姚孟琦，郭澤峰，郭世鑫，張小娜，薛 潔，李 紅*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.杭州千島湖啤酒有限公司，浙江 杭州 311700；3.天津科技大學 生物工程學院，天津 300222）

啤酒是世界上消費最廣泛的酒精飲料之一，在傳入我國之后，以工業(yè)啤酒為主的啤酒消費市場得到了飛速的發(fā)展，并在2002年超越了美國，成為世界第一大啤酒市場。工業(yè)啤酒是以大麥芽、水、啤酒花作為主要原料、選用下面發(fā)酵啤酒酵母并采用傳統(tǒng)拉格工藝生產的啤酒，多為低溫12 ℃發(fā)酵的淡色啤酒，口感單一，因此導致了近年來中國啤酒產品間同質化、低質化嚴重，并且消費者對啤酒產品的多樣化需求導致近年來工業(yè)啤酒消費市場日漸低迷[1]。與此同時，源于西歐國家的精釀啤酒以其風味獨特、運輸成本低、與當代餐飲休閑文化的契合度較高等優(yōu)勢在國內大受追捧[2-4]。精釀啤酒是由小型啤酒廠或是小型工坊以大（?。溠俊⑺?、啤酒花及為了風味和口感添加的新型釀造原料為原材料，選用上面發(fā)酵啤酒酵母、利用傳統(tǒng)的釀造工藝生產的具有獨特風味啤酒。國內各大啤酒廠紛紛布局中國精釀啤酒市場，啤酒酵母是啤酒釀造過程中的核心與靈魂。

根據(jù)啤酒發(fā)酵方式的不同，啤酒酵母可以分為上面發(fā)酵（Ale）和下面發(fā)酵（Lager）啤酒酵母[5]。目前，國內研究致力于優(yōu)選酯香醇厚、發(fā)酵度較高、果香、花香等典型風格較為突出的上面發(fā)酵酵母，用于開發(fā)不同風格的精釀啤酒，從而賦予精釀啤酒發(fā)酵周期短、啤酒香味獨特的風格特點[6-9]。隨著精釀啤酒市場的擴大，應用于精釀啤酒生產的酵母數(shù)量種類繁多，研究不同類型酵母對精釀啤酒的風味和感官特性的影響，明確采用兩種不同的發(fā)酵方式生產的啤酒類型的差異性，對于開發(fā)精釀啤酒新產品、提高啤酒質量具有重要的意義[10-11]。

針對這一背景，對實驗室保藏的4株上面啤酒酵母和1株下面啤酒酵母分別進行了模擬發(fā)酵試驗。對5株酵母發(fā)酵過程中的外觀糖度、雙乙酰的還原及高級醇和酯類物質、有機酸成分進行檢測，研究旨在通過采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro extraction，HS-SPME）、離子色譜（ion chromatography，IC）提取并鑒定分析不同類型酵母發(fā)酵的啤酒樣品中的香氣成分和有機酸成分，通過偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）進行監(jiān)督多變量統(tǒng)計性主成分分析，達到特定的標記化，優(yōu)選出具有高發(fā)酵度、酯香突出、風味協(xié)調的啤酒酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株A1、A2：市售活性干酵母；菌株A3、A4、L5：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院保藏，菌株相關信息見表1。

表1 實驗菌株信息Table 1 Information of experimental strains

瓊脂（生化試劑）：北京博奧拓科技有限公司；鹽酸溶液（分析純）、鄰苯二胺：天津市恒移化工原料有限公司。

麥芽汁培養(yǎng)基：國產大麥芽粉碎，利用協(xié)定糖化法制備12°P麥汁，115 ℃滅菌20 min備用。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；QXT-1糖化儀：中國原子能科學研究院；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份公司；larus 600型GC-MS聯(lián)用儀：美國PerkinElmer公司；ICS-3000型離子色譜儀，配有EluGen Cartridge淋洗液自動發(fā)生器、電導檢測器和Chrromeleon 6.80色譜工作站：美國Dionex公司；TS-5000Z Handling Tutorial型電子舌：日本Insent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗室啤酒模擬發(fā)酵體系

以實驗室制備的400 mL麥汁培養(yǎng)基作為原料，按10%的接種比例，5株釀酒酵母的接種量均為7×107個/mL，14 ℃進行接種，搖勻后扣上發(fā)酵拴，上面發(fā)酵啤酒酵母的主發(fā)酵溫度為20 ℃，下面發(fā)酵啤酒酵母的主發(fā)酵溫度為12 ℃，在1 L三角瓶中進行發(fā)酵，每天搖瓶測定CO2質量損失[11-12]。

1.3.2 啤酒理化指標檢測

發(fā)酵結束時取樣檢測，根據(jù)國標GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[13]進行酒精度、雙乙酰、原麥汁濃度、真正發(fā)酵度、表觀發(fā)酵度等啤酒理化指標的測定。pH值測定：采用pH酸度計直接測定；懸浮酵母細胞數(shù)：采用血球計數(shù)板法測定；外觀濃度測定：采用糖度計直接測定。

滋味測定：取樣品50 mL于電子舌樣品杯內，每種樣品兩杯，待測。每個樣品循環(huán)測定4次，舍棄第一組數(shù)據(jù)，選取其余3組數(shù)據(jù)用于結果分析，測定的味覺包括酸味（sourness）、苦味（bitterness）、咸味（saltiness）、鮮味（umami）、澀味（astringency）、鮮回味（豐富度）（richness）等。

1.3.3 HS-SPME以及離子色譜分析條件

頂空固相微萃取條件：在250 ℃的氣相色譜進樣口對SPME纖維進行1 h的預處理。進樣口溫度：240 ℃；檢測器溫度：250 ℃；DB-WAX型色譜柱（0.53 mm×30 m×1 μm）；柱溫箱升溫程序：初始溫度35 ℃，保溫3 min，以10 ℃/min升溫到60 ℃，20 ℃/min升溫到120 ℃，40 ℃/min升溫到220 ℃；載氣為高純氮氣（N2），流速為8 mL/min。

離子色譜（IC）鑒定/分析條件：淋洗液流速1.0 mL/min；電導檢測器檢測；進樣量：25 μL。通過與已知純化合物的保留時間和標準曲線（相關系數(shù)R2＞0.99）進行鑒別和定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SIMCA 14、Origin 9.5和Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵性能差異對比

2.1.1 降糖能力

麥汁中的主要固形物是糖，麥汁濃度和相對密度隨著發(fā)酵過程不斷下降，可以根據(jù)發(fā)酵液的每天CO2質量損失，判斷酵母的降糖能力，通過計算獲得降糖量和發(fā)酵度的理論值[14]。選取4株上面發(fā)酵啤酒酵母和1株下面發(fā)酵啤酒酵母在12 °P麥汁中發(fā)酵，每天定時測定不同酵母發(fā)酵液的CO2質量損失，繪制酵母的CO2質量損失曲線和發(fā)酵度變化曲線，結果見圖1和圖2。

圖1 不同酵母啤酒發(fā)酵過程中的CO2質量損失變化Fig.1 Changes of CO2 mass loss during beer fermentation with different yeasts

圖2 不同酵母啤酒發(fā)酵過程中發(fā)酵度變化Fig.2 Changes of fermentation degree during beer fermentation with different yeasts

由圖1可知，4株上面啤酒酵母菌株（A1～A4）與下面啤酒酵母菌株L5比較，菌株A1～A4發(fā)酵初期產生大量CO2，起始發(fā)酵速度更快，產生CO2量更多，降糖速度也更快，是菌株L5的2倍以上，其中菌株A2的起始發(fā)酵速度最快。A1～A4的CO2質量損失的峰值均出現(xiàn)在發(fā)酵第2天，菌株A1、A2發(fā)酵速度較快，CO2每日質量損失分別為2.14 g/400 mL、2.16 g/400 mL，菌株A3、A4相較于菌株A1、A2發(fā)酵時間更長，菌株A3的CO2質量損失總量達20.68 g/400 mL。隨著酵母CO2質量損失增加，不同的酵母利用糖的機制也不同，隨著麥汁中葡萄糖的濃度升高，會抑制酵母細胞分泌麥芽糖滲透酶，酵母無法利用麥芽二糖和麥芽三糖，發(fā)酵速度變慢，即“葡萄糖阻遏效應”[15-16]。

由圖2可知，發(fā)酵結束時，菌株A3的發(fā)酵液發(fā)酵度最高，代謝糖的能力最強，最高發(fā)酵度達80.87%，是一株具有高發(fā)酵力的啤酒酵母。與上面發(fā)酵相比，L5的起始發(fā)酵時間最晚，發(fā)酵度最低。隨著可發(fā)酵性糖的量減少，發(fā)酵度越來越高，酒精濃度越來越高，逐漸抑制酵母的生長代謝，當發(fā)酵液的外觀濃度接近3°P時，大部分的酵母代謝糖的能力基本達到了極限值，發(fā)酵度變化曲線基本趨于平緩。

2.1.2 發(fā)酵液理化指標

發(fā)酵液發(fā)酵結束后，對其理化指標進行檢測，結果見表2。由表2可知，菌株L5發(fā)酵液的發(fā)酵度最低，真正濃度最高，下面發(fā)酵的發(fā)酵程度弱于上面發(fā)酵，發(fā)酵液的pH值高于上面發(fā)酵，雙乙酰含量較低，這與下面發(fā)酵的發(fā)酵溫度較低、發(fā)酵時間較長有關。在上面發(fā)酵的4株酵母中，A3酵母的發(fā)酵時間較長，真正發(fā)酵度、酒精度都較高，發(fā)酵度高達80.87%，對酒精的耐受度高，適用于發(fā)酵原麥汁濃度較高的啤酒。而菌株A1、A2、A4的發(fā)酵液的理化指標接近，酒精度在5.32%vol～5.39%vol，真實發(fā)酵度在67%左右，雙乙酰含量在0.07～0.08 mg/L，均在啤酒的風味閾值（0.1 mg/L）之內。不同的酵母菌種具有不同的α-乙酰羥基合成酶活力，通過選育出適合的酵母菌株，可以降低雙乙酰合成的前體物質的生成，從而降低成品啤酒中的雙乙酰的含量。

表2 不同酵母發(fā)酵液的理化指標Table 2 Physical and chemical indexes of fermentation broth with different yeasts

2.2 不同酵母的發(fā)酵液揮發(fā)性物質及其差異性分析

在啤酒發(fā)酵過程中酵母除了產生酒精、二氧化碳以外，還會生成大量的副產物，這些副產物多為風味物質，如有機酸、高級醇、酯、醛等，這些風味物質構成了啤酒的風味主體[17-19]。其中，高級醇和酯類物質是啤酒豐滿口感和豐富香味的主要物質，能夠使酒體更加醇厚。酯類物質在啤酒中約有30余種，最重要的僅有幾種，以己酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯為主，高級醇類物質以正丙醇、異丁醇、異戊醇等為主。但是風味物質的含量如果過高，也會破壞酒體的協(xié)調性，使得啤酒帶有異香或者異味，甚至引發(fā)飲酒者的頭痛等現(xiàn)象[20]。酵母發(fā)酵結束后，對發(fā)酵液的揮發(fā)性風味物質進行檢測，結果見表3。

由表3可知，菌株A1～A4的發(fā)酵液的總酯含量均＞35 mg/L，其中菌株A3的發(fā)酵液中的乙酸乙酯、乙酸異戊酯的含量較高，總酯含量高達47.61 mg/L，而下面發(fā)酵菌株A5的總酯含量為28 mg/L。啤酒中大部分的風味酯都是在酵母的發(fā)酵過程中以乙酰輔酶A和高級醇作為底物并且通過?；D移酶來合成的，上面發(fā)酵的溫度更高，生成更多的高級醇轉化為酯類物質，符合上面發(fā)酵啤酒獨特的酯香醇厚的風格特征[17，21-23]。菌株A3、A4發(fā)酵液的高級醇含量較高，可能與菌株類型、起始發(fā)酵溫度較高、麥汁中的氨基酸含量較高等因素有關。其中菌株A3的乙酸乙酯含量高達45.64 mg/L，發(fā)酵液的總酯含量高達47.61 mg/L，高級醇含量也最高為178.40 mg/L，這與該菌株的高發(fā)酵度有關；菌株A1、A2的發(fā)酵液的高級醇、揮發(fā)酯的含量均在風味閾值內，該發(fā)酵液風味較為協(xié)調；菌株A4的發(fā)酵液的乙酸乙酯含量較高為34.55 mg/L，給啤酒樣品帶來獨特的水果香氣；菌株L5為下面發(fā)酵酵母，整體風味物質的含量都較低，符合下面發(fā)酵風味單調、清爽的特征。

表3 不同酵母發(fā)酵液揮發(fā)性風味物質的含量Table 3 Contents of volatile flavor substances in different yeast fermentation broth

把這5種酵母的發(fā)酵液揮發(fā)性物質的檢測值，通過PLS-DA進行監(jiān)督多變量統(tǒng)計性主成分分析，以達到特定的標記化，結果見圖3。

圖3 不同酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性風味物質的PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA diagrams of volatile flavor compounds in different yeast fermentation broth

由圖3可知，不同菌株類型的啤酒發(fā)酵液樣品在偏最小二乘得分圖上被明顯區(qū)分開，上面發(fā)酵酵母發(fā)酵液的菌株A1、A2、A3、A4的樣品位置相近，集中在中間區(qū)域，而下面發(fā)酵的L5樣品則距離其他四個樣品較遠，可以看出上面發(fā)酵與下面發(fā)酵的樣品在揮發(fā)性風味物質上具有很大的差異性。

2.3 不同菌株發(fā)酵液的有機酸含量分析

啤酒中含有多種酸，約在100種以上，大部分有機酸都具有酸味，酸味與其他的風味成分協(xié)調配合，構成了啤酒的風味特征[24]。通過離子色譜定性、定量分析發(fā)酵液樣品的主要有機酸，測定結果見表4。

表4 不同酵母發(fā)酵液部分有機酸含量Table 4 Content of some organic acids in different yeast fermentation broth

由表4可知，菌株A1、A2、A3的發(fā)酵液中有機酸總量最高，均＞150 mg/L，菌株A4、A5的發(fā)酵液中有機酸含量較低，均在140 mg/L左右，上面發(fā)酵法中的有機酸含量一般比下面發(fā)酵法的高，并且成品啤酒中的總酸含量也偏高，這與前面分析得到的上面發(fā)酵法的pH更低一些的變化趨勢是一致的。在5株酵母的發(fā)酵液中，菌株A3的乙酸含量最高，有機酸含量最高，這與該菌株在高溫發(fā)酵時，有著較高的發(fā)酵度有著密切關系，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的有機酸類物質不斷地積累。菌株A1發(fā)酵液的丙酮酸含量偏高，其余3株酵母的發(fā)酵液的有機酸含量均在風味閾值內，適當比例的有機酸含量，能為啤酒找到平衡的口味體系。

2.4 不同菌株發(fā)酵液的發(fā)酵風味品評對比

啤酒風味評價通常采用感官品評和風味物質檢測相結合的分析方法，感官品評可以直觀地反映啤酒的整體風味特征，但是對啤酒品評師的要求較高、品評重復性較差、主觀性較強[25-27]。針對這一問題，電子舌目前在啤酒行業(yè)針對不同產地、不同風格的啤酒進行定性的分析已經(jīng)得到了很好的應用。利用電子舌對不同酵母發(fā)酵液樣品進行酒體滋味分析，包括酸味、苦味、澀味、咸味、后苦味、后澀味、鮮味、豐富度，利用電子舌放大差異，更加敏感地識別樣品間的差異。根據(jù)不同滋味信號傳感器的呈現(xiàn)的響應值，繪制滋味雷達圖見圖4。

由圖4可知，菌株L5發(fā)酵液的澀味比較強，但是整體滋味的豐富度不如其他幾株菌株發(fā)酵液，這也符合上面發(fā)酵法比下面發(fā)酵法風味更加豐富的特征。上面發(fā)酵的樣品中，菌株A3的發(fā)酵液酸味、后澀味最強，酒體整體的豐富度也最高；菌株A2的發(fā)酵液咸味、苦味、鮮味均較高，口感也較為豐富；菌株A1、A4的發(fā)酵液風味較為平均，風味較協(xié)調。

圖4 不同酵母發(fā)酵液風味品評結果雷達圖Fig.4 Radar chart of flavour evaluation results of different yeast fermentation broth

3 結論

本研究通過在實驗室啤酒模擬發(fā)酵體系下，對4株上面啤酒酵母菌株和1株下面發(fā)酵酵母所釀啤酒的酒精度、pH值、雙乙酰、真正濃度、真實發(fā)酵度、表觀發(fā)酵度等理化指標檢測，同時采用HS-SPME和IC對不同酵母菌株的發(fā)酵液香氣成分和有機酸含量進行表征，電子舌對發(fā)酵液作滋味評價。結果表明上面發(fā)酵啤酒酵母與下面發(fā)酵啤酒酵母對啤酒的化學和感官特性具有顯著性影響。4株不同的上面發(fā)酵啤酒類型酵母可以賦予精釀啤酒不同的風味特征，菌株A1發(fā)酵速度快、醇酯比協(xié)調；菌株A2發(fā)酵時間較短、降糖能力較強，風味協(xié)調，口味豐富獨特；菌株A3發(fā)酵度高達80.87%、高產乙酸乙酯和乙酸異戊酯的上面發(fā)酵啤酒酵母，可作為高濃發(fā)酵的優(yōu)勢菌株，具有開發(fā)新型風味獨特的精釀啤酒的潛力；菌株A4發(fā)酵能力弱于其他三株酵母，高級醇含量偏高。