汪瑞敏，吳 簫，劉丹丹，周 玲，李博巖*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）又名茨梨、木梨子[1]，多種于貴州、四川、云南等地區(qū)[2-3]。刺梨的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[4]，早在《本草綱目拾遺》中就有刺梨促進(jìn)消化的記錄[5]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)刺梨含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚、三萜、黃酮、氨基酸、多糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6-8]；這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在參與人體抗氧化反應(yīng)、抗輻射、消炎和預(yù)防腫瘤等過(guò)程發(fā)揮重要作用[9]。作為刺梨種植大省，貴州的刺梨無(wú)論是品種還是產(chǎn)量均居全國(guó)首位。刺梨在貴州省的種植面積達(dá)15.3萬(wàn)hm2，2019年貴州省刺梨鮮果產(chǎn)量達(dá)6.6萬(wàn)t，貴州省內(nèi)的刺梨加工企業(yè)每年用于榨汁加工的刺梨鮮果達(dá)4.4萬(wàn)t[10]。刺梨汁在加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的果渣，這些果渣中含有較為豐富的多酚、黃酮、維生素C（vitamin C）、SOD和粗纖維[11]，然而這些果渣通常在加工后被直接丟棄或者作為鍋爐燃料[12]，不僅污染環(huán)境，還造成資源浪費(fèi)，因此刺梨果渣深加工的相關(guān)研究近年來(lái)相繼出現(xiàn)，但是目前關(guān)于刺梨果渣的研究主要集中在刺梨果渣中膳食纖維利用[13]或果渣發(fā)酵飼料[12]等方面，而對(duì)于刺梨渣中多酚的再回收則鮮有報(bào)道。

植物中的多酚根據(jù)溶解性可分為可溶性多酚（游離酚）和不可溶多酚（結(jié)合酚）；大約35%～65%的酚類(lèi)化合物以結(jié)合酚形式存在于植物基質(zhì)中?？扇苄远喾涌衫盟芤夯蛩c有機(jī)溶劑混合后進(jìn)行提取。而結(jié)合酚主要以酯鍵和醚鍵等形式與蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)結(jié)合，所以無(wú)法利用溶劑直接提取，一般經(jīng)酸、堿或酶水解后再提取。王婧等[14]優(yōu)化了酸水解提取紫甘薯結(jié)合酚的條件，并測(cè)其抗氧化能力，結(jié)果表明，水解時(shí)間28.15 h、水解溫度60.5 ℃、液料比32∶1，結(jié)合酚提取量最高，其抗氧化能力顯著提高。王振宇等[15]優(yōu)化酸和堿水解提取鮮蓮中結(jié)合酚的條件，其最佳提取工藝條件NaOH溶液濃度2.8 mol/L、料液比1∶25（g∶mL）、水解時(shí)間3.7 h。海玲等[16]利用纖維素酶提取赤霞珠葡萄皮渣中酚類(lèi)物質(zhì)，最終多酚提取率達(dá)到11.238%。

本實(shí)驗(yàn)以刺梨渣為原料，通過(guò)酸水解、堿水解、酶水解3種方式提取刺梨渣中的結(jié)合酚；并對(duì)刺梨渣中游離酚和結(jié)合酚的組成、含量、抗氧化活性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。旨在為刺梨渣的綜合利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：市售；七水硫酸亞鐵、六水三氯化鐵、無(wú)水氯化鋁（均為分析純）：上海國(guó)藥化學(xué)試劑集團(tuán)公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、三吡啶基三嗪（tri-2-pyridyl-s-triazine，TPTZ）、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、福林酚、新銅試劑（2,9-二甲基-1,10-菲羅啉）、水溶性維生素E（Trolox）、沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、對(duì)香豆酸、蘆丁、異槲皮素、斛皮苷、楊梅素、根皮苷、木犀草素、槲皮素、山奈酚（純度均≥98%）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-50F真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；YB-400粉碎機(jī)：永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；HS-50恒溫恒濕箱：南京泰特斯試驗(yàn)設(shè)備有限公司；GRQ-1200超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；H1650R冷凍離心機(jī)：濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；Agilent1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

刺梨渣粉末：刺梨洗凈去籽，切成小塊，經(jīng)壓榨去汁，剩余的刺梨渣冷凍干燥研成粉末，過(guò)60目篩置于干燥器中備用。

1.3.2 游離酚的提取

參考朱昱琳等[17]的方法，稍作修改；取刺梨渣粉末1 g加入20 mL 80%甲醇溶液（含1%甲酸），超聲提取30 min（室溫，320 W），離心（4 500 r/min，10 min，4 ℃）去上清，取殘留物加入40 mL甲醇溶液，重復(fù)上述步驟，離心后兩次上清液合并，即獲得游離酚（F）。殘?jiān)?5 ℃的烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，研成粉末，備用。

1.3.3 結(jié)合酚的提取

（1）酸水解提取結(jié)合酚

參考WANG L等[18]的方法，稍作修改。取1.3.2殘?jiān)勰? g加40 mL 2 mol/L HCl超聲（70 ℃，60 min，300 W）后加10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至2，然后離心（4 500 r/min，5 min），上清液用乙醚和乙酸乙酯等體積混合萃取兩次，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干后再用50%乙醇復(fù)溶得到A1；離心后殘?jiān)^續(xù)加酸二次水解，重復(fù)上述步驟，得到A2；A1、A2均存放于-20 ℃，備用。

（2）堿水解提取結(jié)合酚

參考LI W 等[19]的方法，稍作修改。取1.3.2殘?jiān)勰? g加40 mL 2 mol/L NaOH，超聲（70 ℃，60 min，300 W）后加6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=2，然后離心（4 500 r/min，5 min），上清液用乙醚和乙酸乙酯等體積混合萃取兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃避光蒸干后再用50%乙醇溶解得到B1；離心后殘?jiān)訅A水解，重復(fù)上述步驟，得到B2；B1、B2均存放于-20 ℃，備用。

（3）酶水解提取結(jié)合酚

參考楊希娟等[20-21]的方法，稍作修改。取1.3.2殘?jiān)勰? g加入0.02 g半纖維素酶、0.01 g纖維素酶、0.01 g果膠酶和15 mL水，于85 ℃，320 W 超聲30 min，4 500 r/min離心5 min，上清液用等體積的乙醚和乙酸乙酯混合液（1∶1，V/V）萃取兩次，萃取液置于旋蒸瓶中，45 ℃蒸干后再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇復(fù)溶得到C1；重復(fù)上述步驟，得到C2；C1、C2均存放于-20 ℃，備用。

（4）刺梨渣提取液中總多酚和總黃酮含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu（福林酚比色法）測(cè)定總多酚含量[22]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，所得回歸方程為：Y=0.114X+0.006（R2=0.999 4）。所得結(jié)果用每克刺梨渣樣品干質(zhì)量中沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalents，GAE）表示（mg GAE/g），以干質(zhì)量計(jì)。

總黃酮含量的測(cè)定參照WANG L等[23]的方法并略作修改，具體步驟為：吸取25 μL適當(dāng)稀釋倍數(shù)的提取液于試管中，加入110 μL 0.066 mol/L亞硝酸鈉，搖勻，反應(yīng)5 min后加入15 μL 0.75 mol/L的氯化鋁，搖勻，靜置6 min，再加入100 μL 0.5 mol/L 氫氧化鈉反應(yīng)10 min，以水代替樣品為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同梯度的溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程：Y=0.000 3X+0.001（R2=0.994 4），所得結(jié)果用每克刺梨渣樣品（以干質(zhì)量計(jì)）中蘆丁當(dāng)量（rutin equivalents，RE）表示（mg RE/g）。

1.3.4 刺梨渣提取液多酚高效液相色譜分析

刺梨渣提取液中多酚含量的測(cè)定采用HPLC法。色譜條件如下：色譜柱：Lichrospher C-18；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）；檢測(cè)波長(zhǎng)：全波長(zhǎng)掃描，使用254nm、280 nm、320 nm、360 nm四個(gè)參比波長(zhǎng)，以280 nm為主要觀測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相0.2%磷酸（A）、乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，98% B；5～30 min，95% B；30～40 min，79%B；40～41 min，79%B；41～65 min，54%B；65～70 min，30%B；70～75 min，0%B；75～80 min，98%B；80～85 min，98%B。根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.3.5 刺梨渣多酚提取液抗氧化活性測(cè)定

（1）DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照WANGL等[21]的方法，取50μL樣品稀釋液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)液與100 μmol/L 400 μL DPPH-甲醇溶液在室溫下避光反應(yīng)30min，在波長(zhǎng)517nm下測(cè)量吸光度值。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=1.146 1X-2.175 7（R2=0.998 4），DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

其中：Ai為樣品溶液加DPPH試劑混合液的吸光度值，Aj為樣品溶液加甲醇的吸光度值，Ac為DPPH溶液加樣品溶劑的吸光度值。

（2）ABTS+自由基清除率的測(cè)定

參考ZENGIN G等[24]的方法略作修改。取50 μL樣品稀釋液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)液分別與400 μL ABTS+稀釋液充分混合，室溫下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定波長(zhǎng)734 nm處的吸光度值。Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=2.089 9X+0.536 2（R2=0.998 7），ABTS+自由基清除率按式（2）計(jì)算；

其中：Ac為ABTS+和樣品溶劑混合液的吸光度值，Ai為ABTS+和樣品混合液的吸光度值，Aj為80%甲醇和樣品溶液的吸光度值。

（3）鐵離子還原能力的測(cè)定

參考LIU L等[25]的鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP），30 μL樣品稀釋液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)液與900 μL FRAP試劑[25]混合，在室溫下避光孵育30 min，在波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定吸光度值。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=0.010 1X+0.002（R2=0.999 8）。通過(guò)吸光度值計(jì)算還原力。

（4）銅離子還原能力的測(cè)定

參考UYSAL S等[26]的銅離子還原能力（cupric ion reducing antioxidant capacity，CUPRAC）方法略作修改，取10 μL樣品稀釋液或不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，加入100 μL硫酸銅溶液（5 mmol/L）、100 μL新銅試劑（3.75 mmol/L）和100 μL乙酸銨（1 mol/L）緩沖液，再加入100 μL水，搖勻，避光反應(yīng)30min，于波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度值。Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=0.000 9X+0.006 3（R2=0.995 5）。通過(guò)吸光度值計(jì)算還原力。

DPPH·清除率、ABTS+·清除率、FRAP、CUPRAC結(jié)果用每克樣品（以干質(zhì)量計(jì)）具有相同抗氧化能力所需μmol Trolox的當(dāng)量表示（Trolox equivalents，TE）/g。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（xˉ±s）表示，采用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析和Pearson相關(guān)性分析，采用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨渣提取液中的多酚和黃酮含量

不同水解方法所得刺梨渣提取液中多酚、黃酮含量結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，刺梨渣中游離酚（84.44 mg GAE/g）、黃酮（136.67 mg RE/g）含量最高，游離酚、游離黃酮與不同水解方式得到的提取液中多酚、黃酮的含量存在顯著性差異（P＜0.05）。采用堿水解得到的B1提取液中多酚（2.04 mg GAE/g）、黃酮（5.89 mg RE/g）含量最高；B1提取液中的多酚含量顯著高于其他水解方式（P＜0.05），但黃酮含量則與其他水解方式無(wú)明顯差異；酶水解得到的C1和C2提取液中多酚分別為0.84 mg GAE/g、0.49 mg GAE/g和黃酮分別為2.27 mg RE/g、0.82 mg RE/g；酸水解得到A2提取液中的總多酚（0.30 mg GAE/g）、黃酮（0.45 mg RE/g）含量最低。LI W等[19]研究發(fā)現(xiàn)堿水解相較于酸水解能釋放更多蘋(píng)果渣中的結(jié)合酚，與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明堿水解在提取水果殘?jiān)械慕Y(jié)合酚方面具有更好的效果。以上研究結(jié)果表明刺梨渣中仍存在較高含量多酚，應(yīng)加以利用，避免資源浪費(fèi)。

圖1 不同水解方式刺梨渣提取液中的多酚、黃酮含量Fig.1 Contents of polyphenols and flavonoids in extraction solutions of Rosa roxburghii Tratt pomace by different hydrolysis methods

2.2 刺梨渣提取液中游離酚、結(jié)合酚組成分析

對(duì)刺梨渣水解產(chǎn)物多酚構(gòu)成進(jìn)行了HPLC分析，通過(guò)對(duì)比15種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積，確定刺梨渣水解產(chǎn)物中酚類(lèi)化合物組成和含量。刺梨渣提取液中游離酚和結(jié)合酚的色譜圖和含量如圖2、表1所示。

圖2 刺梨渣不同提取液中多酚類(lèi)化合物色譜圖Fig.2 Chromatograms of polyphenols in different extraction solutions of Rosa roxburghii Tratt pomace

表1 不同水解方式刺梨渣提取液的多酚類(lèi)化合物含量Table 1 Contents of polyphenols in extraction solutions of Rosa roxburghii Tratt pomace by different hydrolysis methods

由圖2和表1可知，F(xiàn)中酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)最豐富（15種），其次為C1（11種）、B1（10種），最少的為B2（5種）；三種水解方式中共有的結(jié)合態(tài)酚類(lèi)物質(zhì)有沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、蘆丁等；酸水解中獨(dú)有的結(jié)合態(tài)酚類(lèi)物質(zhì)為表沒(méi)食子兒茶素（1.17 μg/g），堿水解中獨(dú)有的結(jié)合態(tài)酚類(lèi)物質(zhì)為槲皮素（11.31 μg/g），酶水解中為楊梅素（8.10 μg/g）、根皮苷（305.48 μg/g）。此外，由于供試液相標(biāo)準(zhǔn)品有限，導(dǎo)致未能對(duì)一些含量較高的物質(zhì)進(jìn)行定性，如A1、A2中出現(xiàn)的未知峰（u）。

在游離酚提取液F中，含量較高的是綠原酸（14.83mg/g），兒茶素（2.28 mg/g），對(duì)香豆酸（1.81 mg/g），蘆?。?.58 mg/g），而含量最低的是表沒(méi)食子兒茶素（6.01 μg/g）。酸水解提取液A中共檢測(cè)到10種酚類(lèi)物質(zhì)，含量最高的是沒(méi)食子酸（311.64 μg/g）；堿水解提取液B中含量較高的酚類(lèi)物質(zhì)分別是沒(méi)食子酸（576.87 μg/g）、蘆?。?35.46 μg/g）、綠原酸（325.98 μg/g）；酶水解提取液C中含量較高的酚類(lèi)物質(zhì)分別是綠原酸（3.02 mg/g）、沒(méi)食子酸（542.25 μg/g）、根皮苷（305.48μg/g）。不同水解方式得到的結(jié)合酚中除了酸水解提取液A1中含有表沒(méi)食子兒茶素，其他提取液中均未見(jiàn)檢測(cè)到。

單體酚的含量整體變化規(guī)律為：游離酚＞結(jié)合酚，但是沒(méi)食子酸和根皮苷水解后的含量較游離酚均有不同程度的增加，說(shuō)明在刺梨渣中這兩種酚類(lèi)物質(zhì)多以結(jié)合態(tài)形式存在，經(jīng)水解處理才能釋放。

2.3 刺梨渣多酚提取液體外抗氧化活性

不同水解方式所得刺梨渣提取液的抗氧化能力如圖3所示，結(jié)果表明，刺梨渣提取液中游離酚、結(jié)合酚的DPPH·清除率、FRAP變化趨勢(shì)和多酚含量變化趨勢(shì)相似，其中游離酚的DPPH·清除率、FRAP抗氧化活性最強(qiáng)，分別為854.87 μmol TE/g和336.24 μmol TE/g，與其他提取液的抗氧化活性存在顯著性差異（P＜0.05）。三種水解方式中，堿水解的提取液B1的DPPH·清除率、FRAP明顯高于另外兩種水解方式（P＜0.05），分別為15.34 μmol TE/g和5.57 μmol TE/g；抗氧化能力最低的則為A2，其DPPH·清除率、FRAP分別為2.49 μmol TE/g和0.74 μmol TE/g。ABTS+·清除率和銅離子還原能力的變化趨勢(shì)則與黃酮含量變化趨勢(shì)相似，游離酚抗氧化活性最強(qiáng)，分別為995.35 μmol TE/g和1 212.08 μmol TE/g；另外三種水解方式刺梨渣提取液的ABTS+·清除率和銅離子還原能力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 不同水解方式刺梨渣提取液的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of extraction solutions of Rosa roxburghii Tratt pomace by different hydrolysis methods

刺梨渣提取液中總酚、總黃酮、單體酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明多酚、黃酮含量與抗氧化能力之間存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。與許澤文等[27-29]報(bào)道發(fā)現(xiàn)的多酚含量與抗氧化能力呈正相關(guān)的結(jié)果一致。單體酚中除了沒(méi)食子酸和根皮苷與總酚、總黃酮含量和抗氧化活性之間無(wú)相關(guān)性之外（P＞0.05），其余單體酚均與抗氧化活性存在極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。沒(méi)食子酸和根皮苷主要以結(jié)合酚形態(tài)存在，說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性可能與其存在的形態(tài)有關(guān)；且游離酚含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)。這與白姍姍等[31-32]研究發(fā)現(xiàn)，樣品原料的抗氧化能力與它的多酚、黃酮的含量、組成等相關(guān)的結(jié)果一致。

表2 刺梨渣提取液中總酚、總黃酮、單體酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性Table 2 Correlation between contents of total phenols,total flavonoids,mono phenols in extraction solutions of Rosa roxburghii Tratt pomace and antioxidant ability

3 結(jié)論

水解方式對(duì)刺梨渣酚類(lèi)含量和組成、抗氧化活性均具有一定的影響，其中堿水解相較于酸水解和酶水解，具有更高的提取效率，堿水解所得酚類(lèi)含量、抗氧化活性均優(yōu)于另外兩種方式。刺梨渣中游離酚、黃酮含量最高，主要成分有綠原酸、兒茶素、對(duì)香豆酸等。堿水解得到的提取液中B1中結(jié)合多酚、結(jié)合黃酮含量最高；沒(méi)食子酸和根皮苷這兩種種酚類(lèi)物質(zhì)則主要以結(jié)合態(tài)的形式存在于刺梨渣中。由皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析可知多酚、黃酮含量與抗氧化能力之間存在顯著相關(guān)性，且相關(guān)性與酚類(lèi)物質(zhì)的形態(tài)有關(guān)，以結(jié)合態(tài)存在的酚類(lèi)與抗氧化能力相關(guān)性弱。綜上，刺梨渣富含酚類(lèi)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，此研究為進(jìn)一步研究刺梨渣中的酚類(lèi)物質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)刺梨渣開(kāi)發(fā)利用有一定的參考價(jià)值。