孫百虎

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

桑葚（Morus albaL.）又名桑果、桑葚子、桑棗，為桑科落葉喬木桑樹的成熟果實，廣泛種植于亞洲、歐洲、北美洲等區(qū)域[1]。桑葚在傳統(tǒng)中醫(yī)藥行業(yè)發(fā)揮著極其重要的作用，常被用于發(fā)燒、咳嗽、哮喘、高血壓等疾病的治療及預(yù)防[2]。桑葚果實艷麗，果肉酸甜可口且含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是鮮食果類中的佳品。桑葚富含功能活性物質(zhì)，其中花青素類，酚酸類及黃酮類物質(zhì)含量豐富。相關(guān)研究表明，桑葚提取物具有較強的抗氧化能力，并且能夠顯著抑制癌細(xì)胞生長，具有一定的抗癌功效[3]。經(jīng)常食用桑葚能夠改善機體免疫，降低血壓血脂，具有良好的保健功效[2]。

乳酸發(fā)酵是已知的維持和提高水果營養(yǎng)品質(zhì)的最古老、經(jīng)濟、安全的生物技術(shù)方法[4]，諸多研究證明，果蔬經(jīng)乳酸發(fā)酵后其營養(yǎng)品質(zhì)大大改善，并且具有良好的風(fēng)味[5]。相關(guān)文獻(xiàn)表明乳酸菌產(chǎn)品能夠降低血清膽固醇水平，改善腸胃功能，增強免疫系統(tǒng)[6]。蘇能能等[7]利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵桑葚汁，結(jié)果表明經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后桑葚汁抑菌活性明顯提高；杜延兵等[8]將桑葚汁與牛奶復(fù)配后進(jìn)行乳酸發(fā)酵，提高了桑葚汁營養(yǎng)風(fēng)味，得到一種風(fēng)味獨特的營養(yǎng)產(chǎn)品。此外相關(guān)研究也報道了利用嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌發(fā)酵桑葚汁促進(jìn)了其花青素的轉(zhuǎn)化，大大提高了酚酸類物質(zhì)的含量[9]。

基于其豐富的活性成分含量，世界各國將其作為保健功能食品進(jìn)行加工銷售，桑葚采摘后貯藏期較短，食品加工行業(yè)經(jīng)常將其干制或?qū)⑵湔ブl(fā)酵以提高其附加值，延長其貯藏期。雖然果蔬發(fā)酵相關(guān)研究較多，但不同菌種對桑葚汁的理化性質(zhì)、營養(yǎng)成分含量及抗氧化能力的影響研究較少。四種乳酸菌：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（ST）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）（LB）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、干酪乳桿菌（Lacbobacillus casei）（LC）常用于果蔬的乳酸發(fā)酵，因此本試驗選用此四種不同乳酸菌菌種發(fā)酵桑葚汁，探究其活菌數(shù)、總糖及還原糖及酚類物質(zhì)含量及變化，并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法及鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）比較其抗氧化能力。為更好的選擇優(yōu)良發(fā)酵菌種，提高桑葚加工潛力提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（ST）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）（LB）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、干酪乳桿菌（Lacbobacillus casei）（LC）：中國工業(yè)微生物種保藏中心。

桑葚（品種為臺灣72C002）：2021年2月采自廣東河源市桑葚采摘園，果實采摘完畢后迅速帶回實驗室利用榨汁機榨汁，果汁過濾后備用。

1.1.2 試劑

福林酚、磷酸氫二鉀、甲醇、碳酸鈉、三氯化鋁、磷酸二氫鉀、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、對香豆酸、蘆丁、槲皮素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷（cyanidin-3-rutinoside，C3R）、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水溶性維生素E（Trolox）（均為色譜純）：上海源葉股份科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：10.0%蛋白胨，8.0%牛肉粉，4.0%酵母粉，20.0%葡萄糖，2.0%磷酸氫二鉀，2.0%檸檬酸氫二銨，5.0%乙酸鈉，0.2%硫酸鎂，0.04%硫酸錳，1.0%吐溫80。120 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-WBL2531H榨汁機：美的集團(tuán)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-S6雙列六孔型電熱水浴鍋：北京科偉有限公司；1525型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Waters公司；UV-mini1240型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；CM-600D色差計：美國亨特利公司；SB-500DTY型超聲波掃頻清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種接種及發(fā)酵

將ST、LB、LP、LC四種菌種置于滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行活化復(fù)壯（37 ℃條件下培養(yǎng)36 h），37 ℃靜置12 h后，以0.5%的比例接種于桑葚汁中于37 ℃下靜置發(fā)酵36 h。

1.3.2 活菌數(shù)測定

發(fā)酵過程桑葚汁中活菌數(shù)測定參考ROBERTS D等[10]的方法：取1 mL發(fā)酵液使用生理鹽水稀釋至108～1014倍，取0.1 mL稀釋液接種至MRS培養(yǎng)基中，并在37 ℃下培養(yǎng)36 h[10]，記錄菌落數(shù)為lg（CFU/mL）。

1.3.3 總糖、還原糖含量的測定

利用3,5-二硝基水楊酸法和苯酚-硫酸法分別對桑葚汁中總糖、還原糖含量進(jìn)行測定。

1.3.4 總酚、總黃酮、總花青素含量測定

利用福林酚比色法測定桑葚汁中的總酚含量[11]：125 μL不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～600.0 μg/mL）或桑葚汁加入125 μL福林酚試劑靜置6 min后加入1.25 mL 7%碳酸鈉溶液，后加入3.5 mL蒸餾水，混合溶液在室溫下靜置90 min后利用紫外分光光度計于波長760 nm條件下測量溶液吸光度值。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=2.494 0x+0.022 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算發(fā)酵桑葚汁中總酚含量，結(jié)果表示為mg沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）/mL。

桑葚汁中總黃酮類物質(zhì)的測定參考劉丙花等[12]方法：取2 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L和60 mg/L）或桑葚汁加入0.75 mL 5%硝酸鈉溶液混合5 min后添加0.5 mL 10%硝酸鋁溶液?；靹蜢o置6 min后，加入4 mL 5%氫氧化鈉，混合后將溶液定容至25 mL，利用紫外分光光度計在波長510nm處測量吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=2.328 8x-0.025 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算發(fā)酵桑葚汁中總黃酮含量，結(jié)果表示為mg 蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent，RE）/g（以干基計）。

桑葚汁中總花青素含量的測定采用pH示差法在波長510 nm和700 nm處使用紫外-可見分光光度計測定發(fā)酵桑葚汁中花色苷含量，結(jié)果表示為mg C3G/mL。花色苷含量計算公式如下：

式中：TAC為花青素含量，mg C3G/mL；A為吸光度值；MW是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷分子量（449.2 g/mol）；DF為稀釋因子；ε是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸收率（ε=26 900）。

1.3.5 單體酚類物質(zhì)含量的測定

桑葚汁中單體酚類物質(zhì)的測定采用HPLC法[13]。使用C18色譜柱（4.6 mm×150 mm），檢測溫度28 ℃，流動相：1%甲酸（A相），乙腈（B相）；洗脫程序：0～5 min（5%B），5～25 min（12%B），25～40 min（30%B），40～50 min（45%B），50～60 min（5%B）。酚酸類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)，花青素類物質(zhì)分別在波長260 nm、320 nm及520 nm處測定。使用外標(biāo)法通過與保留時間進(jìn)行對比對酚類物質(zhì)進(jìn)行定性分析，通過峰面積與含量關(guān)系進(jìn)行定量分析。

1.3.6 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力的測定參考LI T L等[14]的方法：將1 mL樣品加入2 mL DPPH甲醇溶液（45 mg/L），后避光反應(yīng)30 min。用紫外-可見分光光度計在波長517 nm處測量吸光度值。結(jié)果以DPPH自由基抑制率（%）表示，其計算公式如下：

式中：Ac為2 mL無水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度值；Ai為2 mL桑汁待測液加2 mL DPPH溶液的吸光度值；Aj為2 mL桑汁待測液加2 mL無水乙醇的吸光度值。

鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測定參考GAO Q H等[15]的方法：將1 mL桑葚汁或抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL、30μg/mL）與2mL0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）混合后加入及2 mL 1%鐵氰化鉀溶液。將混合物50 ℃水浴20 min，然后添加2 mL 10%三氯乙酸。將2 mL反應(yīng)溶液與2 mL混合蒸餾水和0.4 mL0.1%氯化鐵溶液混合。使混合物在黑暗中反應(yīng)30 min，并通過紫外-可見分光光度計在波長700 nm處讀取吸光度值。以抗壞血酸溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制抗壞血酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.418 9x+0.03，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算鐵離子還原能力。FRAP結(jié)果表示為mg抗壞血酸當(dāng)量（ascorbic acid equivalent，AAE）/mL。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以3個獨立實驗的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用鄧肯氏檢驗分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所得數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性采用標(biāo)準(zhǔn)皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌活菌數(shù)在桑葚汁發(fā)酵過程中的變化

益生菌的生長及其活力對于發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性至關(guān)重要，不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁發(fā)酵過程活菌數(shù)的變化見圖1。由圖1可知，四種乳酸菌皆在12 h內(nèi)快速生長，其生長速率最快，隨后其生長速率放緩，四種乳酸菌發(fā)酵完畢后，其中接種菌株LP桑葚汁中活菌數(shù)最高，達(dá)到了12.5 lg（CFU/mL），其次是接種菌株LC的桑葚汁（活菌數(shù)為12.2 lg（CFU/mL）），接種ST的桑葚汁中活菌數(shù)最少為11.5 lg（CFU/mL）。結(jié)果表明，菌株LP能夠更好的利用桑葚汁中的各類營養(yǎng)物質(zhì)，該結(jié)果與李依娜等[16]的結(jié)論一致。

圖1 桑葚汁發(fā)酵過程中不同乳酸菌活菌數(shù)的變化Fig.1 Changes of viable counts of different lactic acid bacteria during mulberry juice fermentation

2.2 總糖及還原糖含量變化

微生物在發(fā)酵過程中消耗糖類物質(zhì)用于自身代謝活動。不同菌種發(fā)酵桑葚汁中總糖及還原糖含量見圖2。

圖2 桑葚汁發(fā)酵過程中還原糖（a）及總糖（b）含量的變化Fig.2 Changes of reducing sugar (a) and total sugar (b) contents during mulberry juice fermentation

由圖2可知，未發(fā)酵桑葚汁中含有最高的總糖及還原糖含量，總糖含量為180.4 mg/L，還原糖含量為110.4 mg/L。桑葚汁經(jīng)不同菌種發(fā)酵后其總糖與還原糖含量皆呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），與其他三種菌株相比，菌株LP對桑葚汁中總糖及還原糖的影響最大，發(fā)酵結(jié)束后其總糖含量降低了28.9%，還原糖含量降低了27.3%。這表明菌株LP相較于其他菌株可以消耗更多的糖類物質(zhì)，發(fā)酵過程中糖類物質(zhì)的減少與其轉(zhuǎn)化為乳酸及植物乳桿菌的新陳代謝、增長生殖有關(guān)[17]。這也解釋了為何接種菌株LP的桑葚汁中活菌數(shù)更高。

2.3 總酚、總黃酮及總花青素含量變化

眾多研究表明桑葚中富含酚酸、黃酮及花青素類物質(zhì)[18]。不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁發(fā)酵過程中總酚，總黃酮及總花青素含量見圖3。由圖3可知，不同乳酸菌發(fā)酵結(jié)束后總酚含量皆有顯著性提高（P＜0.05），特別是菌株LP發(fā)酵桑葚汁中檢測到最高的總酚含量為9.3 mg/mL，其次是菌株LC與LB，菌株ST發(fā)酵桑葚汁中總酚含量最低為7.4 mg/mL。主要原因是乳酸菌菌株可以釋放水解酶類將復(fù)雜的結(jié)合酚類物質(zhì)水解為單體酚類物質(zhì)[19]。不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁中總黃酮含量隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，不同乳酸菌皆在發(fā)酵24 h桑葚汁中具有最高的總黃酮含量，可能的原因是發(fā)酵初期結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)在水解酶的作用下溶出，導(dǎo)致游離黃酮類含量提高，后期隨著花青素類物質(zhì)的逐步降解而產(chǎn)生含量下降趨勢[14]，發(fā)酵結(jié)束后（36 h），菌株LP發(fā)酵桑葚汁中總黃酮含量為4.5 mg/mL，其次是菌株ST與LC，菌株LB發(fā)酵桑葚汁中的總黃酮含量最低。與LI T L等[14]研究結(jié)果一致，主要原因為乳酸菌菌株釋放酚類物質(zhì)氧化酶解聚高分子酚類物質(zhì)。近年來越來越多的研究表明攝入桑葚中的花青素可以有效減少心血管疾病、2型糖尿病及神經(jīng)功能下降等諸多疾病的發(fā)病率[18]。由圖3可知，不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁中總花青素含量隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)下降趨勢，主要原因為乳酸菌發(fā)酵過程產(chǎn)生的酶類，促進(jìn)了花青素類物質(zhì)的解聚[18]。發(fā)酵結(jié)束時（36 h），不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁中總花青素含量差異較大，其含量范圍為1.5～1.88 mg/mL，菌株LP發(fā)酵桑葚汁中總花青素含量為1.5 mg/mL；菌株LB與LC發(fā)酵桑葚汁中總花青素含量相同為1.88 mg/mL；菌株ST發(fā)酵桑葚汁中總花青素含量為1.7 mg/mL。結(jié)果表明，菌株LP能釋放更多的水解酶類物質(zhì)。

圖3 桑葚汁發(fā)酵過程中總酚（a），總黃酮（b）及總花青素（c）含量變化Fig.3 Changes of total phenols (a),total flavonoids (b) and total anthocyanins (c) contents during mulberry juice fermentation

2.4 單體酚類物質(zhì)含量變化

酚類物質(zhì)是桑葚中重要的具有極強抗氧化活性的一類次級代謝產(chǎn)物。以未發(fā)酵桑葚汁作為對照，不同乳酸菌發(fā)酵前后桑葚汁中酚類物質(zhì)含量見表1。

表1 不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁酚類物質(zhì)發(fā)酵前后含量變化Table 1 Changes of phenolics contents in mulberry juice before and after fermentation by different lactic acid bacteria

由表1可知，共檢測出10種單體酚類物質(zhì)，包括6種酚酸類物質(zhì)，2種黃酮類物質(zhì)，2種花青素類物質(zhì)?；ㄇ嗨仡愇镔|(zhì)是桑葚中重要的酚類物質(zhì)，相關(guān)研究表明，桑葚中具有較高的C3G，并且C3G是桑葚中最主要的花青素類物質(zhì)[18]，這也與本研究結(jié)果一致，未發(fā)酵桑葚汁中C3G的含量為286.03 mg/L。此外花青素類物質(zhì)在經(jīng)不同菌種發(fā)酵后其含量明顯下降（下降了18.3%～30.0%），這也與LI Z X等[23]研究結(jié)果一致。

綠原酸及咖啡酸含量在桑葚汁中含量較高，是最主要的酚酸類物質(zhì)，在未經(jīng)發(fā)酵的桑葚汁中其含量分別為148.05 mg/L、110.07 mg/L。桑葚汁經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后其綠原酸及咖啡酸含量有所提高，主要原因為乳酸菌釋放的水解酶類水解轉(zhuǎn)化復(fù)雜高分子酚類物質(zhì)，如花青素等物質(zhì)，生成了綠原酸及咖啡酸，促進(jìn)了酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[20-21]，結(jié)果也與C3G與C3R含量在發(fā)酵過程中含量下降對應(yīng)。桑葚汁在經(jīng)菌株LP發(fā)酵后其綠原酸的含量最高，達(dá)到了201.6 mg/L。較未發(fā)酵前提高了36.2%。菌株ST發(fā)酵桑葚汁的綠原酸含量最低為152.50 mg/L，菌株LB發(fā)酵后桑葚汁的咖啡酸含量最低為120.60 mg/L。益生菌發(fā)酵促進(jìn)了桑葚汁中花青素類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，并且產(chǎn)生綠原酸及咖啡酸，使其在桑葚汁中的含量明顯升高。

此外，未發(fā)酵桑葚汁還檢測出了較高含量的對羥基苯甲酸，并且經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后其含量無顯著性差異（P＜0.05）。槲皮素是桑葚汁中最主要的黃酮類物質(zhì)其含量達(dá)到了86.88 mg/L，這也與KWAW E等[22]研究結(jié)果一致。經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后槲皮素含量均存在明顯上升趨勢。槲皮素在經(jīng)菌株LP發(fā)酵后桑葚汁中其含量最高（121.30 mg/L），較未發(fā)酵對照組升高了39.6%。

2.5 抗氧化能力

桑葚果汁中高含量的活性物質(zhì)如酚類物質(zhì)等能夠清除自由基及阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而到達(dá)抗氧化的效果[24]。以未發(fā)酵桑葚汁作為對照，不同乳酸菌發(fā)酵前后桑葚汁DPPH自由基清除能力與FRAP見圖4。由圖4可知，未經(jīng)發(fā)酵桑葚汁的DPPH自由基清除率與FRAP最低，分別為65.3%及25.3 mg AAE/mL。桑葚汁經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后其DPPH自由基清除能力與FRAP皆呈現(xiàn)顯著升高趨勢，此外，酚類化合物自由形式的增加以及乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的其他副產(chǎn)品可能是提高抗氧化能力的原因[11，25]，其中經(jīng)菌株LP發(fā)酵的桑葚汁其DPPH自由基清除能力與FRAP最高，分別為80.5%、38.5 mg AAE/mL。這是由于菌株LP發(fā)酵桑葚汁能夠產(chǎn)生更高含量的游離酚類物質(zhì)，使其具有更高的抗氧化能力。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁前后DPPH自由基清除率與FRAP值的變化Fig.4 Changes of DPPH radical scavenging rate and FRAP value of mulberry juice before and after fermentation by different lactic acid bacteria

3 結(jié)論

本研究比較了干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌發(fā)酵對桑葚汁糖類（總糖及還原糖）、酚類物質(zhì)含量及抗氧化能力的影響。結(jié)果表明，不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁發(fā)酵結(jié)束其活菌數(shù)存在較大差異，植物乳桿菌發(fā)酵桑葚汁中活菌數(shù)最高達(dá)到了12.5 lg（CFU/mL），經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后桑葚汁中總糖及還原糖含量有所下降，總酚、總黃酮含量顯著提高，并且植物乳桿菌發(fā)酵桑葚汁中總酚、總黃酮含量最高（總酚含量為9.3 mg/mL，總黃酮含量為4.5 mg/mL），此外乳酸菌發(fā)酵促進(jìn)了花青素類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。對發(fā)酵前后桑葚汁中10種酚類物質(zhì)檢測結(jié)果得知桑葚汁經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后其綠原酸及咖啡酸含量有所提高，C3G含量有所下降。植物乳桿菌發(fā)酵桑葚汁的DPPH自由基清除能力最強為65.3%，F(xiàn)RAP鐵離子還原力最強為25.3 mg AAE/mL。綜上，植物乳桿菌發(fā)酵性能最佳，發(fā)酵桑葚汁后總酚及總黃酮含量最高，抗氧化能力最強，可作為桑葚汁乳酸發(fā)酵的最佳菌種。