羅愛國，郗鑫瑞，鄭同慶，楊兆艷，田艷花，馬曉麗，趙紅梅

（1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 晉中 030619；2.山西省堡子酒業(yè)有限公司，山西 晉中 030600；3.山西藥科職業(yè)學(xué)院 食品工程系，山西 太原 030031）

中國白酒釀造具有悠久歷史，山西主產(chǎn)清香型白酒，其白酒產(chǎn)業(yè)已成為山西省釀造業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。據(jù)釀造產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)報(bào)道，僅山西年產(chǎn)白酒近700萬t，按生產(chǎn)1 t的白酒產(chǎn)生3倍質(zhì)量的酒糟[3]，副產(chǎn)物酒糟達(dá)2 000萬t以上。酒糟中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、纖維素、鈣、磷、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[4]，其中粗蛋白17.15%、粗纖維素37.91%、淀粉12.35%[5-7]。過去利用酒糟主要作為動(dòng)物飼料輔料[8-10]，利用價(jià)值較低，隨著節(jié)約型、生態(tài)型經(jīng)濟(jì)發(fā)展，副產(chǎn)物酒糟高值化利用已迫在眉睫[11-12]。

目前，國內(nèi)外對(duì)酒糟的研究多集中在探討酒糟生產(chǎn)蛋白飼料的微生物發(fā)酵工藝方面[13-16]，如白酒酒糟培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的組成及配比研究、發(fā)酵菌種及菌種組合篩選研究等，而對(duì)白酒酒糟本身的微生物菌群結(jié)構(gòu)分析研究甚少。Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析微生物多樣性具有速度快、通量高、更具全面性的優(yōu)勢[17-20]，已被廣泛應(yīng)用于土壤、水體及食品等微生物菌群多樣性研究[21-22]。黎江華等[23]采用高通量測序技術(shù)分析五倍子發(fā)酵用酒曲與酒糟微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒酒糟中共檢測出56個(gè)細(xì)菌屬和28個(gè)真菌屬；袁帥[24]以醬香型白酒酒糟為研究對(duì)象，檢測出酒糟樣本中細(xì)菌主要分屬11個(gè)門。但是目前針對(duì)清香型白酒酒糟中微生物菌群結(jié)構(gòu)解析的研究鮮見報(bào)道。

因此，本研究通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)清香型白酒酒糟中微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以期為后續(xù)建立清香型白酒酒糟的微生物體系指標(biāo)以及進(jìn)一步優(yōu)化其生產(chǎn)蛋白飼料等奠定基礎(chǔ)，為目前廣泛應(yīng)用于白酒酒糟轉(zhuǎn)化利用方面的微生物發(fā)酵技術(shù)提供理論和技術(shù)依據(jù)，為深入了解清香型白酒發(fā)酵過程中的微生物菌群結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)清香型白酒產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型堡子酒酒糟：山西堡子酒業(yè)有限公司；Qubit3.0脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）檢測試劑盒：美國Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit：美國OMEGA公司聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）MasterMix、HieffNGSTMDNASelectionBeads：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ETC 811 PCR儀：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；熒光計(jì)：美國英杰生命技術(shù)有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)：上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

取清香型堡子酒酒糟堆（堆積2～3 d）上部、中部、下部新鮮酒糟并混合，參考沈才萍等[25]的方法用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）對(duì)酒糟樣品進(jìn)行預(yù)處理。

1.3.2 基因組DNA提取

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取酒糟中微生物的基因組DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

以基因組DNA為模板，采用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）/805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）和ITS1F（5'CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)和真菌ITS1-ITS2區(qū)基因序列進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增[26]。

1.3.4 Illumina MiSeq高通量測序

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫，使用Qubit 3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.5 Illumina MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)處理

高通量測序得到的原始序列是雙端序列數(shù)據(jù)，且序列中含有起始加入的引物和接頭序列以及barcode標(biāo)簽序列。使用cutadapt軟件、PEAR軟件、PRINSEQ軟件等處理數(shù)據(jù)。首先需要對(duì)引物的接頭序列進(jìn)行去除，然后根據(jù)雙端序列之間的相互重復(fù)關(guān)系，將所有成對(duì)的單個(gè)序列拼接成一條序列，再根據(jù)barcode標(biāo)簽序列區(qū)分酒糟樣品中真菌及細(xì)菌的各序列數(shù)據(jù)，之后對(duì)各序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，最后得到各序列的有效數(shù)據(jù)。

1.3.6 Illumina MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Usearch軟件對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，并對(duì)應(yīng)相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)分析。對(duì)聚類分析結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析，使用R軟件繪制清香型堡子酒酒糟中微生物的稀釋性曲線、Rank abundance曲線、香農(nóng)指數(shù)曲線等。

2 結(jié)果與分析

2.1 Illumina Miseq高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與質(zhì)量分析

采用Illumina Miseq高通量測序平臺(tái)得到的清香型堡子酒酒糟樣本原始序列與其堿基長度見表1。

表1 酒糟樣本的高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistics results of high-throughput sequence data of distiller's grains samples

由表1可知，清香型堡子酒酒糟樣品中得到的細(xì)菌原始序列數(shù)為58 470條，平均序列堿基長度為453.97 bp；經(jīng)拼接、質(zhì)控過濾后，細(xì)菌有效序列數(shù)為58 015條，平均序列堿基長度為417.38 bp。酒糟樣品中得到的真菌原始序列數(shù)為36 502條，平均序列堿基長度為327.13 bp；經(jīng)拼接、質(zhì)控過濾后，真菌有效序列數(shù)為36 459條，平均序列堿基長度為284.83 bp。細(xì)菌與真菌的有效序列占比均達(dá)到99%以上，這表明本次高通量測序得到的有效序列可以滿足后續(xù)對(duì)清香型堡子酒酒糟樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究。

隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，與他們所代表的物種數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 酒糟樣品中細(xì)菌菌群（a）及真菌菌群（b）的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria flora (a) and fungi flora (b) in distiller's grains samples

由圖1 可知，當(dāng)測序序列數(shù)＞20 000時(shí)，曲線趨向平坦，說明即使增加測序數(shù)據(jù)，OTU數(shù)也不會(huì)再增加，說明本次的測序量合理，能夠覆蓋酒糟樣本中的絕大部分物種，數(shù)據(jù)量合理且足夠。

Rank-abundance曲線是分析多樣性的一種方式，用于反應(yīng)樣品多樣性的兩個(gè)方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度[27]。酒糟樣品中細(xì)菌菌群及真菌菌群的Rankabundance曲線見圖2。由圖2可知，酒糟樣品中細(xì)菌和真菌菌群的豐富程度和均勻程度存在差異，其中細(xì)菌菌群的Rank-abundance曲線相對(duì)于真菌菌群較平緩，水平跨度較大，所以細(xì)菌菌群的物種組成較豐富，均勻程度較高；真菌菌群的Rank-abundance曲線陡峭，水平跨度小，微生物豐度較低，某一類或幾類微生物占了大部分比例，具有數(shù)量優(yōu)勢。

圖2 酒糟樣品中細(xì)菌（a）及真菌（b）的Rank-abundance曲線Fig.2 Rank-abundance curves of bacteria (a) and fungi (b) in distiller's grains samples

2.2 酒糟樣品微生物菌群的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性[24]，酒糟樣品微生物菌群的α多樣性分析結(jié)果見表2。由表2可知，細(xì)菌菌群的超1（Chao1）指數(shù)、Ace指數(shù)均大于真菌菌群，說明酒糟樣本內(nèi)，細(xì)菌菌群的物種豐富度遠(yuǎn)高于真菌菌群[28]。酒糟樣品中細(xì)菌菌群的香農(nóng)（Shannon）指數(shù)略大于真菌菌群，而細(xì)菌菌群的辛普森（Simpson）指數(shù)小于真菌菌群，從而表明清香型堡子酒酒糟中的細(xì)菌菌群多樣性略大于真菌菌群多樣性。另外，兩者的Coverage指數(shù)都接近1，說明對(duì)清香型堡子酒酒糟樣品文庫的覆蓋率很高[29]，進(jìn)一步表明本實(shí)驗(yàn)測序結(jié)果能很真實(shí)有效地反映清香型堡子酒酒糟的微生物多樣性，本研究有一定研究意義和研究價(jià)值。

表2 酒糟樣品中微生物群落的α-多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of microbial community in distiller's grains samples

2.3 酒糟樣品OTU物種統(tǒng)計(jì)

對(duì)酒糟樣品微生物在各分類水平上的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。由表3可知，清香型堡子酒酒糟樣品中的細(xì)菌菌群分布在10個(gè)門、18個(gè)綱、31個(gè)目、66個(gè)科、86個(gè)屬、124種上；真菌菌群分布在5個(gè)門、11個(gè)綱、20個(gè)目、33個(gè)科、49個(gè)屬、66個(gè)種上。細(xì)菌菌群在各分類水平的數(shù)量分布均高于真菌菌群，進(jìn)一步說明清香型堡子酒酒糟中細(xì)菌菌群的多樣性高于真菌菌群。另外，未測出酒糟樣品中細(xì)菌菌群在種水平上的分類，分析原因可能是因?yàn)?6S rDNA有很高的保守性，對(duì)親緣關(guān)系較近的物種種屬不容易分辨[30]。

表3 酒糟樣品中微生物在各分類水平上的菌群結(jié)構(gòu)Table 3 Community structure of microbe in distiller's grains at different classification levels

2.4 酒糟樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 基于門水平酒糟樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平清香型堡子酒酒糟樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖3。由圖3可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有4個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌門（相對(duì)豐度≥1%），分別為變形菌門（Proteobacteria）（66.51%）、放線菌門（Actinobacteria）（26.21%）、厚壁菌門（Firmicutes）（4.40%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.67%）。

圖3 基于門水平酒糟樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Bacterial community structure analysis results of distiller's grain samples based on phylum level

2.4.2 基于門水平酒糟樣品中真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平清香型堡子酒酒糟樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)見圖4。由圖4可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有3個(gè)優(yōu)勢真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）（85.04%）、毛霉門（Mucoromycota）（11.45%）及擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（2.77%），其中子囊菌門（Ascomycota）具有絕對(duì)優(yōu)勢。

圖4 基于門水平酒糟樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.4 Fungal community structure analysis results of distiller's grain samples based on phylum level

綜上，在門水平上，清香型堡子酒酒糟中細(xì)菌菌群較真菌菌群更為豐富，細(xì)菌群落中各菌門的相對(duì)豐度差異較小，真菌群落中相對(duì)豐度差異較大，主要集中在子囊菌門內(nèi)。

2.4.3 基于屬水平酒糟樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平清香型堡子酒酒糟樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖5。由圖5可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有12個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬，分別為根瘤菌屬（Rhizobium）（20.43%）、拉烏爾菌屬（Raoultella）（18.96%）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）（15.00%）、紅球菌屬（Rhodococcus）（9.07%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）（4.42%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（2.52%）、假單孢菌屬（Pseudomonas）（2.44%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（1.58%）、Devosia（1.57%）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）（1.19%）、未分類-鼠桿菌屬（unclassified-Murib-aculaceae）（1.15%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.14%）。

圖5 基于屬水平酒糟樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.5 Bacterial community structure analysis results of distiller's grain samples based on genera level

2.4.4 基于屬水平酒糟樣品中真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平清香型堡子酒酒糟樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)見圖6。由圖6可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有6個(gè)優(yōu)勢真菌屬，分別為孢圓酵母屬（Torulaspora）（62.59%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（12.79%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（7.08%）、根霉屬（Rhizopus）（4.29%）、曲霉屬（Aspergillus）（4.06%）、酵母屬（Saccharomyces）（3.78%）。

圖6 基于屬水平酒糟樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.6 Fungal community structure analysis results of distiller's grain samples based on genera level

黎江華等[23]對(duì)濃香型酒糟微生物多樣性進(jìn)行了研究，檢測出濃香型白酒糟菌群優(yōu)勢菌屬主要包括魏斯氏菌屬（Weissella）（11%）、未定義藍(lán)細(xì)菌（unidentifiedCyanobacteria）（8%）等17個(gè)，而優(yōu)勢真菌屬主要包括絲孢酵母屬（Trichosporon）（34%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（9%）等11個(gè)，與本文中檢測的細(xì)菌屬、真菌屬在豐度以及屬別上有較大差異，這可能與兩種酒型在發(fā)酵用曲、釀造工藝等不同有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)清香型堡子酒酒糟微生物菌群多樣性進(jìn)行分析，得出酒糟中的細(xì)菌豐富度和多樣性均高于真菌，細(xì)菌菌群歸屬于10個(gè)門、18個(gè)綱、31個(gè)目、66個(gè)科、86個(gè)屬、124個(gè)種，真菌菌群歸屬于5個(gè)門、11個(gè)綱、20個(gè)目、33個(gè)科、49個(gè)屬、66個(gè)種。優(yōu)勢細(xì)菌門（相對(duì)豐度≥1.0%）為變形菌門（Proteobacteria）（66.51%）、放線菌門（Actinobacteria）（26.21%）、厚壁菌門（Firmicutes）（4.40%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.67%），優(yōu)勢細(xì)菌屬為根瘤菌屬（Rhizobium）（20.43%）、拉烏爾菌屬（Raoultella）（18.96%）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）（15.00%）、紅球菌屬（Rhodococcus）（9.07%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）（4.42%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（2.52%）、假單孢菌屬（Pseudomonas）（2.44%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（1.58%）、Devosia（1.57%）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）（1.19%）、未分類-鼠桿菌屬（unclassified-Muribaculaceae）（1.15%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.14%）；優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（85.04%）、毛霉門（Mucoromycota）（11.45%）及擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（2.77%），優(yōu)勢真菌屬為孢圓酵母屬（Torulaspora）（62.59%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（12.79%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（7.08%）、根霉屬（Rhizopus）（4.29%）、曲霉屬（Aspergillus）（4.06%）、酵母屬（Saccharomyces）（3.78%）。本研究為繼續(xù)深入研究酒糟的發(fā)酵轉(zhuǎn)化肥料及為動(dòng)物飼料開發(fā)等提供了理論參考，同時(shí)，也為白酒釀造過程中菌群結(jié)構(gòu)變化規(guī)律解析提供了理論依據(jù)。