顆鋼珠的5ml管內(nèi)，然后按照3：2的比例加入生理鹽水，用封口帶纏好，放入研磨機(jī)，60Hz研磨2min重復(fù)2次。取出分裝到3管2 mlEP管內(nèi)，加入適量的生理鹽水混勻，于-40℃冰箱中反復(fù)凍融3次。保存凍存盒中，每次使用取一支。8000rpm離心3min，取上清液。

1.2.3 病毒的分離和傳代

取出之前分裝到2 mlEP管內(nèi)的病料液，8000rpm離心3min，在備好滅菌2 mlEP管內(nèi)加入200μl的抗生素，再加入600μl的上清液，靜置1h。本次有5個(gè)樣品，每個(gè)樣品使用3枚雞胚接種，每個(gè)胚接種0.2ml，培養(yǎng)于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中。每日照胚觀察3次。有死胚，取出置于4℃。孵育72h后全部取出，放4℃或-20℃將雞胚凍死，用酒精對(duì)雞胚消毒，用鑷子敲開氣室，測(cè)雞胚效價(jià)，繼續(xù)接胚，傳3代后收取尿囊液。

1.2.4 病毒的血凝與血凝抑制實(shí)驗(yàn)

1）HA實(shí)驗(yàn)。操作方法：準(zhǔn)備多個(gè)一次性96孔“V”形微量反應(yīng)板和100μl刻度微量移液排槍，按表3操作。

表3 HA實(shí)驗(yàn)操作步驟

2）HI實(shí)驗(yàn)。首先測(cè)抗原的效價(jià)，根據(jù)效價(jià)，配制四單位病毒；例如測(cè)得效價(jià)為29，則配制以27計(jì)算。根據(jù)樣品總數(shù)，每孔需要的μl數(shù)，算出需要的四單位病毒ml數(shù)。公式計(jì)算：抗原原液*稀釋倍數(shù)=所需ml數(shù)。例如，測(cè)得效價(jià)為29，則X*27=7ml，X=56，就吸取56 μl的抗原到7 ml的生理鹽水中混勻。

配制好后就進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為前凝集兩孔，后不凝集兩孔就可進(jìn)行下步操作（見表4）。

表4 HI實(shí)驗(yàn)操作步驟

1.2.5 病毒PCR鑒定

PCR鑒定有著靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

1）病毒核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄。在滅菌超凈臺(tái)里，用FineMag快速磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒32次/盒提取病毒DNA。在試劑盒里取出預(yù)封裝深孔板，上下拍打使磁珠重懸，撕去封口膜，將離心后的200μl樣品上清液加入20μl蛋白酶K的96孔板的第2列孔中，加完樣放入核酸自動(dòng)提取儀。將磁棒套插入卡槽內(nèi)。選擇要運(yùn)行的相應(yīng)程序，運(yùn)行結(jié)束后將第6列的核酸樣品轉(zhuǎn)移到高壓過(guò)的2 mlEP管中，-20℃保存。

吸取4μl的反轉(zhuǎn)酶（5×HIScript ll qRT SuperMix ll）加入經(jīng)過(guò)高壓的單個(gè)PCR管中，吸取16μl的核酸樣品，加入該P(yáng)CR管中，將PCR管瞬離使管壁的液體下沉，再放入基因擴(kuò)增儀中，使用反轉(zhuǎn)程序（50℃作用15min、85℃作用5sec、4℃保持），反轉(zhuǎn)體系為20μl。結(jié)束后取出樣品，得到結(jié)果。

2）引物配制。配制引物全程冰盒上操作，引物配制體系見表5。

表5 引物配制體系

3）目的基因的PCR擴(kuò)增。用反轉(zhuǎn)好的CDNA為模板加入對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR，見表6。

表6 PCR運(yùn)行程序

DNA核酸電泳過(guò)程：

a.膠液的配制：稱取1.2 g瓊脂糖，量取100ml 1X電泳液，倒入燒杯中搖勻，然后放入微波爐里加熱熔化顏色清亮即可。

b.膠板的制備：加入7 μl Goldview染料，而后倒入制膠模具中，20min后取出。

c.加樣：5個(gè)樣品每個(gè)吸7 μl加入樣品孔內(nèi)，再第6孔加入7μlMarker。

d.電泳：設(shè)置電壓140V、電流300AM、時(shí)間25min。

e.觀察和保存：凝膠電泳結(jié)束后，將膠版放入可見光透射儀內(nèi)，點(diǎn)紫外透射預(yù)覽觀察有無(wú)對(duì)應(yīng)的目的條帶，點(diǎn)采集保存電泳結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 病毒分離和傳代

5個(gè)病料上請(qǐng)接種9～10日齡SPF雞胚，在37℃培養(yǎng)箱。

表7 樣品接胚后死亡情況

2.2 血凝實(shí)驗(yàn)（HA）和血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）

對(duì)5個(gè)樣品的雞胚尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表8；用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果見表9。

表8 樣品接胚尿囊液HA效價(jià)

表9 樣品收胚尿囊液HI效價(jià)

綜上用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，5個(gè)樣品結(jié)果顯示證明分離得到的病毒為禽流感病毒H9亞型。

2.3 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)5個(gè)樣品RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到目的條帶（見圖1）。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，5個(gè)基因均屬于H9N2亞型禽流感病毒的基因。

圖1 5株P(guān)CR擴(kuò)增電泳圖

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)雞場(chǎng)病例出現(xiàn)大批量雞產(chǎn)蛋率下降、生長(zhǎng)速度減慢、明顯的咳嗽、喘鳴等呼吸道癥狀，結(jié)合剖檢后肝臟、脾及腎出現(xiàn)的典型病理變化初步診斷為禽流感H9亞型。經(jīng)過(guò)對(duì)疑似病例病料采集，通過(guò)雞胚接種，HA、HI試驗(yàn)，PCR等方法對(duì)病毒進(jìn)行分離與鑒定，得出5株均屬于H9N2亞型禽流感病毒的結(jié)論，此實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)。根據(jù)近年來(lái)許多病例和研究表明，以H9N2亞型為主的低致病性禽流感的大范圍流行以及對(duì)養(yǎng)禽業(yè)產(chǎn)生了持續(xù)的危害。本研究密切聯(lián)系我國(guó)蘇北地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的生產(chǎn)實(shí)際，對(duì)禽流感的研究及診斷提供了參考意義，從而更好防控該病。