張麗蓉，董志，楊月蕊，任智先，閆鴻麗，劉晨，王文蘋,3*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004；3.云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

甘草酸(glycyrrhizin，GL，見圖1a)是我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥甘草的代表性有效成分之一。其具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、肝保護(hù)、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和穩(wěn)定細(xì)胞膜等多種藥理活性，臨床常用于治療支氣管炎、艾滋病及肝炎、肝硬化等疾病[1]。GL現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，可作為甜味劑[2]、發(fā)泡劑[2]、乳化劑[3]、穩(wěn)定劑[4-5]和增溶劑[6-8]；用作護(hù)膚品添加劑可增白并減輕曬后皮膚炎癥[9]；生物醫(yī)藥領(lǐng)域中亦常利用GL對(duì)納米粒進(jìn)行表面修飾，以增強(qiáng)制劑靶向遞藥性能[10-13]。

如圖1所示，GL屬于三萜皂苷，由一分子甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)和兩分子葡萄糖醛酸組成，具有兩親性，為天然表面活性劑。更為有趣的是，GL及其鹽類、活性代謝產(chǎn)物GA均能在一定條件下自發(fā)形成凝膠，亦為極少數(shù)的天然小分子凝膠劑。其中GL水溶液在極低濃度(0.3%，W/W)下即能形成透明水凝膠，其微觀形態(tài)呈寬2.5 nm、長(zhǎng)數(shù)十微米的右旋扭曲狀長(zhǎng)纖維[14]。

鑒于天然小分子凝膠劑優(yōu)良的生物活性和生物相容性，相關(guān)研究不斷深入，GL類凝膠的新用途亦在持續(xù)開發(fā)之中。因此本文概述了近年來GL凝膠的組裝機(jī)制及其相關(guān)應(yīng)用研究進(jìn)展，為今后研發(fā)相關(guān)新材料和相應(yīng)新產(chǎn)品提供參考。

b.0.8wt%GL膠束TEM圖[26]；c.0.1 wt%GL纖維AFM圖[14，17]；d.2 wt%GL水凝膠AFM圖[14]；e.4wt%GL水凝膠外觀圖[15]圖1 甘草酸分子自組裝形成納米膠束、納米纖維及凝膠的示意圖

1 甘草酸自組裝的分子機(jī)制

如圖1所示，GL在水溶液中能發(fā)生分子自組裝形成膠束(1a)或納米纖維(1b)，后者進(jìn)一步纏繞交織并形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)(1c、1d)。通常超分子自組裝是基于分子間的一種或多種非共價(jià)鍵相互作用，現(xiàn)已證實(shí)GL結(jié)構(gòu)中的三萜骨架、羧基、葡萄糖醛酸是通過氫鍵、疏水及π-π堆積等相互作用參與自組裝過程，其中羧基對(duì)于氫鍵形成至關(guān)重要。通過核磁共振波譜(NMR)技術(shù)監(jiān)測(cè)GL纖維形成過程中質(zhì)子的化學(xué)位移，發(fā)現(xiàn)三萜片段未解離的COOH基團(tuán)是膠束形成的關(guān)鍵，而葡萄糖醛酸片段未解離COOH基團(tuán)的氫鍵作用則是凝膠三維網(wǎng)絡(luò)形成的主要驅(qū)動(dòng)力[16]。此外，不同報(bào)道均認(rèn)為疏水作用和π-π堆積共同促進(jìn)了GL納米纖維的成型。利用粉末X射線衍射(XRD)從晶體學(xué)角度進(jìn)行分析，顯示GL纖維呈橫向排列，疏水的三萜骨架以頭對(duì)頭的方式傾斜，使得親水的葡萄糖醛基排列在外，三萜骨架在內(nèi)，通過疏水作用和π-π堆積自組裝形成纖維[14]。Gao等[17]利用變溫圓二色譜、變溫紫外吸收光譜(UV-Vis)、XRD從分子熱力學(xué)和晶體學(xué)角度發(fā)現(xiàn)三萜骨架的組裝路徑遵循成核-伸長(zhǎng)模型(nucleation-elongation model)，卷曲形成有序的P型螺旋結(jié)構(gòu)(見圖1c)，即單個(gè)分子通過疏水作用將疏水三萜骨架隔離在內(nèi)部，親水基團(tuán)在外部，聚集成原子核，在延伸過程中通過π-π堆積作用堆疊形成納米帶。

2 影響甘草酸自組裝過程的主要因素

超分子自組裝過程中，由于分子間相互作用力較弱，易受pH、溫度(T)、濃度、溶劑等多重因素的影響，導(dǎo)致聚集體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生相應(yīng)變化。GL分子自組裝過程中存在類似現(xiàn)象，因此其凝膠過程可逆、具有一定的環(huán)境響應(yīng)性。一般而言，隨著濃度(C)升高GL形成納米纖維及凝膠，黏度(η)也隨之增加。

此外，GL組裝體的形態(tài)隨溶劑pH變化而改變， pH<7時(shí)先形成棒狀膠束，進(jìn)而形成凝膠；pH>7時(shí)，則以單體形式存在，無法形成凝膠。其原因在于GL的羧酸基團(tuán)具有pH響應(yīng)性，氫離子隨著pH值增加而解離，導(dǎo)致親水性增加，從而抑制了凝膠形成[16,18-19,20]。

GL溶液在不同溫度條件下可發(fā)生反復(fù)的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變，冷卻時(shí)形成凝膠， 55～60 ℃時(shí)則轉(zhuǎn)為溶膠態(tài)[16]。所得水凝膠的黏度隨GL濃度增大或溫度降低而升高[18]，此時(shí)完成凝膠化過程所需的時(shí)間亦逐漸減短[21]。

GL類成分在不同溶劑體系中的自組裝行為差異顯著。GA在掃描電子顯微鏡(scanning electron micro-scope，SEM)下可觀察到納米到微米級(jí)的球形和花狀纖維的自組裝體[22]。甘草酸二乙酯在甘油-水(85∶15，V/V)體系中自組裝形成長(zhǎng)119 nm、寬65 nm的橢圓形球體[23]。GL在不同乙醇-水體系中的最小膠束濃度(critical micelle concentration,CMC)，發(fā)現(xiàn)隨著乙醇含量的增加、CMC逐漸降低，從1.2 mmol·L-1(100%水)降至0.06 mmol·L-1(55%乙醇)[24]。在50 mg·mL-1的GL溶液中，當(dāng)有機(jī)相比例達(dá)到9.1%及以上時(shí)無法形成凝膠[21]。Fang等[25]將偶氮苯和GA合成三嵌段共聚物(GAG)，其最小凝膠濃度(minimum gel concentration，MGC)隨著甲醇含量增加從13.9 mg·mL-1增長(zhǎng)至28.2 mg·mL-1，且僅在甲醇和水體積比3∶7～5∶5的范圍內(nèi)形成凝膠。

3 甘草酸水凝膠的應(yīng)用研究概況

3.1 作為緩控釋載體材料 GL獨(dú)特的自組裝行為賦予其多功能載體的潛力。表1總結(jié)了近年來以GL作為載體材料的研究報(bào)道。

由表1可知，以GL作為載體時(shí)體系的載藥量(drug loading，DL)和包封率(encapsulation efficiency，EE)均較高，且具有明顯的緩釋特性。當(dāng)通過膠束或凝膠方式包載藥物時(shí)，載藥機(jī)制表現(xiàn)為增溶、物理包裹或二者兼具，一般以物理包裹為主[18]。膠束中藥物的釋放速率通常較凝膠更為緩慢，可能是由于凝膠中的藥物主要以擴(kuò)散方式釋放，而膠束解聚后方能迅速釋放藥物。由于GL帶負(fù)電荷，其水凝膠還可通過靜電作用選擇性吸附陽離子、并通過離子交換釋藥。此外GL還能提高難溶性藥物在水中的溶解度[18]，且隨著GL濃度增加、改善愈加顯著。因此， GL水凝膠目前主要用于裝載水難溶性和離子型藥物。

3.2 制備乳液凝膠 GL作為典型的兩親性分子，能顯著降低油-水界面張力、促使乳滴形成；同時(shí)GL的特性使其在乳滴表面多層吸附，形成纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、黏度顯著增加，可進(jìn)一步提高乳滴界面的穩(wěn)定性[15]。因此，GL用于制備乳液凝膠兼具乳化劑和穩(wěn)定劑功能。表2歸納了GL在乳液凝膠中的應(yīng)用情況。

表1 甘草酸水凝膠作為緩控釋載體材料的相關(guān)研究

表2 甘草酸在乳液凝膠中的相關(guān)研究

由表2可知，GL在較低濃度范圍內(nèi)(1%～4%)即能與食用油或工業(yè)油形成乳液凝膠，且油相容納比高(30%～80%)，顯示出優(yōu)良的乳化和穩(wěn)定作用。隨著GL濃度提高，網(wǎng)絡(luò)孔徑減小、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的油滴粒徑隨之減小[15]。

當(dāng)固定體系中油相和GL濃度時(shí)，GL凝膠對(duì)不同油相的界面張力降低程度存在差異，對(duì)極性較大的油相的親和力更高[31]。當(dāng)與其他乳化劑聯(lián)用時(shí)，二者協(xié)同發(fā)揮減低界面張力功能，乳化能力優(yōu)于單一乳化劑。此外，GL與其他乳化劑配合制成W1/O/W2復(fù)乳凝膠，能用于包載親水性、環(huán)境敏感型藥物[29]。

3.3 研發(fā)智能水凝膠 智能水凝膠含水量高、對(duì)外界環(huán)境刺激敏感、生物相容性優(yōu)良，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛認(rèn)同，可作為組織工程材料、傷口敷料、腫瘤化療藥物載體等。天然小分子凝膠劑是制備智能水凝膠的理想材料，GL作為功能性活性凝膠因子也引起了廣泛關(guān)注。

Zhao等[32]利用1.5 mmol·L-1GL制備具有抗菌性能的可注射、可模塑的低分子水凝膠，在低(1%)-高(30%)-低的應(yīng)變掃描循環(huán)下，體系呈現(xiàn)出凝膠-溶膠-凝膠的可逆轉(zhuǎn)變，具有良好的觸變性。該凝膠能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，最小抑菌濃度為0.13wt%。經(jīng)GL凝膠處理后的細(xì)胞活性未改變，且濃度高達(dá)0.17wt%時(shí)未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，顯示出較低的細(xì)胞毒性和良好的血液相容性，可用于組織工程細(xì)胞培養(yǎng)。

Fang等[25]通過酰胺鍵連接偶氮苯基團(tuán)和兩個(gè)GA分子設(shè)計(jì)合成了A-B-A型三嵌段共聚物(GAG)。偶氮苯基團(tuán)參與順/反異構(gòu)化，反式-GAG在DMSO/H2O(2∶8，V/V)中形成了超分子凝膠，具有光響應(yīng)性，即在紫外光和可見光的交替照射下發(fā)生可逆的順-反-GAG異構(gòu)化，導(dǎo)致凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變。該反式-GAG凝膠顯示出優(yōu)異的自修復(fù)特性，可作為注射材料。

Wan等[33]以4 wt%甘草酸單銨鹽和20 wt%葵花籽油在80 ℃下均質(zhì)并充氣，通過加入炭黑粒子制備凝膠化乳液泡沫。由于炭黑粒子可吸收紫外光并將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，在紫外照射下體系溫度升高，當(dāng)超過GL的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化溫度(55～60 ℃)時(shí)，GL凝膠網(wǎng)絡(luò)融化致使泡沫失穩(wěn)，從而顯示出獨(dú)特的光/熱雙重響應(yīng)性能。

3.4 作為催化劑載體 以天然凝膠為載體，既可穩(wěn)定金屬催化劑的活性，又能為金屬配體提供手性、還原性等，為研發(fā)新型天然分子凝膠基底的金屬催化劑提供了新思路。

孫儀萌[34]以GL自組裝的手性螺旋納米結(jié)構(gòu)水凝膠為骨架，無手性金屬為配體構(gòu)建了超分子手性催化劑。GL可以將手性傳遞給無手性配體，進(jìn)而影響對(duì)映體的對(duì)映選擇性，最高獲得61%的對(duì)映體過量值，催化反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)99%。證實(shí)GL水凝膠適宜作為不對(duì)稱催化Diels-Alder反應(yīng)支架。

Saha等[14]在GL水凝膠中引入氧化石墨烯和氯金酸，利用GL中二糖葡萄糖醛酸的還原性將氯金酸原位還原為金納米粒，開發(fā)了一種三重催化劑體系。用于將對(duì)硝基苯酚多相催化還原為對(duì)氨基苯酚，催化效率提高了2.5倍。

Hao等[35]以甘草酸單胺鹽水凝膠作為輔助材料，與聚丙烯酰胺(PAAm)合成具有高機(jī)械性能的雙網(wǎng)絡(luò)(double network，DN)水凝膠GL/PAAm DN，具備快速自恢復(fù)和優(yōu)良的抗疲勞性能。其利用GL中二糖醛酸基團(tuán)的還原性，在不添加外部還原劑的情況下使Au(III)離子自發(fā)地原位還原，可作為金屬納米粒的支持劑用于4-硝基苯酚還原反應(yīng)。通過冰模板技術(shù)(ice-templating technique)重鑄凝膠增加孔隙率后，將4-硝基苯酚轉(zhuǎn)化率提高至100%；且流動(dòng)催化反應(yīng)連續(xù)重復(fù)20個(gè)循環(huán)后催化活性無明顯下降，轉(zhuǎn)化率維持在99%以上，顯示出優(yōu)異的催化效率。

3.5 其他應(yīng)用 GL作為修飾劑和穩(wěn)定劑，能增強(qiáng)海藻酸鹽與Ca2+生成的可生物降解原位注射水凝膠的靶向性[36]；基于該凝膠體系培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞能長(zhǎng)時(shí)間保持細(xì)胞活性和增殖， P450 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，提示該凝膠在肝組織工程3D細(xì)胞培養(yǎng)方面的潛在應(yīng)用前景[36]。鑒于腫瘤細(xì)胞自身特性，以其研究增殖性或安全性說服力尚顯不足，有必要選用其他細(xì)胞系進(jìn)一步驗(yàn)證。

天然小分子凝膠劑還是制備超分子聚合物的理想材料，可基于主客體作用構(gòu)建自修復(fù)水凝膠。許格[37]在GA兩端修飾不飽和雙鍵作為客體分子，以β-環(huán)糊精和環(huán)氧氯丙烷聚合制備親水性聚合物作為主體骨架，利用紫外光固化技術(shù)制備了超分子聚合物水凝膠，在pH4～14的溶液環(huán)境中均穩(wěn)定并在振蕩和加熱后會(huì)發(fā)生凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變。Li等[38]將GL作為客體、β-環(huán)糊精為主體，分別與N-N’-二甲基丙烯酰胺共聚后形成自愈合水凝膠，與3T3L1細(xì)胞共孵育24 h后細(xì)胞仍保持較好的形態(tài)和活性，生物相容性良好，有望開發(fā)成為性能優(yōu)異的組織工程和傷口敷料。

4 結(jié)語與展望

雖然GL水凝膠的研究已取得一定的進(jìn)展，但目前對(duì)GL凝膠的性能開發(fā)尚顯不足。未來研究預(yù)期可從以下幾方面展開探索：①深入研究GL自組裝機(jī)制，明確其分子自組裝路徑與產(chǎn)物形態(tài)性能之間的關(guān)系，掌握關(guān)鍵調(diào)控因子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組裝過程的精確控制；②目前GL凝膠的應(yīng)用領(lǐng)域局限、方式較為單一，如何發(fā)揮其作為天然產(chǎn)物兼具的優(yōu)良生物相容性和多種活性，尤其是擴(kuò)大在生物組織工程、靶向制劑等生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，仍值得進(jìn)一步探索；③通過引入功能性基團(tuán)使GL凝膠具有刺激響應(yīng)性研發(fā)智能藥物載體，或與其他智能凝膠結(jié)合獲得具有更高性能的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)凝膠，擴(kuò)大其適用范圍；④GL作為天然小分子凝膠具有典型的“藥輔合一”特性，但當(dāng)前研究更側(cè)重于載體、基質(zhì)、添加劑等作為“輔“的作用，而其“藥”的功能則在研究中關(guān)注不足，今后的研究可基于GL自身藥理作用開發(fā)功能化新劑型或新技術(shù)。

綜上，GL水凝膠作為一種新型的天然小分子功能材料，在藥物載體、乳液凝膠和智能水凝膠等多方面潛在極大的應(yīng)用價(jià)值。期待不同領(lǐng)域研究者給予關(guān)注，持續(xù)開拓GL水凝膠的新功能、研發(fā)新產(chǎn)品，共同推進(jìn)天然小分子水凝膠的快速發(fā)展。