何曉穎，李佳根，余 林，楊 陽，周東平，翁旭東

(1.舟山技師學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；3.浙江魚老大農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江衢州 324400)

鱈魚屬真骨魚綱(Division Teleostei)、鱈形目(Gadiformes)冷水性魚類，廣泛分布于世界的各大洋，是當(dāng)前世界級重要經(jīng)濟魚類，也是我國大宗進(jìn)口水產(chǎn)品。但受經(jīng)濟利益驅(qū)使，近年來鱈魚原料及產(chǎn)品摻假事件屢有發(fā)生，加工水產(chǎn)品中魚類物種平均摻假率高達(dá)30%[1-2]。因此，尋找一種便捷、快速的鱈魚鑒定方法成為維護(hù)消費者合法權(quán)益的重要手段。

基于DNA的鑒定技術(shù)具有檢測快、目標(biāo)特異性強等優(yōu)點，廣泛用于豬肉、牛肉等大宗畜產(chǎn)品真?zhèn)舞b定[3]。DNA技術(shù)鑒定是基于高質(zhì)量DNA的提取，對食品而言，由于加工過程中存在高溫、低溫等極端條件，加上大量油、鹽、淀粉等輔料的加入，使得目標(biāo)DNA的提取變得困難，導(dǎo)致后續(xù)PCR擴增難度增加[4]。因而，尋找高質(zhì)量的DNA提取方法成為鱈魚準(zhǔn)確鑒定的關(guān)鍵。基于DNA提取方法目前尚存在提取效率較低、完整率較差的問題。筆者以鱈魚及其制品為原料，探討了不同DNA的提取效果，利用16S rRNA引物對提取DNA進(jìn)行PCR擴增，并評價不同提取方法的優(yōu)劣，尋找鱈魚DNA的高效提取手段，以期為鱈魚的高效鑒定提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1鱈魚材料。2021年7—8月從市場及網(wǎng)絡(luò)購物平臺采購14份樣品，包括7份標(biāo)注原料為“大西洋鱈魚”的肉松樣品和罐頭樣品，編號1～14。所有樣品均為常溫保藏，抵達(dá)實驗室后立刻置于-18 ℃冷藏備用。

1.1.2試驗試劑。DNA提取試劑盒(Tiangen、Takara)，購于貝克曼庫爾特公司；瓊脂糖凝膠、核酸染料，購于國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；PCR引物合成，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；2×PCR Master Mix(含Taq酶，buffer，dNTP)，上海聯(lián)邁生物工程有限公司；100 bp DNA Ladder，上海研卉生物科技有限公司；蛋白酶K，購于北京索萊寶生物科技有限公司；其余均為實驗室常用試劑，分析純。

1.1.3試驗設(shè)備。核酸蛋白測定儀(SpectroArt200/200S)，北京好億科技發(fā)展有限公司；電泳槽(JY-SPFT)，北京六一公司；凝膠成像儀(ZF-288)，聚創(chuàng)環(huán)保集團；超純水機(LD-WFUP)，上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司；PCR儀(LightCycler?96)，瑞士羅氏集團；恒溫混勻儀(STC600)，上海十硯儀器設(shè)備有限公司；其余均為實驗室常用設(shè)備。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA提取。

1.2.1.1十二烷基磺酸鈉(SDS)提取。參考許文杰等[5]的方法，并略作改動。具體為精確稱取樣品約100 mg于2 mL離心管中，加入100 μL SDS緩沖液(2% SDS、0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L EDTA、0.5 mol/L Tris)、100 μL磷酸緩沖液(0.2 mol/L磷酸二氫鈉、pH=8.0)、20 μL蛋白酶K(20 mg/μL)，混合后置于恒溫混勻儀中(55 ℃、50 min)，混勻結(jié)束后離心5 min(14 000 r/min)，離心結(jié)束后取上清液，再加入1倍體積的乙酸鈉溶液(4 mol/L，pH 8.0)，按前述參數(shù)重復(fù)離心1次；離心結(jié)束后取上清液至新離心管中，加入1倍體積異丙醇，振蕩混勻后靜置10 min后離心10 min(14 000 r/min)，取沉淀用無水乙醇洗滌后，60 ℃烘干后再加入超純水后于-18 ℃保藏。

1.2.1.2試劑盒提取。按2種試劑盒(Tiangen、Takara)說明書操作。

1.2.2DNA濃度測定。利用核酸蛋白測定儀測定DNA在不同波長(230、260和280 nm)的吸光度，并計算A260/A280、A260/A230，DNA濃度也一并測定。

1.2.3PCR擴增。

1.2.3.1普通PCR擴增。對3種方法提取得到的DNA進(jìn)行擴增，為科學(xué)衡量擴增效果，先對DNA進(jìn)行稀釋，使樣品濃度相同(40 ng/μL)。PCR擴增具體操作如下：量取12.5 μL 2×PCR Master Mix，添加上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，后用無菌超純水補至總體積25 μL。PCR擴增待反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行，并用瓊脂糖凝膠電泳測定擴增結(jié)果[6]。PCR引物參照表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物Table 1 Primer sequence and amplification products

1.2.3.2熒光PCR測定。調(diào)整提取的DNA濃度為40 ng/μL。鱈魚肉松產(chǎn)品擴增采用327 bp。熒光PCR同樣采用普通PCR擴增方法[7]。每個循環(huán)結(jié)束后檢測熒光強度。擴增結(jié)束后分析溶解曲線，具體溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為72 ℃(起始溫度)—95 ℃—65 ℃(1 min)—97 ℃。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)判定和區(qū)分物種。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計DNA得率等數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對DNA得率的影響從采用Tiangen試劑盒和SDS法提取的DNA得率(表2)可以看出，2種方法的得率差別很大，Tiangen得率顯著高于SDS法，這可能與SDS法提取DNA時前處理過程中涉及蛋白酶K的參與有關(guān)。有研究表明，在DNA提取時，使用蛋白酶K及其他有機試劑會造成提取率的顯著降低[8-9]；而Tiangen試劑盒不涉及蛋白酶K等試劑的使用，直接采用特異性結(jié)合的原理吸附目標(biāo)樣品DNA，因而得率高于SDS法。此外，該研究同樣采用了Takara試劑盒法對不同樣品DNA提取得率進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Takara法的DNA得率稍高于Tiangen法，考慮到其提取的DNA純度較低，故確定采用Tiangen試劑盒法。

表2 不同方法提取的DNA得率Table 2 DNA yield extracted by different methods

2.2 不同方法提取對DNA純度的影響表3是3種DNA提取方法獲得的DNA的純度。A260/A280值表示樣品中蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的去除效果，數(shù)值高表明去除效果明顯，反之則表明樣品受雜質(zhì)污染較重。而A260/A230值表示樣品中糖、鹽等雜質(zhì)對樣品的污染程度，比值高表示糖、鹽較少，反之則表明樣品中雜質(zhì)含量較高[10]。從表3可以看出，對所有樣品來說，Takara試劑盒法提取所得的DNA純度較高，A260/A280平均值為1.17，而其他2種方法A260/A280值均在1.80左右，表明Tiangen試劑盒法和SDS法提取的DNA純度優(yōu)于Takara試劑盒法；Tiangen試劑盒法和SDS法對14個肉松樣品DNA的提取效果同樣優(yōu)于Takara試劑盒法。之所以出現(xiàn)這種情況，可能與不同試劑盒對DNA的測定原理有關(guān)，后續(xù)選擇Tiangen試劑盒法和SDS法進(jìn)行得率測定。

表3 不同方法提取的鱈魚產(chǎn)品DNA純度Table 3 DNA purity of codfish product extracted by different methods

2.3 不同方法提取對DNA質(zhì)量的影響提取所得的DNA質(zhì)量高低對于能否實現(xiàn)準(zhǔn)確的樣品鑒定至關(guān)重要。因此，PCR擴增成功率是檢驗提取DNA質(zhì)量高低的重要標(biāo)準(zhǔn)。水產(chǎn)品加工過程中通常存在高溫處理，對DNA存在較強的破壞性[9-11]。該研究通過瓊脂糖凝膠電泳驗證了提取的DNA質(zhì)量。從圖1可以看出，SDS法和Tiangen試劑盒法均可得到較為明顯的電泳條帶，但SDS法有4條泳帶不太明顯，Tiangen試劑盒法則僅有2條泳帶不太明顯。由此可知，Tiangen試劑盒法提取的鱈魚肉松DNA的質(zhì)量較好。

圖1 SDS法(a)和Tiangen試劑盒法(b)所得樣品PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of samples obtained by SDS method(a)and Tiangen kit method(b)

2.4 熒光PCR定量檢測結(jié)果為更好地反映不同提取方法之間的PCR擴增效果，進(jìn)一步采用熒光定量PCR技術(shù)對擴增效果進(jìn)行研究。從表4可以看出，Tiangen試劑盒法的平均CT值為20.52，SDS法的CT平均值為20.50，兩者之間無顯著差異；而從擴增曲線(圖2)來看，2種方法的擴增效果均較好，Tiangen試劑盒法的熒光強度好于SDS法，這可能也是由于Tiangen試劑盒法對樣品DNA的結(jié)合方式?jīng)Q定。

2.5 市售產(chǎn)品驗證性鑒定在市場上隨機購買7種樣品(1種鱈魚、6種鱈魚肉松)，采用Tiangen試劑盒法進(jìn)行DNA提取，經(jīng)PCR擴增后對DNA進(jìn)行測序(由上海研卉生物科技有限公司完成)。所得DNA片段經(jīng)NCBI和GeneBank數(shù)據(jù)庫查詢，確認(rèn)1種鱈魚樣品屬藍(lán)鱈，6種鱈魚肉松中有3種樣品屬摻假產(chǎn)品(表5)。相關(guān)樣品經(jīng)送樣(由舟山市食品藥品檢驗檢測研究院)檢測后，確認(rèn)樣品與該研究鑒定結(jié)果相符，初步證實了該研究結(jié)果具備較高可靠性。

表4 2種方法提取樣品DNA的CT值Table 4 CT value of sample DNA extracted by two methods

圖2 SDS法(a)和Tiangen試劑盒法(b)所得鱈魚肉松樣品擴增曲線Fig.2 Amplification curve of codfish meat floss samples obtained by SDS method(a)and Tiangen kit method(b)

表5 7種市售鱈魚及肉松產(chǎn)品鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

鱈魚肉松深受市場和消費者歡迎，引發(fā)了不良商販采用價值較低的魚假冒鱈魚事件屢有發(fā)生。受加工條件影響，鱈魚制品中有效DNA提取是實現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定的關(guān)鍵。該研究以DNA完整度、得率、PCR有效擴增效果等為指標(biāo)比較了3種鱈魚肉松DNA的提取方法。結(jié)果表明，Tiangen試劑盒法總體效果優(yōu)于SDS法和Takara試劑盒法，能夠?qū)κ惺蹣悠肥欠駷轺L魚種屬實現(xiàn)準(zhǔn)確有效鑒定。